富血小板纖維蛋白對牽引成骨區BMP-6表達的影響

付穎，董慶文，王稚英

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富血小板纖維蛋白對牽引成骨區BMP-6表達的影響

付穎，董慶文，王稚英

摘要：目的探討應用富血小板纖維蛋白（PRF）對牽引成骨區骨形態發生蛋白-6（BMP-6）表達的影響。方法25只大耳白兔隨機分5組，分別行雙側下頜骨皮質骨切開術，一側下頜骨牽引間隙放置PRF膜，作為實驗組，對側作為對照組，分別于穩定期第1、3、7、14、28天處死1組動物，切取牽引間隙處骨痂行HE染色和BMP-6免疫組織化學染色，細胞圖像分析儀測量牽引間隙處骨痂BMP-6表達情況。結果下頜牽引延長后牽引間隙均有新骨形成，免疫組化染色顯示BMP-6主要定位于成骨細胞的胞漿中。實驗組在穩定期第1、3、7天BMP-6表達的陽性細胞率和陽性面積百分比均高于對照組（P＜0.05），穩定期第14、28天BMP-6表達的陽性細胞率和陽性面積百分比均與對照組比較差異無統計學意義。結論PRF能促進兔下頜骨牽引成骨區新骨的生成，BMP-6可能在牽引成骨過程的早期調控組織細胞應力信號傳遞，發揮成骨作用。

關鍵詞：骨形態發生蛋白質類；骨生成,牽張；兔；富血小板纖維蛋白；骨形態發生蛋白-6

作者單位：遼寧醫學院附屬第二醫院口腔內科（郵編121000）

骨組織的修復與周圍力學環境關系密切，牽張成骨技術（distraction osteogenesis,DO）正是利用骨的這一特性，給予一定牽引力，通過復雜的機械-細胞信號傳導機制激發細胞增殖，促進新骨生成。在骨修復過程中骨形態發生蛋白-6（bone morphogenetic protein-6,BMP-6）作為一種信使，參與了細胞間的信號傳導。在DO較長的療程中存在許多并發癥如傷口感染，骨不連、松脫等，因此，縮短療程、減少并發癥的相關研究越來越受到重視，其中，局部應用富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）促進牽引區新骨生成的研究已成為熱點。PRF是一種自體靜脈血經離心后的血小板纖維蛋白凝塊，富含多種生長因子，這些因子可以有效地調控與骨組織修復相關的細胞增殖、分化以及凋亡[1]。因此推測PRF可能促進DO牽引區新骨的生成，有利于縮短療程、減少并發癥。本研究擬通過對兔下頜骨牽引過程中局部給予PRF膜后，檢測牽引區的關鍵骨生長因子BMP-6表達的變化規律，探討PRF膜對下頜骨DO牽引區新骨生成的影響機制，從而為縮短下頜骨DO療程、減少并發癥的臨床治療提供線索與依據。

1　材料與方法

1.1材料日本大耳白兔25只，體質量2.0～2.5 kg，普通級[（生產許可證號SCXK（遼）2014-0004）]，購自遼寧醫學院實驗動物中心。北京大學王興教授設計的外置式下頜骨純鈦牽引器由西安中邦公司制作。牽引桿每旋轉1周，牽引器兩固定臂間增大0.4 mm間隙。離心機、齒科低速手機、操作臺、器械及麻醉藥均由遼寧醫學院科學實驗中心提供。BMP-6的SABC免疫組化試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2方法

1.2.1 PRF膜的制備在無菌條件下，每只大耳白兔抽取靜脈血5 mL，經2次離心，2 400 r/min，10 min，3 600 r/min，15 min，從離心后的采血管中取出纖維蛋白凝膠，用紗布將PRF凝膠中的液體擠出，使其形成PRF膜[2]，放入-70℃冰箱標號備用。

1.2.2實驗動物飼養和分組大耳白兔在安靜、溫暖、避強光的環境中適應性圈養1周，每天均給予相同進食量（200 g）和足量飲用水，并保持環境清潔與衛生。采用抽簽法將動物隨機均分為5組，每組各5只。建立雙側下頜骨牽引成骨動物模型，一側牽引間隙處放置PRF膜，作為實驗組，對側為對照組，分別于牽引穩定期第1、3、7、14、28天處死1組動物取材。本研究對動物的處理方法符合動物倫理學要求。

1.2.3下頜骨牽引成骨動物模型的建立實驗動物按2.5 mg/kg經耳緣靜脈注射10%平衡液全身麻醉后，在每只動物一側下頜骨磨牙前部行骨切開術，安放牽引器，并于間隙處放置PRF膜，另一側下頜骨磨牙前部行骨切開術并安放牽引器作為對照組，骨膜復位縫合，分層縫合肌肉、皮膚，牽引器加力桿端暴露于口外，間歇期5 d后，用牽引器按0.8 mm/d，2次/d，0.4 mm/次，每次間隔12 h的速率緩慢延長下頜骨。連續牽引5 d，共延長下頜骨4 mm后進入牽引穩定期[3]。

1.2.4光鏡標本的制備與染色分別于穩定期第1、3、7、14、28天處死1組動物，將下頜骨修剪成以牽引區為中心的12 mm長組織塊，放入4%中性甲醛溶液中固定，4℃，24 h。0.5 mol/L EDTA脫鈣，乙醇梯度脫水，透明，包埋，切5 μm厚的切片，做蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡觀察。

1.2.5免疫組織化學法檢測與分析取上述石蠟標本制備5 μm防脫切片，采用SABC法進行免疫組化染色。切片常規脫蠟至水后，采用pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液微波修復抗原活性，滴加1∶100稀釋的一抗BMP-6抗體，4℃孵育過夜；滴加生物素化二抗，37℃水浴30 min；DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。陰性對照采用PBS替代一抗。光鏡下觀察，

BMP-6陽性表達部位定位于細胞胞漿。選擇牽引成骨穩定期第1、3、7、14、28天不同時期切片，采用CIAS-1000細胞圖像分析系統400倍視野觀察下頜牽引成骨區不同時期BMP-6的表達。在免疫組織染色切片的牽引區的中心處隨機讀取5個視野，測每野細胞數及陽性細胞數；在同批未復染的免疫組織染色切片的牽引區的中心處隨機讀取5個視野，測陽性面積百分比。

1.3統計學方法應用Excel軟件及SPSS 13.0統計分析軟件處理，計量數據以x ±s表示，采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

實驗動物全部存活到預定時間，傷口無感染，術后7 d內咀嚼功能稍有障礙，不影響健康和基本活動。牽引器固定穩定，周圍無嚴重并發感染。取材時發現實驗動物中切牙明顯偏斜。

2.1 HE染色結果穩定期第1天，對照組和實驗組牽引區均見無序排列的纖維結締組織。穩定期第3天，對照組與實驗組牽引區見纖維結締組織沿牽引方向呈條束樣，實驗組更密集、粗大，見圖1。穩定期第7天，對照組牽引區見沿牽引力方向的密集膠原纖維束；實驗組在密集的膠原纖維內可見部分骨基質形成和礦化，近截骨線處見少量不規則的骨小梁。穩定期第14天，對照組牽引區有少量幼稚的骨小梁；實驗組骨小梁數量增多。穩定期第28天，對照組牽引區骨小梁比較纖細、幼稚，近斷端處較成熟，與牽引方向平行排列；實驗組牽引區可見大量沿牽張力方向的骨小梁，表面規則地排列大量增生活躍的成骨細胞，見圖2。

Fig.1 The arrangementof fibrous connective tissue onthe thirddayafter the end of distraction（HE，×100）圖1穩定期第3天纖維結締組織排列情況（HE，×100）

Fig.2 The formation of bone trabeculae on the twenty-eighth day after the end of distraction（HE，×100）圖2穩定期第28天骨小梁的形成情況（HE，×100）

2.2免疫組織化學結果穩定期第1天，牽引區新骨BMP-6陽性表達，主要集中在間充質細胞的胞漿中，見圖3。穩定期第3天，牽引區新骨BMP-6在大量增殖的間充質細胞、成纖維細胞和成骨細胞中呈強陽性染色，見圖4。穩定期第7天，牽引骨痂處的骨髓襯里細胞BMP-6表達仍呈強陽性。穩定期第14天，牽引區新骨BMP-6在新生骨小梁表面的成骨細胞胞漿內呈陽性染色。穩定期第28天，牽引骨痂處的骨髓襯里細胞BMP-6表達呈弱陽性，見圖5。

Fig.3 BMP-6 was localized in cytoplasm of large proliferation of osteoblast-like cells of the control group and experiment group on the 1st day after the end of distraction（DAB，×400）圖3穩定期第1天對照組與實驗組BMP-6在間充質細胞的胞漿中呈陽性染色（DAB，×400）

Fig.4 BMP-6 was localized in cytoplasm of large proliferation of osteoblast-like cells of the control group and experiment group on the third day after the end of distraction（DAB，×400）圖4穩定期第3天對照組與實驗組BMP-6在增殖的成骨細胞的胞漿中呈強陽性染色（DAB，×400）

Fig.5 BMP-6 was localized in cytoplasm of osteoblast cells of naive trabecular bone of the control group and experiment group on the twentyeighth day after the end of distraction（DAB，×400）圖5穩定期第28天對照組和實驗組BMP-6在骨小梁表面的成骨細胞可見陽性著色（DAB，×400）

穩定期第1、3、7天實驗組BMP-6表達的陽性細胞率和陽性面積百分比均高于對照組（P＜0.05 或P＜0.01)；穩定期第14、28天2組BMP-6表達的陽性細胞率和陽性面積百分比差異無統計學意義，見表1、2。

Tab. 1 Comparation of BMP-6-positive cell rates in distracted calluses between two groups表1穩定期2組BMP-6表達的陽性細胞率比較（n=5,%, x ±s）

Tab. 2 Comparation of BMP-6-positive area percentage in distracted calluses between two groups表2穩定期2組BMP-6表達的陽性面積百分比比較（n=5,%, x ±s）

3　討論

DO通過緩慢且穩定地牽引骨組織，促進骨愈合，無需植骨，手術簡單。但治療周期較長，有時出現骨不連、纖維性骨愈合并發癥。因此，尋找一種既安全又有良好成骨能力的材料，對于促進骨的愈合至關重要，PRF因富含各種生長因子和纖維支架能加速成骨而備受關注。由于其取于自體血，制備過程簡單，不需要添加抗凝劑及凝血酶，避免了交叉感染。Pripatnanont等[4]通過新西蘭白兔動物實驗，對比應用PRF膜的骨形成效果，發現放置PRF膜組成功地促進了骨缺損的修復，效果明顯。Gassling等[5]首次將PRF作為支架材料和膠原膜比較，發現人來源的成骨細胞在PRF的作用下可以更好地增殖、遷移和分化。Hauser等[6]在臨床拔除后牙的牙槽窩中應用PRF膜對比研究發現，應用PRF膜后能明顯改善拔牙牙槽窩內的微體系結構，提高骨形成的質量，加快拔牙窩骨的愈合速度。

以上許多研究結果都表明PRF能明顯提高骨的愈合和修復，但PRF如何通過影響細胞因子來加速骨痂的愈合，它與在成骨過程中起著重要作用的骨形成蛋白（BMPs）有何關系仍不清楚。具有成骨作用的細胞因子很多，比較重要而且研究較多的是BMP-2、BMP-4和BMP-6，而BMP-6是一種具有巨大潛力的成骨促進因子，骨組織的修復需要成骨細胞和破骨細胞的共同作用，BMP-6主要促進成骨細胞的分化。在裸鼠的實驗中BMP-6誘導骨形成能力大于BMP-2和BMP-4，大量實驗研究表明BMP-6能促進骨髓間充質干細胞（BMSCs）分化為成骨細胞、成軟骨細胞等[7]。Mizrahi等[8]用BMP-2、BMP-6誘導小鼠骨髓基質細胞分化成骨，比較兩者的成骨速度和數量，發現BMP-6明顯優于BMP-2。Li等[9]和Fischerauer等[10]研究骨折的成骨過程中發現BMP-6在骨折的骨痂愈合中有重要作用。Lammens 等[11]通過動物實驗證實BMP-6能明顯促進牽引成骨區骨痂斷端愈合，且在早期的牽引成骨過程中發揮重要作用。本實驗中，穩定期第1、3、7天，兔下頜牽引成骨區覆蓋PRF膜后，形成了合適的三維纖維蛋白網狀支架，并提供大量自體細胞因子，牽引成骨區局部較高濃度BMP-6的釋放與表達，成骨細胞增殖分化，從而加快牽引區新生骨痂的愈合，通過對牽引成骨區免疫組化分析發現，應用PRF組在穩定期第1、3、7天BMP-6在增殖活躍的間充質細胞和成骨細胞呈陽性表達也證實了這一點，而穩定期第14、28天，牽引成骨區組織細胞不再以增殖為主，主要表現為骨的改建，而在這一時期，HE染色發現骨小梁周圍出現細胞核較大、胞漿少的大量成骨細胞，成行或復層排列，與李紹蘭[12]的研究一致。免疫組化分析發現BMP-6僅有微弱表達，以上實驗結果說明在DO早期，PRF能通過促進牽引區局部成骨細胞表達BMP-6，成骨作用明顯，在骨改建的后期作用逐漸減弱。

本實驗通過兔下頜DO動物模型研究，結果顯示局部應用PRF膜能促進牽引間隙局部生長因子BMP-6的高表達，在局部發揮作用，刺激牽引區骨基質合成和誘導間充質細胞、成骨細胞、骨細胞的增殖分化等活性功能，從而更有效地促進牽引區新骨的生成和修復，加快鈣化，為PRF膜能加快牽引區骨痂的愈合、縮短DO的治療時間奠定了理論基礎，為骨科疾病提供新的、比較簡單、安全和廉價的治療方法。

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（2015-07-09收稿2015-09-18修回）

（本文編輯李國琪）

Effects of platelet-rich fibrin on expression of BMP-6 during mandibular distraction osteogenesis

FU Ying, DONG Qingwen, WANG Zhiying
Department of Oral Medicine, Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, China

Abstract:Objective To investigate the effects of platelet-rich fibrin (PRF) on BMP-6 expression during mandibular distraction osteogenesis. Methods Twenty-five mature rabbits were randomly divided into five groups. Mandibular osteoto?mies were performed corticectomy in bilateral mandibles of rabbits. PRF was implanted in the one side of mandibles, which was used as experimental group. Another side of madibular was used as control group. Rabbits were sacrificed and the dis?tracted calluses were harvested and processed for HE and BMP-6 immunohistochemistry staining at 1, 3, 7, 14 and 28 days after the end of distraction, respectively. The expressions of BMP-6 in the distracted calluses were analyzed by cell digital imaging software. Results The regenerated bone was found in the distraction gap after mandibular lengthening. Expres?sions of BMP-6 were co-localized in cytoplasm of osteoblasts and newly embedded osteocytes. Compared with control group, the positive cell rate and positive area percentage of BMP-6 were significantly higher on the 1st, 3th and 7th day after the distraction in experimental group (P＜0.05). There were no significant differences in positive cell rate and positive area per?centage of BMP-6 at 14-day and 28-day after the distraction between experimental group and control group. Conclusion PRF can accelerate bone formation of mandibular distraction osteogenesis in rabbits. BMP-6 may play important role at the early stage of mandibular distraction.

Key words:bone morphogenetic proteins; osteogenesis, distraction; rabbits; platelet-rich fibrin; bone morphogenetic protein 6

中圖分類號：R782.2

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/20150028

基金項目：遼寧省自然科學基金項目（2015020352）；遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2013322）

作者簡介：付穎（1977），女，副教授，碩士，主要從事口腔醫學研究