長春西汀對糖尿病大鼠靜脈橋移植術后再狹窄的影響

張覺宇，藍志純，霍天明，李世康

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長春西汀對糖尿病大鼠靜脈橋移植術后再狹窄的影響

張覺宇，藍志純，霍天明，李世康

摘要：目的探討長春西?。╒inp）對糖尿病靜脈橋移植術后再狹窄的影響及可能作用機制。方法36只SD大鼠隨機分為對照組和Vinp組，通過建立糖尿病模型進行自體頸外靜脈-頸總動脈移植，分別以生理鹽水或者Vinp進行腹腔注射，于術后0周、2周及4周取移植靜脈橋制作病理切片，測量內膜厚度，免疫組化法檢測增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白表達，通過細胞增殖指數定量描述。Western blot檢測核轉錄因子（NF）-κB的磷酸化水平。結果Vinp干預后明顯減少糖尿病血管橋內膜增厚［術后2周：（17.06±5.10）μm vs.（39.79±7.84）μm，P＜0.01；4周：（30.94±5.18）μm vs.（63.67± 18.09）μm，P＜0.01］，同時還降低糖尿病靜脈橋PCNA蛋白的表達［術后2周：（21.07±1.38）%vs.（28.13±1.35）%，P＜0.01；4周：（31.73±1.38）%vs.（63.67±18.09）%，P＜0.01］，并抑制NF-κB的磷酸化（術后2周：1.08±0.42 vs.0.84±0.12，P＜0.01）。結論Vinp能有效抑制糖尿病靜脈橋術后內膜增厚，其機制可能與抑制NF-κB通路，從而抑制炎癥反應有關。

關鍵詞：糖尿病，實驗性；移植物閉塞，血管；增殖細胞核抗原；NF-κB；長春西??；靜脈橋；再狹窄

臨床實踐中，對于存在多支血管病變和糖尿病等危險因素的冠心病患者，冠狀動脈旁路移植術（CABG）仍然是重要的治療方法，然而術后移植靜脈較高的再狹窄發生率嚴重影響手術的遠期療效［1］。靜脈橋取材后白細胞相關黏附分子表達升高，促進核轉錄因子（NF）-κB入核，激活細胞外信號調節激酶（ERK1/2）通路，導致平滑肌細胞異常增殖遷移，這可能與靜脈橋再狹窄密切相關［2］，而糖尿病環境中會加重該過程。因此，減輕局部血管的炎性反應，將可能更好地控制移植后靜脈橋狹窄的發生。長春西?。╒inpocetine，Vinp）是從夾竹桃科長春花中提取的一種生物堿，具有抗炎、抗氧化、擴張血管、改善缺血缺氧的作用。最近研究表明，Vinp能夠改善糖尿病血管損傷［3］。然而在糖尿病中Vinp是否也可保護血管移植術后血管損傷，尚鮮見報道。本研究通過建立大鼠糖尿病模型進行自體頸外靜脈-頸總動脈移植，探討Vinp對術后移植靜脈橋再狹窄的作用效果及其可能機制。

1　材料與方法

1.1材料成年雄性SD大鼠（SPF級）36只，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，體質量200～250 g。Vinp和鏈脲佐菌素（STZ）均購自美國Sigma公司。羅氏血糖儀購自德國羅氏公司。一抗：增殖細胞核抗原（PCNA）兔抗小鼠單克隆抗體IgG，p-NF-κBp65山羊抗小鼠單克隆抗體IgM購自美國圣克魯斯生物技術公司，GAPDH兔抗小鼠IgG購自中杉金橋公司。二抗：過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG二抗購自上?？党缮锕こ逃邢薰?。日本Olympus BH-2光學顯微鏡，雙人雙目手術顯微鏡（上海光學儀器廠），顯微外科手術器械（寧波手術器械廠），8/0醫用無損傷縫合線（寧波醫用縫合針廠），Image-Pro Plus Version 6.0計算機圖像分析系統。

1.2動物模型建立及分組36只雄性成年SD大鼠腹腔注射STZ55 mg/kg，1周后禁食12 h采血檢測空腹血糖，血糖大于16.7 mmol/L為建模成功。采用隨機數字表法將大鼠分為Vinp組（Vinp）和對照組（生理鹽水），每組18只。糖尿病模型建立成功1周后行自體頸外靜脈-頸總動脈移植術，10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉，肝素鈉（200 U/kg）尾靜脈注射肝素化。切開頸部皮膚，游離頸外靜脈，8/0線結扎其屬支及靜脈遠、近兩端并切取中間段0.8～1 cm，沖洗管腔置肝素鈉鹽水。充分游離頸總動脈，罌粟堿稀釋液噴灑動脈表面，無損傷動脈夾阻斷動脈兩端血流，切除中間段動脈約0.5 cm，肝素鈉鹽水沖洗殘端。利用“cuff”管套扎術將頸外靜脈橋倒轉銜接于兩殘端之間，開放血管夾，碘伏沖洗術野，逐層縫合肌肉、皮下和皮膚。術后當天青霉素40萬U/kg肌內注射，常規飼養。

1.3術后處理及標本采集加工術后大鼠按10 mg/（kg·d）劑量分別給予Vinp和生理鹽水腹腔注射治療，常規飼養。剔除感染、死亡大鼠。于移植術后0周、2周及4周切取相當長度的移植靜脈。同一樣本分成兩部分，一部分直接置于4%多聚甲醛固定過夜后，再置于10%中性福爾馬林固定，經透明、脫水、石蠟包埋后進行5 μm連續切片，對不同時間點的所有切片進行HE染色及免疫組化檢測；另一部分-80℃保存，用于蛋白免疫印跡檢測（Western blot）。

1.4組織學觀察光學顯微鏡下觀察移植靜脈內膜的動態變化并拍照，用Image-Pro Plus 6.0測定內膜厚度。

1.5免疫組化檢測血管組織PCNA的表達每根靜脈選取3張切片，經過脫蠟，高溫高壓修復抗原，3%H2O2處理后，山羊血清封閉，PBS洗3次，加一抗4℃過夜后，復溫30 min，PBS洗3次，加二抗孵育30 min，滴加DAB顯色液顯色5 min，經蘇木素染色1 min，鹽酸乙醇分化后返藍20 min，鏡下觀察。每張切片在400倍光鏡下觀察，在中膜處任意讀取5個視野，細胞核內存在棕黃色顆粒為PCNA免疫組化染色陽性細胞，計數每個視野下PCNA陽性細胞數及細胞總數。計算細胞增殖指數（細胞增殖指數=陽性細胞數/細胞總數× 100%），5次計算平均值。

1.6Western blot檢測血管組織NF-κBp65蛋白磷酸化情況取-80℃保存的大鼠靜脈橋，液氮研磨法碾碎并收集于1.5 mL EP管，立即加入RIPA組織蛋白裂解液及磷酸化酶抑制劑充分裂解30 min，4℃12 000 r/min離心15 min，取上清液，測總濃度后，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min變性蛋白。制備10%分離膠和4%濃縮膠，加樣電泳后將目的蛋白條帶轉移至硝酸纖維素膜上，5%BSA封閉液振蕩封閉2 h后，一抗（p-NF-κBp65、GAPDH）4℃孵育過夜，洗膜，HRP-IgG二抗室溫孵育1 h，洗膜后進行增強化學發光反應，暗室曝光1～3 min，顯影定影后沖洗膠片，凝膠成像分析系統（AlphaView Software）分析并計算各目標條帶與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白磷酸化的相對值。

1.7統計學方法采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，計量數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1模型一般情況成功建立糖尿病大鼠靜脈移植模型36只，無感染及死亡。靜脈橋肉眼觀充盈良好，將遠心端剪斷可見鮮紅色血流涌出，血流通暢。

2.2Vinp對大鼠靜脈橋組織形態的影響0周對照組和Vinp組靜脈內膜光滑，無增厚，見圖1A、D。術后2周，對照組內膜較Vinp組內膜增厚明顯，見圖1B、E。術后4周時，對照組內膜亦較Vinp組內膜增厚明顯，見圖1 C、F，表1。

Tab.1　Comparion of intima thickness between control group and Vinp group表1　對照組與Vinp組內膜厚度的比較?。╪=6，μm，x±s）

2.3Vinp對靜脈橋組織 PCNA蛋白表達的影響以細胞增殖指數定量描述PCNA蛋白表達，2周和4周對照組較Vinp組細胞增殖指數明顯升高，見圖2，表2。

2.4Vinp對靜脈橋組織NF-κBp65蛋白磷酸化的影響0周時對照組與Vinp組NF-κBp65蛋白磷酸化比較差異無統計學意義，2周時對照組血管中NF-κBp65蛋白磷酸化較Vinp組升高，見圖3，表3。

Tab.2　The percentages of PCNA expression in control and Vinp groups表2　對照組和Vinp組PCNA的增殖指數?。╪=18，%，x±s）

Fig.3　The phosphorylation of NF-κBp65 in control and Vinp groups圖3　對照組和Vinp組NF-κBp65蛋白磷酸化情況

Tab.3　The phosphorylation of NF-κB in control and Vinp groups at two-week表3　2周時對照組和Vinp組NF-κBp65蛋白磷酸化情況?。╪=6，x±s）

3　討論

CABG術后10年內可有近50%移植的靜脈橋因發生再狹窄最終導致移植失?。?］；而伴有糖尿病的患者移植失敗率更高。糖尿病靜脈橋再狹窄可能是一個免疫因素及非免疫因素均參與的病理生理過程。動脈血流快速沖擊會造成移植的靜脈內皮細胞損傷，暴露內皮下基質，促使血小板與之結合，激活并分泌多種細胞因子、趨化因子和生長因子，進而加速炎癥細胞向損傷的內皮黏附、聚集；釋放大量炎癥介質，進一步造成內皮細胞損傷。糖尿病患者代謝紊亂導致血管內皮細胞長期處于功能失調狀態［5］，更加重了術后血管內膜損傷的程度。釋放的大量炎性因子、生長因子等還可進一步影響血管平滑肌細胞（VSMCs）的異常增殖、遷移，導致再狹窄的發展［6］。

近年來，對發生再狹窄的靜脈橋的宏觀及微觀層次研究均找到了炎性反應參與靜脈橋再狹窄的證據。Bikdeli等［7］通過人體組織病理研究發現，CABG術后靜脈橋相比原位大隱靜脈具有更高水平的炎性細胞浸潤。Tseng等［8］建立小鼠自體血管移植模型進行研究，結果顯示移植靜脈術后早期有大量白細胞黏附，分泌炎性細胞因子，增強NF-κB及ERK1/2蛋白的磷酸化，促進新生內膜增厚。本研究顯示，對照組和Vinp組靜脈橋均有不同程度的內膜增厚，且術后2周和4周對照組靜脈橋中PCNA蛋白表達及NF-κB的磷酸化明顯升高，說明炎性反應和平滑肌細胞的異常增殖遷移參與了靜脈橋再狹窄的過程。

此前，Wang等［3］通過建立糖尿病大鼠頸部動脈球囊損傷模型發現，Vinp能抑制NF-κB和ERK1/2蛋白磷酸化，從而減輕血管損傷后新生內膜增厚，但在糖尿病靜脈橋方面未做研究。Zhuang等［9］通過Vinp作用于敲除apoE的小鼠實驗證明，Vinp亦能抑制AKT/NF-κB通路，從而抑制ERK1/2蛋白磷酸化，減輕動脈粥樣硬化。本研究顯示，與同期對照組比較，Vinp組新生內膜厚度顯著減少，PCNA蛋白表達（細胞增殖指數）明顯下降，NF-κBp65磷酸化水平下降，表明該藥物可以減輕靜脈橋狹窄，其可能機制是通過抑制NF-κB蛋白的活性從而減輕糖尿病靜脈橋狹窄。Vinp能改善靜脈移植后再狹窄，其有可能成為臨床治療及預防心血管疾病的理想藥物。

（圖1、2見插頁）

參考文獻

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［9］Zhuang J，Peng W，Li H，et al.Inhibitory effects of vinpocetine on the progression of atherosclerosis are mediated by Akt/NF-κB dependent mechanisms in apoE-/-mice［J］.PLoS One，2013，8（12）：e82509.doi：10.1371/journal.pone.0082509.

（2015-08-26收稿2015-10-23修回）

（本文編輯李國琪）

Study on the effect of vinpocetine on the restenosis of venous bypass grafts in diabetic rats

ZHANG Jueyu，LAN Zhichun，HUO Tianming，LI Shikang
Department of Thoracic and Cardiovascular Diseases，First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China Corresponding AuthorE-mail：gxtinghaodi@163.com

Abstract：ObjectiveTo expose the effect and its potential mechanism of vinpocetine（Vinp）on the restenosis of diabetic grafted veins.MethodsThirty-six Sprague-Dawley rats were randomized into saline control group and Vinp treatment group.The autologous jugular vein to carotid artery transplantation was performed in diabetic model rats.Normal saline or Vinp were intraperitoneally injected.The rats were sacrificed at 0，2 or 4 weeks after surgery，then the grafted veins were harvested.The pathological sections were used to detect the effect of Vinp on intimal hyperplasia.The protein expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）was detected by immunohistochemical method，and which was described by cell proliferation index.The phosphorylation of NF-κB was detected by Western blot assay.ResultsThe treatment of Vinp on intimal hyperplasia in vivo was significant at two weeks after surgery（17.06±5.10）μm versus control group（39.79±7.84 μm，P＜0.01），（30.94±5.18）μm versus（63.67±18.09）μm at four weeks after surgery（P＜0.01）.Vinp treatment effectively reduced the protein expression of PCNA［2 weeks：（21.07±1.38）%vs.（28.13±1.35）%，P＜0.01；4 weeks：（31.73±1.38）%vs. （63.67±18.09）%，P＜0.01］.The treatment of Vinp inhibited phosphorylation of NF-κB at two weeks（1.08±0.42 vs.0.84± 0.12，P＜0.01）.ConclusionVinpocetine can effectively attenuate intimal hyperplasia in diabetic grafted veins，which might be related to its effect on inhibitingphosphorylation of NF-κB as well as inflammation.

Key words：diabetes mellitus，experimental；graft occlusion，vascular；proliferating cell nuclear antigen；NF-kappa B；Vinpocetine；vein graft；restenosis

中圖分類號：R654.2

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150121

基金項目：廣西科學研究與技術開放計劃項目（桂科攻1355005-4-8）

作者單位：廣西醫科大學第一附屬醫院心胸外科（郵編530021）

作者簡介：張覺宇（1990），男，碩士在讀，主要從事冠狀動脈搭橋術研究

通訊作者E-mail：gxtinghaodi@163.com