去泛素化酶A20在糖尿病腎病大鼠腎臟及脂多糖誘導的系膜細胞中的表達及變化

梁雅靈，陳嬌，龍洋，李衍輝，黎秋晗，范芳，徐勇

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去泛素化酶A20在糖尿病腎病大鼠腎臟及脂多糖誘導的系膜細胞中的表達及變化

梁雅靈，陳嬌，龍洋，李衍輝，黎秋晗，范芳，徐勇

摘要：目的觀察去泛素化酶A20在糖尿病腎?。―N）大鼠腎臟及脂多糖（LPS）誘導的系膜細胞中的表達變化及可能的作用機制。方法 （1）Wistar雄性大鼠30只，隨機均分為2組，模型組給予鏈脲佐菌素（STZ）60 mg/kg腹腔注射建立早期DN大鼠模型；對照組給予60 mg/kg枸椽酸緩沖液腹腔注射。分析2組6、8周時血糖和尿微量白蛋白變化。HE染色分析2個時間點的腎臟病理變化。采用免疫組化檢測A20在腎臟中的表達。（2）體外培養腎臟系膜細胞，采用不同時間（0、2、4、6、12、24、48、72 h）和不同濃度（0.1、1、10 μg/L）的LPS處理細胞后，檢測A20、核因子（NF）-κB、核因子κB抑制因子（IκB）、IκB激酶γ（IKKγ）、單核細胞趨化蛋白（MCP）-1蛋白及基因的表達變化。結果 （1）模型組較對照組血糖和尿微量白蛋白含量均升高（均P＜0.01）。模型組腎小管上皮細胞呈玻璃樣變，8周時更明顯。模型組較對照組A20蛋白在腎小管表達明顯減弱，而腎小球中基本無表達，8周時表達更少。（2）IKKγ不同濃度與時間下差異均無統計學意義。與0 h相比，2、4 h時A20蛋白和基因水平呈高表達，6 h后表達降低（均P＜0.05）；各時間點NF-κB表達水平均較0 h增高，IκB表達均降低（均P＜0.05）。A20和IκB的蛋白和基因表達呈濃度依賴性降低（均P＜0.05），NF-κB蛋白和基因以及MCP-1基因表達呈濃度依賴性升高（均P＜0.05）。結論A20可通過調節NF-κB信號通路來導致炎癥信號通路的持續激活，可能在DN的發生發展中發揮作用。

關鍵詞：糖尿病腎??；腎小球系膜細胞；脂多糖類；血糖；NF-κB；尿微量白蛋白；A20基因

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病一種嚴重的微血管并發癥。免疫炎癥反應是DN起病的中心環節，在DN早期腎組織中可見大量炎癥因子增加［1］。核因子（NF）-κB為炎癥調節的關鍵核轉錄因子，可調節多種炎性因子的表達。筆者前期研究也發現，NF-κB在DN發生發展中起重要作用，泛素化修飾在NF-κB信號通路的活化中起重要調節作用［2］。NF-κB信號受泛素化和去泛素化共同調控，兩者處于動態平衡。在眾多調控NF-κB信號的去泛素化酶中，去泛素化酶A20又稱腫瘤壞死因子α誘導蛋白3（tumor necrosis factor，alp-induced protein 3，TNFAIP3），是NF-κB信號的主要負性調控因子和炎癥抑制因子［3］。目前，A20在1型糖尿?。═1DM）起病中的重要作用已被肯定［4］，但是A20在2型糖尿?。═2DM）和DN中的作用研究尚少見相關報道。本研究旨在探討A20在DN動物模型以及脂多糖（LPS）誘導的系膜細胞炎癥反應中的作用和可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1一般資料SPF級Wistar雄性大鼠30只，體質量（175± 5）g，6～8周齡，購自重慶騰鑫生物技術有限公司。大鼠腎小球系膜細胞（HBZY-1）購自復旦IBS細胞資源中心；Mini-P3垂直電泳儀、Western blot儀器、紫外凝膠成像分析系統購自Bio-Rad公司；恒溫細胞培養箱和高溫低速離心機購自Thermo公司；A20、NF-κB、核因子κB抑制因子（inhibitor of nuclear factor-kappa B，IκB）、IκB激酶γ（IκB kinase，IKKγ）、單核細胞趨化蛋白（monocyte chemotactic protein，MCP）-1、GAPDH的PCR引物序列由上海生工生物合成。A20/TNFAIP3兔抗大鼠多克隆抗體、NF-κB p65小鼠抗大鼠多克隆抗體和IκB小鼠抗大鼠多克隆抗體（Cell Signaling公司），IKKγ兔抗大鼠單克隆抗體（abcam公司），β-actin小鼠抗大鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和蛋白預染Maker（碧云天生物技術研究所）。Trizol試劑盒（TIANGEN公司）、化學發光試劑盒和PVDF膜（Millipore公司）、RT-PCR試劑盒（博瑞克生物技術有限公司）。

1.2動物模型制作及分組30只大鼠于18～29℃室溫、40%～70%相對濕度下自由飲水、分籠適應性喂養1周。隨機分為模型組（15只）及對照組（15只），禁食不禁水12 h。模型組給予鏈脲佐菌素（STZ）60 mg/kg腹腔注射；對照組給予60 mg/kg枸椽酸緩沖液腹腔注射。1周后檢測各組血糖含量，模型組連續3 d血糖＞16.7 mmol/L，判定為成功構建糖尿病模型［5］。造模成功12只，第6周和第8周2組分別處死模型組和對照組大鼠各6只，處死前空腹24 h，收集尿液和血樣，分別檢測血糖含量和尿微量白蛋白。2組于第6、8周無菌條件下迅速取出右腎上半部，用4%中性甲醛固定，乙醇脫水、氯仿透明、浸蠟、石蠟包埋，用切片機切成4 μm厚的石蠟切片，行HE染色，光學顯微鏡（×200）下觀察大鼠腎臟形態學變化。

1.3免疫組化法觀察A20表達情況石蠟切片脫蠟至水，高溫蒸汽抗原修復后滴加5%BSA封閉液，棄去封閉液后，滴加兔抗大鼠A20抗體（1∶80）50 μL，充分覆蓋切片，4℃冰箱孵育過夜，次日PBS漂洗后。加羊抗兔抗體50 μL。37℃濕盒孵育1 h，DAB顯色、蘇木素復染、脫水透明封片，于光學顯微鏡（×200）下觀察，A20陽性表達者呈棕黃色。

1.4細胞培養與分組大鼠腎小球系膜細胞（HBZY-1）置于含10%的胎牛血清，體積分數1%的青/鏈霉素的DMEM低糖培養基中，于37℃和5%CO2恒溫細胞培養箱培養，待細胞融合為70%～80%時將其接種于6孔板，培養24 h，將1 mL 的10 μg/L LPS添加其中，0、2、4、6、12、24、48、72 h收集細胞。在接種的另外的6孔板中，選取12 h這個時間點再分別用不同濃度（0.1、1、10 μg/L）的LPS作用細胞后同樣收集細胞。

1.5Western blot檢測A20、NF-κB、IκB及IKKγ蛋白表達水平將細胞所提蛋白經12%SDS-PAGE進行電泳，并且轉膜、封閉、加一抗孵育（一抗稀釋濃度分別是A20為1∶600、NF-κB為1∶2 000、IκBα為1∶1 000、IKKγ為1∶5 000、β-actin為1∶2 000），4℃孵育過夜；次日加入二抗孵育，二抗稀釋濃度分別為：羊抗兔按1∶2 000，羊抗鼠按1∶3 000，室溫孵育1 h；洗膜后加入ECL發光液顯色，結果用凝膠定量分析軟件Quantity One 4.62分析A20、NF-κB、IκB、IKKγ的灰度值，并以β-actin的灰度值作為內參校正。

1.6半定量PCR檢測A20、NF-κB及IκB等表達水平利用Trizol法從細胞內提取總RNA，反轉錄為cDNA，再于PCR反應管中擴增，引物見表1。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火20 s，72℃延伸30 s，30個循環。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，將瓊脂糖凝膠放入紫外成像儀，用Quantity One軟件分析A20、NF-κB、IκB、IKKγ、MCP-1的灰度值，并以GAPDH的灰度值作為內參校正。

Tab.1　Primer sequences of A20，NF-κB，IκB，IKKγ and MCP-1表1　A20、NF-KB、IKKγ、IKB、MCP-1引物序列基因

1.7統計學方法采用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，2組間均數比較采用t檢驗，組內不同時點比較用配對t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.12組血糖、尿微量白蛋白及HE染色結果比較第6周和第8周，模型組的血糖和尿微量白蛋白含量較對照組均升高（均P＜0.01）；且第8周與第6周相比，模型組的尿微量白蛋白含量明顯增高（P＜0.05），但血糖含量差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。6周和8周時，模型組較對照組腎小球系膜細胞和內皮細胞輕度增生，腎小球體積增大，腎小管上皮細胞稍呈玻璃樣變；模型組8周較6周腎小球體積進一步增大，腎小管上皮細胞玻璃樣變更加明顯，見圖1。

2.2A20表達分析對照組腎臟組織中可見A20蛋白表達在腎小管上皮細胞內表達較強，腎小球中較弱，6周與8周表達量無明顯改變；而模型組可見在腎小管表達明顯減弱，腎小球中基本無表達，且8周較6周腎小管及腎小球中表達量明顯減少，見圖2。

Tab.2　Changes of blood glucose and urinarymicro albumin in model group and control group表2　模型組與對照組血糖和微量蛋白量變化?。╪=12，x±s）

Fig.3　Changes of A20，NF-κB，IκB and IKKγ expressions in rat mesangial cells with the treatment of different times and different concentrations of LPS圖3　A20、NF-κB、IκB和IKKγ蛋白表達隨LPS處理時間和濃度的變化

2.32組A20、NF-κB、IκB及IKKγ蛋白表達水平比較 （1）蛋白表達水平隨時間變化情況。與0 h相比，2、4 h時A20蛋白高表達，6 h后表達顯著降低（均P＜0.05）；各時間點NF-κB表達水平均較0 h增高，IκB表達均降低（均P＜0.05）；各時間點IKKγ表達差異無統計學意義，見圖3A、B。（2）各蛋白表達水平隨濃度變化情況。除IKKγ各濃度組間差異無統計學意義外，A20和IκB的表達均呈濃度依賴性降低；NF-κB表達呈濃度依賴性升高（均P＜0.05），見圖3C、D。

2.42組A20、NF-κB、IκB、IKKγ及MCP-1基因表達水平比較 （1）基因表達水平隨時間變化情況。與0 h比較，2、4、6 h A20基因表達增高，此后降低（均P＜0.05）；各時點NF-κB及MCP-1基因表達均增高，IκB表達降低（均P＜0.05）；各時點IKKγ差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4A、B。（2）基因表達水平隨濃度變化情況。除IKKγ各濃度組間差異無統計學意義外，A20和IκB均呈濃度依賴性降低，NF-κB和MCP-1呈濃度依賴性升高（均P＜0.05），見圖4C、D。

3　討論

目前，研究顯示，DN在早期腎單位中即可出現大量單核/巨噬細胞浸潤，分泌過多的炎癥因子造成了腎組織破壞，加速了腎纖維化，炎癥反應是DN持續進展的首要因素之一［6］。在多條參與DN的炎癥信號通路中，NF-κB信號通路是其中最重要信號通路之一。泛素化調節對DN的NF-κB信號通路激活發揮顯著影響，但是調控機制復雜。NF-κB信號同時受到泛素化和去泛素化調節，正常情況下兩者處于可逆的動態平衡。去泛素化酶A20是NF-κB信號通路中關鍵的負性調控因子和炎癥抑制因子。

Fig.4　Changes of A20，NF-κB，IκB，IKKγ and MCP-1 expressions in rat mesangial cells with the treatment of different times and different concentrations of LPS圖4　A20、NF-κB、IκB、IKKγ和MCP-1基因表達隨LPS不同處理時間和濃度的變化

大量的研究發現，A20在眾多炎癥性疾病如系統性紅斑狼瘡（SLE）、風濕性關節炎、炎癥性腸病、乳糜瀉均起著重要作用［7-8］。并且A20可作為細胞保護因子，改善炎癥、提高胰島β細胞存活率；作為基因治療應用于T1DM的胰島移植以及其他干預性治療中［9］。但目前A20在T2DM及DN中的作用研究尚少。本研究通過構建DN大鼠模型發現，模型組大鼠建模后第6周和第8周的血糖和尿微量白蛋白含量較對照組均明顯升高，并且模型組較對照組腎小球系膜細胞和內皮細胞輕度增生，腎小球體積增大，腎小管上皮細胞稍呈玻璃樣變；且8周較6周病理改變更加明顯，表明模型組腎臟有明顯病理改變；進一步免疫組化結果示，A20蛋白在正常腎組織的腎小管上皮細胞內表達較強，在腎小球中表達較弱；而模型組在腎小管上皮細胞中表達明顯減弱，腎小球中基本無表達，且8周較6周腎小管及腎小球中表達量明顯減少，表明A20可能對腎臟起保護作用，A20的低表達可能促進了腎臟的病理改變。這與眾多研究報道的體內發生嚴重炎癥反應時，A20在其他組織器官如肝臟［10］、胰腺［11］等中表達發生改變相一致，同樣對機體發揮了重要的保護作用。

研究表明，T2DM和DN尿毒癥患者的體內LPS較正?；颊呙黠@上調，并且認為這可能與腸道屏障功能障礙所引起的腸源性內毒素血癥有關［12］。LPS作為TLR4的主要配體，可通過一定的轉導通路激活IKK復合物，導致IκB磷酸化降解，NF-κB活化，并促進下游多種促炎因子和趨化因子如MCP-1的表達及釋放［13］。大量炎癥因子及趨化因子MCP-1的表達則可加重腎臟損傷、促進腎小球變硬、腎小管收縮等，參與DN的發生。去泛素化酶A20參與體內炎癥調控，使組織免受過度炎癥反應帶來的損害，可作用于TLR4/NF-κB信號通路中IKK復合物的上游關鍵的銜接蛋白如受體相互作用蛋白1 （RIP1）、腫瘤壞死因子受體相關蛋白6（TRAF6）、IKKγ，反饋抑制NF-κB的活化，最終抑制炎癥信號的表達上調［14］。

本研究發現LPS作用不同時間刺激大鼠腎小球系膜細胞后，LPS短期刺激（＜6 h）時，與0 h比較，A20基因高表達，此后顯著降低，而NF-κB、MCP-1基因表達均持續增高，表明LPS長時間作用下明顯抑制A20表達，同時NF-κB信號持續激活、MCP-1進行性表達上調，而短時間內高表達的A20對NF-κB信號負性調節作用較小，考慮可能原因為在較短時間內A20對相應靶蛋白調控作用還未完全發揮，或是因為NF-κB信號通路同時存在多種調節機制，如SUMO化修飾，其重要的SUMO化修飾酶PIASy，可與A20競爭同一靶蛋白IKKγ進行SUMO化修飾，激活NF-κB信號［15］。另外，不同濃度的LPS刺激12 h下，A20和IκB蛋白和基因表達水平呈濃度依賴性表達下調，NF-κB和MCP-1基因表達水平則呈濃度依賴性表達上調，考慮可能機制為LPS長期作用后，A20表達顯著下調，不能有效地抑制NF-κB信號的激活，最終導致炎癥的持續激活，促進了DN的產生，表明A20的轉錄迅速而短暫，作為重要的“細胞保護”基因，迅速減少的A20無法抑制炎癥反應，導致炎癥進一步對靶器官的損傷。

（圖1、2見插頁）

參考文獻

［1］Donath MY.Targetinginflammation in the treatment of type 2 diabetes：time to start［J］.Nat Rev Drug Discov，2014，13（6）：465-476.doi：10.1038/nrd4275.

［2］Huang W，Xu L，Zhou X，et al.High glucose induces activation of NF-κB inflammatory signaling through IκBα sumoylation in rat mesangial cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，438（3）：568-574.doi：10.1016/j.bbrc.2013.07.065.

［3］Catrysse L，Vereecke L，Beyaert R，et al.A20 in inflammation and autoimmunity［J］.Trends Immunol，2014，35（1）：22-31.doi：10.1016/j.it.2013.10.005.

［4］Yu LY，Lin B，Zhang ZL，et al.Direct transfer of A20 gene into pancreas protected mice from streptozotocin-induced diabetes［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25（6）：721-726.

［5］Gao CL，Aqie K，Zhu JH，et al.MG132 ameliorates kidney lesions by inhibiting the degradation of Smad7 in streptozotocin-induced diabetic nephropathy［J］.J Diabetes Res，2014，2014：918396.doi：10.1155/ 2014/918396.

［6］Wada J，Makino H.Inflammation and the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Clin Sci，2013，124（3）：139-152.doi：10.1042/ CS20120198.

［7］Majumdar I，Paul J.The deubiqutinase A20 in immunopathology of autoimmune diseases［J］.Autoimmunity，2014，47（5）：307-319. doi：10.3109/08916934.2014.900756.

［8］Catrysse L，Vereecks L，Beyaert R，et al.A20 in inflammation and autoimmunity［J］.Trends Immunol，2014，35（1）：22-31.doi：10.1016/j.it.2013.10.005.

［9］Zanmmit NW，Grey ST.Emerging roles for A20 in islet biology and pathology［J］.Adv Exp Med Biol，2014，809：141-162.

［10］Zhang H，Huang C，Wang Y，et al.Hepatitis B Virus X Protein Sensitizes TRAIL-Induced Hepatocyte Apoptosis by Inhibiting the E3 Ubiquitin Ligase A20［J］.PLoS One，2015，10（5）：e0127329. doi：10.1371/journal.pone.0127329.

［11］Liu Y，Dan G，Wu L，et al.Functional effect of polymorphisms in the promoter of TNFAIP3（A20）in acute pancreatitis in the Han chinese population［J］.PLoS One，2014，9（7）：e103104.doi：10.1371/journal.pone.0103104.

［12］Yang M，Gan H，Shen Q，et al.Proinflammatory CD14+CD16+monocytes are associated with microinflammation in patients with type 2 diabetes mellitus and diabetic nephropathy［J］.Inflammation，2012，35（1）：388-396.doi：10.1007/s10753-011-9374-9.

［13］Mourad Z，Youssef E，Amarjit SN，et al.Poly（ADP-ribose）polymerase-1 is a determining factor in Crm1-mediated nuclear export and retention of p65 NF-κB upon TLR4 stimulation［J］.J Immunol，2010，185（3）：1894-1902.doi：10.4049/jimmunol.1000646.

［14］Harhaj EW，Dixit VM.Regulation of NF-kappaB by deubiquitinases ［J］.Immunol Rev，2012，246（1）：107-124.doi：10.1111/j.1600-065X.2012.01100.x.

［15］Mabb AM，Wuerzberger-Davis SM，Miyamoto S.PIASy mediates NEMO sumoylation and NF-kappaB activation in response to genotoxic stress［J］.Nat Cell Biol，2006，8（9）：986-993.

（2015-08-20收稿2015-11-13修回）

（本文編輯陸榮展）

Changes of A20 expression in mesangial cells of LPS-induced diabetic nephropathy rat model

LIANG Yaling，CHEN Jiao，LONG Yang，LI Yanhui，LI Qiuhan，FAN Fang，XU Yong
Department of Endocrinology，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China Corresponding AutorE-mail:xywyll@aliyun.com

Abstract：ObjectiveTo observe the changes of A20 in mesangial cells of diabetic nephropathy（DN）rat model induced by lipopolysaccharide（LPS）-rat，and to explore its possible mechanism.Methods（1）Thirty health male Wistar rats were randomly divided into two group.Model rats were given streptozotocin（STZ）at a dose of 60 mg/kg by intraperitoneal injection.Rats in the control group received the same volume of citrate buffer in the same way.Levels of blood glucose and urinary microalbumin were detected in two groups at the 6thand the 8thweek.Changes of renal pathology were observed by HE staining.Changes of protein A20 were observed by immunohistochemistry.（2）Expression changes of gene and proteins A20，nuclear factor（NF）-κB，IκB，IKKγ and MCP-1 in renal cells treated with LPS were determined after treatment with different time points（0，2，4，6，12，24，48 and 72 h）and different concentrations（0.1，1 and 10 μg/L）.Results（1）Levels of blood glucose and urinary microalbumin were significantly increased in model group compared with those of control group（P＜0.01）.HE stainig showed that hyaline degeneration in tubular epithelial cells was found in model group，especially at the 8thweek.Results of immunohistochemistry showed that expression of protein A20 significantly decreased in kidney tubules and nearly disappeared in glomerulus in model group compared with that of control group，which expressed less at the 8thweek. （2）There was no significant difference in the expression of IKKγ between different concentrations and different times.Compared with 0 h，the expression of A20 protein was increased at 2 h and 4 h，except that the expression of A20 protein increased after 6 h（P＜0.05）.Meanwhile NF-κB expression increased and IκB expression decreased in different time points （P＜0.05）.In addition，the expressions of A20 and IκB were decreased concentration-dependently（P＜0.05）.The expression levels of NF-κB and MCP-1 were increased concentration-dependently（P＜0.05）.ConclusionA20 may involve in the development of diabetic nephropathy by regulatingthe NF-κB pathway.

Key words：diabetic nephropathy；mesangial cells；lipopolysaccharides；blood glucose；NF-kappa B；micro albuminuria；A20 gene

中圖分類號：R587.1，R587.24

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150120

基金項目：四川省教育廳重點項目（10ZA036）；四川省國際合作項目（14GH0003）

作者單位：西南醫科大學附屬醫院內分泌科（郵編646000）

作者簡介：梁雅靈（1989），女，碩士在讀，主要從事糖尿病腎病研究

通訊作者E-mail：xywyll@aliyun.com