線粒體超離子與血管緊張素Ⅱ介導腎間質細胞外基質纖維化的研究

王均玲, 余 晨

(同濟大學附屬同濟醫院腎臟科，上海 200065)

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·基礎研究·

線粒體超離子與血管緊張素Ⅱ介導腎間質細胞外基質纖維化的研究

王均玲, 余 晨

(同濟大學附屬同濟醫院腎臟科，上海 200065)

腎臟纖維化； 血管緊張素Ⅱ； 活性氧； 超氧離子； NADPH氧化酶抑制劑； 大鼠

腎臟纖維化指在各種致病因素作用下，間質細胞及細胞間質增多，基質蛋白合成增加而降解減少造成細胞外基質(extracellular matrix, ECM)大量堆積導致的腎小球硬化和腎小管間質纖維化[1]。腎臟纖維化的機制目前還不是很清楚，血管緊張素-Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是體內重要的血管活性物質之一，它參與調節細胞的增殖、凋亡以及纖維化進程[2]。以往對于AngⅡ-慢性腎臟疾病的氧化應激研究中，缺乏針對線粒體氧化應激的研究，尤其是AngⅡ 介導的線粒體氧化應激對腎臟纖維化的機制，本研究在大鼠腎臟成纖維細胞中探討氧化應激與腎臟纖維化之間的相關機制，并驗證超氧離子是否介導AngⅡ引起腎臟間質細胞外基質的合成。

1 材料與方法

NRK-49F細胞，由復旦大學生理與病理教研室贈送。

1.1 主要試劑和儀器

細胞培養液MEM (GIBCO)、FBS(GIBCO)、Apocycin(sigma2501950)，線粒體熒光探針Mito (invitrogen 1252221)， RNA抽提試劑盒(Invitrogen)，RT試劑ReverTra Ace?qPCR RT Kit(TOYOBO)，Realtime PCR反應試劑(TaKaRa)，Col1 抗體(Abcom34710)，Col3抗體(Abcom6310)，Fibronectin 抗體(F3648)二抗(抗IgG-Cy3 Jackson)，PCR引物由上海生工合成，RT試劑ReverTra Ace?qPCR RT Kit(TOYOBO)，Realtime PCR反應試劑(TaKaRa)，酶標儀，BioTek細胞流式儀(accun C6)，顯微鏡(Nikon)。

1.2 NRK-49F細胞線粒體超氧離子流式檢測

將細胞分別傳代于5個細胞瓶中，24h后進行分組： 空白組，AngⅡ組(AngⅡ溶度10-6)，apocynin組(apocynin溶度10-6),AngⅡ+apocynin組(溶度疊加)，每組設平行3組，藥物干預24h后抽去含有藥物的培養液，用可與線粒體特異性的超氧化物反應的熒光試劑Mito invitrogen 1252221 5μm 的工作溶度覆蓋細胞，37℃，10min,消化液消化細胞，血清終止消化并收集細胞，1500轉/min，離心半徑10cm，離心5min，用0.01mol PBS懸浮細胞，上流式儀檢測并設陰性對照組。

1.3 Mito熒光酶標檢測NRK-49F細胞內線粒體含量

將細胞消化，離心后以每孔5.3×103的細胞數種植于96孔中，24h后進行分組： 空白組，AngⅡ組(AngⅡ溶度10-6)，apocynin組(apocynin溶度10-6),AngⅡ+apocynin組(溶度疊加)，每組設4復孔，藥物干預24h后抽去含有藥物的培養液用Mito (invitrogen 1252221)為5μm的工作溶度每孔加入50μl，37℃孵育10min，上酶標儀550波長檢測并讀取數據。

平均D值(平均吸光度)的計算：

復孔平均D值-空白平均D值 = 每組平均D值

1.4 Mito熒光顯示NRK-49F細胞內線粒體分布

細胞消化，離心后將細胞種植于24孔培養板中，24h后進行分組，藥物干預24h后抽去含有藥物的培養液，用Mito 5μm的工作溶度覆蓋細胞，37℃ 孵育10min，熒光顯微鏡(激發光： 590nm)下觀察每組細胞內線粒體分布。

1.5 RT-PCR法檢測

采用Trizol一步法抽提細胞RNA, 進行電泳與紫外分析檢測，反轉錄反應嚴格依照試劑盒說明進行。引物設計如下： RatGAPDH。正向5,AGTGCCAGCCTCGTCTCATAG,下游CGTTGAA-CTTGCCGTGGGTAG；rCollagenⅠAAGGGTCATC-GTGGCTTCTCT，GACCGTTGAGTCCATCTTTGC；rCollagenⅢTCCCAGAACATTACATACCACTGC，TCTCATGGCCTTGCGTGTT；rFN GCTATGGAGG-AAGCAGAGGTTT，ACCAATCTTGTAGGACTGA-CCCC。擴增條件： 94℃變性(30s),56℃退火(30s),72℃延伸(30次循環，繼續72℃延伸5min)，使用BIO-RAD(CFX-96)實時定量PCR儀器進行擴增，擴增完成后收集熒光定量數據進行分析，數據包括擴增曲線、工作曲線、融解曲線與相應Ct值等。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NRK-49F細胞

圖1 各組超氧離子吸光度比較圖Fig.1 Comparison of superoxides absorbance by enzyme-labelling in different groups注： AngⅡ組與對照組相比，細胞熒光增強；AngⅡ+APO較AngⅡ組組熒光強度降低(P<0.05)

2.2 NRK-49F細胞

圖2 流式細胞檢測熒光陽性細胞結果比較圖Fig.2 Comparison of fluorescence positive cells detected by flow cytometry in different groups注： AngⅡ組與對照組相比，陽性細胞數顯著增多，AngⅡ+APO較AngⅡ組陽性細胞數顯著降低(P<0.05)

2.3 NRK-49F細胞

培養24h，藥物干預24h后，Real-time PCR檢測Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN表達： Ang Ⅱ刺激組較對照組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN mRNA表達顯著增加；Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN mRNA表達有顯著降低(兩者均P<0.05，圖3a，圖3b,圖3c)。

4NRK-49F細胞培養24h后，藥物干預24h后，免疫熒光法檢測Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN表達： Ang Ⅱ刺激組較對照組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達顯著增加，Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達有顯著降低，兩者均(P<0.05，圖4a,4b,4c)。

圖3a 熒光定量PCR結果各組中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、FN基因的mRNA相對表達量P<0.05Fig.3a The relative expression of Collagen-ⅠmRNA in different groups注： AngⅡ組與對照組相比，Collagen-ⅠmRNA表達有顯著增多，AngⅡ+APO較AngⅡ組mRNA表達顯著降低(P<0.05)

圖3b Col-ⅢmRNA相對表達量Fig.3b The relative expression of Collagen-Ⅲ mRNA in different groups注： Ang Ⅱ 組與對照組相比，Collagen-Ⅲ mRNA表達有顯著增多，Ang Ⅱ+APO較Ang Ⅱ 組mRNA表達顯著降低(P<0.05)

圖4a 免疫熒光檢測Collagen-Ⅰ蛋白Fig.4a Immunofluorescence staining of Collagen-Ⅰ protein注： Ang Ⅱ刺激組較對照組，Collagen-Ⅰ表達顯著增加，Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組Collagen-Ⅰ蛋白表達有顯著降低(P<0.05)

圖4c 免疫熒光檢測FN蛋白Fig.4c Immunofluorescence staining of FN protein注： AngⅡ刺激組較對照組FN表達顯著增加，Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組FN蛋白表達有顯著降低(P<0.05)

5NRK-49F細胞培養24h，藥物干預24h后，western blot 檢測Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN蛋白表達。Ang Ⅱ刺激組較對照組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達顯著增加；Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達有顯著降低(兩者均P<0.05，圖5)。

2.4 流式細胞檢測線粒體超氧離子結果

Ang Ⅱ刺激組較對照組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達顯著增加；Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達有顯著降低(兩者均P<0.05，圖5)。

圖5 各組的WB蛋白水平圖Fig.5 The collagen Ⅰ, Ⅲ and fibronectin levels in different groups

3 討 論

[1] Hui YL. Diverse roles of TGF-β/smads in renal fibrosis and inflammation[J]. Int J Biol Sci, 2011,7(7)： 1056-1067.

[2] 余瑩，李長明，周沛然,等.坎地沙坦在炎癥過程中抑制氧化應激反應機制的研究[J].同濟大學學報： 醫學版，2010，31(3)： 59-63.

[3] Doug YL, Fabien W, Assaad A,et al.Nox4 Nadph oxidase mediates peroxynitrite-dependent uncoupling of endothelial Nitric-oxide synthase and fibronectin expression in response to angiotensin Ⅱ： ROLE of mitochondrial reactive oxygen species[J].J Biol Chem, 2013，288(40)： 28668-28686.

[4] Sovari AA, Morita N. Karagueuzian HS, Apocynin： a potent NADPH oxidase inhibitor for the management of atrial fibrillation[J]. Redox Rep, 2008,13(6)： 242-245.

[5] Garrido AM. NADPH oxidases and angiotensin Ⅱ receptor signaling[J].Mol Cell Endocrinol, 2009,302(2)： 148-158.

[6] Piacenza L, Irigoín F, Alvarez MN, et al. Mitochondrial superoxide radicals mediate programmed cell death in Trypanosoma cruzi： cytoprotective action of mitochondrial iron superoxide dismutase overexpression[J]. Biochem J, 2007,403(2)： 323-334.

Mitochondria superoxides mediates angiontension Ⅱ-induced synthesis of extracelluar matrix

WANGJun-ling，YUChen

(Dept. of Nephrology, Tongji Hospital, Tongji University， Shanghai 200065, China)

renal fibrosis； angiotensin Ⅱ； reactive oxygen； superoxides； NADPH oxidase inhibitors； rat

10.16118/j.1008-0392.2016.03.003

2015-09-24

國家自然科學基金(NSFC 81370790)

王均玲(1982—)，女，住院醫師，碩士研究生.E-mail: 852775856@qq.com

余 晨.E-mail: yuchen@#edu.cn

R 551

A

1008-0392(2016)03-0016-05