P38MAPK抑制劑SB203580對高糖誘導HK-2細胞轉分化的影響

賈林，林智峰，馬莉，唐玉玲，楊銳，楊曉萍

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P38MAPK抑制劑SB203580對高糖誘導HK-2細胞轉分化的影響

賈林，林智峰，馬莉，唐玉玲，楊銳，楊曉萍

摘要：目的探討不同濃度P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）抑制劑SB203580在高糖誘導腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化（TEMT）過程中的機制及其較佳作用濃度。方法體外培養人近端腎小管上皮細胞（HK-2）并分為對照組（5.5 mmol/L GS）、DMSO組（5.5 mmol/L GS+30 μmol/L SB203580等體積的DMSO）、高糖組（30 mmol/L GS），以及30 mmol/L GS+5、10、20、30 μmol/LSB203580處理的S5、S10、S20及S30組，干預48 h。四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞增殖情況，計算半數抑制濃度（IC50）；選取對照組、高糖組、S30組，Western blot法檢測P38MAPK、P-P38MAPK及α-平滑肌肌動蛋白（SMA）的表達、免疫熒光法檢測α-SMA的表達。結果 （1）與對照組相比，DMSO對HK-2細胞增殖無顯著抑制作用（P＞0.05）；高糖組、S5組HK-2細胞增殖增多（P＜0.05）；S20、S30 組HK-2細胞增殖減少（P＜0.05）。與高糖組相比，S5、S10、S20、S30組細胞增殖均受到抑制（P＜0.05）。（2）與對照組相比，高糖組、S30組P-P38MAPK表達量增高（P＜0.05）。與高糖組相比，S30組P-P38MAPK的表達量降低（P＜0.05）。3組P38MAPK表達量無顯著差異（P＞0.05）。（3）與對照組相比，高糖組、S30組α-SMA表達量增高（P＜0.05）。與高糖組相比，S30組α-SMA表達量降低（P＜0.05）。結論30 mmol/L GS可以誘導HK-2細胞TEMT；30 μmol/L SB203580是抑制HK-2細胞TEMT的較佳抑制濃度，SB203580可能通過下調P-P38MAPK表達，從而抑制HK-2細胞增殖及胞漿中α-SMA的表達，延緩TEMT進程。

關鍵詞：糖尿病腎??；腎小管；上皮細胞；上皮間質轉分化；P38絲裂原活化蛋白激酶；SB203580

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病引發的微血管病變之一，與氧化應激、細胞因子表達異常等多種因素有關，可表現為炎癥介質浸潤、腎小球硬化和腎間質纖維化［1-2］。其中，腎間質纖維化的主要病理特點是成纖維細胞及肌成纖維細胞（myofibroblast，MyoF）異常增生，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）分泌過多，超過自身清除能力，導致ECM在腎間質內過度沉積。α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是MyoF出現及腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化（TEMT）開始的標志。新生MyoF 30%以上來源于TEMT［3］。因此，TEMT在DN病程發展中可能起著重要的作用。研究發現，P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信號通路活化可加速TEMT的進程［4］。SB203580是P38MAPK的抑制劑，已廣泛應用于TEMT的研究中，但它的作用濃度及抑制效果尚少見相關報道。本研究旨在探討SB203580在30 mmol/L葡萄糖（Glucose，GS）誘導TEMT過程中的較佳作用濃度及其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1主要儀器和試劑xMark酶聯免疫檢測儀、XR+凝膠成像儀（BIO-RAD公司）、顯微鏡（OLYMPUS公司）、LSM 510 META共聚焦顯微鏡（ZEISS公司）。人近端腎小管上皮（HK-2）細胞（上海通派公司）、胎牛血清（FBS，BI公司）、DMEM（無糖）/F12培養基（Gibicol公司）、0.25%胰蛋白酶+ EDTA（Heclon公司）、SB203580（Calbiochem公司）、MTT（Solarbio公司）、二甲基亞砜（DMSO，上海前塵生物科技有限公司）、鼠抗人α-SMA抗體（博士德公司/abcam公司）、兔抗人P38MAPK抗體、兔抗人P-P38MAPK抗體（Cell Signaling公司）、多聚甲醛（博士德生物公司）、山羊血清（中杉金橋公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組體外培養HK-2細胞，復蘇后用含10%FBS的DMEM（無糖）/F12培養液于5%CO2、37℃培養箱中培養，當細胞融合度達75%～80%時，用0.25%胰蛋白酶+ EDTA消化，傳代培養，取第2～7代細胞用于實驗。HK-2依處理方式的不同分為7組：對照組（5.5 mmol/L GS）、DMSO組（5.5 mmol/L GS+30 μmol/L SB203580等體積的DMSO）、高糖組（30 mmol/L GS）、S5組（30 mmol/L GS+5 μmol/L SB203580）、S10組（30 mmol/L GS+10 μmol/L SB203580）、S20組（30 mmol/L GS+20 μmol/L SB203580）、S30組（30 mmol/L GS+30 μmol/L SB203580），干預48 h。倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態。

1.2.2MTT法檢測HK-2細胞增殖收集對數生長期HK-2細胞并接種于96孔板內，每孔加入100 μL細胞懸液，將待測細胞密度調至2 000個/孔，邊緣孔用無菌PBS填充；次日，待細胞貼壁后吸出培養基，PBS洗1次后，加入DMEM/F12同步化12 h，按1.2.1分組并加入不同濃度SB203580，每組9個復孔；48 h后PBS洗1次，每孔加入100 μL完全培養基及20 μL 5 g/L MTT溶液，設置空白調零孔（只加完全培養基及MTT），避光孵育4 h后，小心吸去孔內培養液；每孔加入150 μL二甲基亞砜，酶標儀中低速振蕩3次，每次3 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔光密度（OD）值；實驗重復3次，計算抑制率（IR）=［OD高糖組-ODSB203580組］/ OD高糖組×100%，計算半數抑制濃度（IC50）［5］。

1.2.3Western blot檢測 HK-2細胞中 P38MAPK、PP38MAPK、α-SMA的表達設對照組、高糖組及S30組。取對數期細胞種板，按上述分組加藥，干預48 h后冰上裂解并收集細胞，4℃12 000 r/min離心25 min，提取蛋白，BCA試劑盒測蛋白濃度，配平后加入 5×loading buffer，混勻后100℃8 min煮沸，使蛋白變性，上樣電泳，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜轉膜，5%脫脂奶粉或BSA室溫封閉2 h，兔抗人單克隆P38MAPK、P-P38MAPK抗體（1∶1 000）或鼠抗人單克隆α-SMA抗體（1∶500）、β-actin抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶20 000）室溫孵育2 h，暗室曝光，凝膠成像和Gel-Pro analyzer分析系統進行灰度分析。

1.2.4免疫熒光法檢測HK-2細胞中α-SMA的表達設置對照組、高糖組及S30組。取對數期細胞，每孔加入100 μL細胞懸液，接種于置有無菌玻片的6孔板中爬片，細胞數約8 000個/張，按上述分組加藥干預48 h。PBS洗3次后用4%多聚甲醛固定15 min，10%山羊血清室溫封閉30 min，滴加鼠抗人單克隆α-SMA抗體（1∶50），4℃孵育過夜，FITC標記抗小鼠IgG（1∶100）室溫孵育1.5 h，于藍色激發光（綠光）下觀察熒光強度。

1.3統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件處理。符合正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1HK-2細胞形態學觀察對照組HK-2細胞呈鵝卵石狀，細胞呈現卵圓形、多邊形，胞核居中，呈島嶼狀、簇狀生長，細胞間連接緊密；DMSO組較對照組無顯著差異；高糖組細胞逐漸向長橢圓形、長梭形轉變，生長較前松散；加入SB203580處理48 h后，細胞生長較前緩慢，胞體略增大，胞漿中可見凋亡小體，且隨著SB203580濃度上升，胞漿中凋亡小體數量呈現遞增趨勢，見圖1。

2.2HK-2細胞增殖結果比較與對照組相比，DMSO組、S10組HK-2細胞增殖不明顯（P＞0.05）；高糖組、S5組HK-2細胞增殖明顯（P＜0.05）；S20、S30組HK-2細胞增殖顯著被抑制（P＜0.05）。與高糖組相比，S5、S10、S20、S30組OD值均下降（P＜0.05），細胞數目明顯減少，見表1。SB203580 IC50為29～36 μmol/L。

Tab.1　Comparison of OD value and inhibitory rate of HK-2 cells between seven groups表1　各組HK-2細胞OD值及抑制率比較?。╪=9，x±s）

2.3HK-2細胞中P38MAPK、P-P38MAPK表達對照組、高糖組、S30組P38MAPK/β-actin灰度值比值分別為0.900±0.182、0.909±0.121及0.921±0.173（F=1.638，P＞0.05）。P-P38MAPK/β-actin分別為0.123±0.066、0.629±0.193及0.235±0.095（F=1 057.744，P＜0.05），其中，與對照組相比，高糖組、S30組P-P38MAPK條帶變粗變深，P-P38MAPK蛋白表達增多；與高糖組相比，S30組P-P38MAPK蛋白表達量降低，見圖2。

Fig.2　Expressions of P38MAPK and P-P38MAPK of HK-2 cells detected by Western blot assay圖2　Western blot法檢測各組HK-2中細胞P38MAPK、P-P38MAPK的表達

2.4HK-2細胞α-SMA表達結果比較對照組、高糖組、S30組α-SMA熒光強度分別為11.314±0.732、63.914±3.691及 23.082±2.123（F=612.424，P＜0.05），其中高糖組、S30組較對照組增強；與高糖組相比，S30組熒光強度減弱（P＜0.05）。Western blot結果示α-SMA表達量分別為0.091±0.013、0.334± 0.033及0.167±0.078（F=106.718，P＜0.05），其趨勢與免疫熒光法結果基本一致，見圖3、4。

Fig.3　The expression of α-SMA of HK-2 cells in three groups圖3　SB203580干預48 h后各組HK-2細胞中α-SMA的表達（×630）

Fig.4　The expression of α-SMA of HK-2 cells detected by Western blot assay圖4　Western blot法檢測各組HK-2細胞α-SMA的表達

3　討論

腎小管上皮細胞是一種穩定細胞，生理情況下增殖不明顯，只有在受到損傷等刺激時，才表現出較強的再生能力。在DN病程發展過程中，腎小管上皮細胞在高糖刺激下出現TEMT，其特征為腎小管上皮細胞原有表型特征喪失，出現MyoF表型［4］。同時，研究還發現，α-SMA表達量與TEMT嚴重程度密切相關［6］。本研究MTT結果顯示，高糖組HK-2細胞增殖率高于對照組；同時高糖組α-SMA表達量較對照組顯著升高，證實了30 mmol/L GS作用48 h可以使HK-2細胞TEMT，此結果與Lyu等［7］研究一致。因此，有效抑制HK-2細胞增殖對于有效減少HK-2細胞中α-SMA的表達及TEMT至關重要。

P38MAPK是MAPKs家族成員之一，主要存在于真核細胞中，是一種高度保守的信號轉導模塊，具有調節細胞生長、分化、遷移及炎癥等作用［8］。Huang等［9］研究表明，通過調節P38MAPK信號通路中的P-P38MAPK、轉化生長因子（TGF）-β等重要信號分子，抑制P38MAPK的活化，可改善DN病程中腎臟的炎性病變。因此，P38MAPK信號通路在DN過程中發揮著重要的作用，有效抑制P38MAPK可能延緩TEMT的進程。SB203580是一類吡啶咪唑類化合物，為 P38MAPK的特異性抑制劑。SB203580可以通透細胞并抑制P38MAPK，從而抑制后續MAP激酶活化蛋白激酶（MAPKAPK）-2和MAPKAPK-3的活化，發揮生物學效應［10］。本實驗結果顯示，與高糖組相比，加入5、10、20、30 μmol/L 的SB203580，HK-2細胞增殖抑制率分別為6.5%、16.6%、29.8%、46.0%，證實在TEMT過程中，隨著SB203580濃度逐漸增加，細胞增殖抑制率逐漸升高；而DMSO是SB203580的溶劑，具有細胞毒性，對照組和DMSO組細胞增殖差異無統計學意義，提示與30 μmol/L SB203580溶液等體積的DMSO對HK-2細胞增殖無顯著抑制作用，該抑制效果與DMSO無關。同時，與高糖組相比，S30組P38MAPK表達無顯著變化，P-P38MAPK表達量下降，證實SB203580可以抑制P38MAPK磷酸化，并且不改變P38MAPK總蛋白表達量，與Shi等［11］研究結果相近。

IC50常用于衡量藥物誘導細胞凋亡的能力。在不同細胞種屬間或同種細胞不同信號通路中，SB203580的IC50不盡相同，該差異可能與細胞種類、培養環境、細胞生長狀態及藥物生產廠家不同直接相關［5，12］。外源性的MTT可以使活細胞中的琥珀酸脫氫酶還原為可溶于DMSO的紫色結晶甲瓉（formazan），并沉積在細胞中，因此，可以通過測量OD值評估細胞增殖情況。本實驗結果示30 μmol/L SB203580干預48 h，HK-2細胞增殖抑制率約為50%，S30組較高糖組熒光強度減弱，α-SMA表達量降低，提示30 μmol/L SB203580不僅可以有效抑制TEMT過程中P-P38MAPK的表達，同時也可使α-SMA的蛋白表達量降低，證實30 mmol/L SB203580可以抑制TEMT過程中α-SMA的表達，延緩TEMT進程。然而S30組中α-SMA表達量仍高于對照組，提示除P38MAPK信號通路外，可能尚有多條信號通路參與TEMT過程；亦可能與30 μmol/L SB203580尚不能完全阻斷P38MAPK信號通路有關。

綜上所述，30 mmol/L GS可以誘導HK-2細胞TEMT；30 μmol/L SB203580可以使TEMT過程中約50%HK-2細胞增殖受到抑制，是TEMT過程中的較佳抑制濃度；30 μmol/L SB203580可能通過部分下調P-P38MAPK表達，繼而抑制HK-2細胞增殖及胞漿中α-SMA的表達，延緩HK-2細胞TEMT的進程。

（圖1見插頁）

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（2015-07-07收稿2015-10-16修回）

（本文編輯陸榮展）

The effects of P38MAPK inhibitor SB203580 on TEMT of HK-2 cells

JIA Lin，LIN Zhifeng，MA Li，TANG Yuling，YANG Rui，YANG Xiaoping
Division of Nephrology，the First Affiliated Hospital，College of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832008，China；Corresponding AuthorE-mail:sbkyxp@163.com

Abstract：ObjectiveTo observe the effects of different concentrations of SB203580，the inhibitor of P38MAPK，in process of high glucose（GS）-induced renal tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation（TEMT）.MethodsThe cultured human renal tubular epithelial cells（HK-2）were divided into control group（5.5 mmol/L GS），GS（30 mmol/L GS）group and different concentrations of SB203580（30 mmol/L GS+5，10，20 and 30 μmol/L SB203580）groups.The treatments were for 48 hours.MTT assay was used to observe cell proliferation.The median inhibitingconcentration（IC50）was calculated.Western blot assay was used to detect the expressions of P38MAPK，P-P38MAPK and α-smooth muscle actin（α-SMA）in control group，high-glucose group and S30 group.The expression of α-SMA was also detected by the method of immunofluorescence.Results1.Compared with control group，there was no significant inhitory effect on proliferation rate in DMSO group（P＞0.05）.There were increased HK-2 cells in high glucose group and S5group（P＜0.05）.Proliferation rates were significantly decreased in S20 and S30 groups（P＜0.05）.Compared with high glucose group，the proliferation rates of HK-2 cells were inhibited in S5，S10，S20 and S30 groups（P＜0.05）.2.The expression of P-P38MAPK was significantly higher in high glucose group and S30 group than that of control group（P＜0.05）.Compared with high glucose group，the expression of P-P38MAPK was significantly decreased in S30 group（P＜0.05），whereas no significant difference in the expression of P38MAPK between the two groups（P＞0.05）.3.Compared with control group，the expression of α-SMA was significantly increased in high glucose group and S30 group（P＜0.05）.Compared with high glucose group，the expression of α-SMA was significantly decreased in S30 group（P＜0.05）.ConclusionThe 30 mmol/L GS can lead to TEMT in HK-2 cells.The more suitable inhibitory concentration of SB203580 in the process of TEMT is 30μmol/L.SB203580 can slowdown the process of TEMT by inhibiting P38MAPK activation and inhibiting proliferation and the expression of α-SAM s of HK-2 cells.

Key words:diabetic nephropathy；kidney tubules；epithelial cells；epithelial-mesenchymaltransition；P38MAPK；SB203580

中圖分類號：R692

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150004

基金項目：石河子大學科學技術研究發展計劃基金資助項目（2013ZRKXYQ-YD16）

作者單位：石河子大學第一附屬醫院腎病科（郵編832008）

作者簡介：賈林（1989），女，碩士在讀，主要從事腎小管疾病研究

通訊作者E-mail:sbkyxp@163.com