低壓低氧暴露條件下肺動脈高壓大鼠循環microRNA表達及其意義

徐嬌陽，司馬玲，是文輝，付　勇，劉江偉，周　瑾，余伍忠，桂俊豪

(1. 開封市中心醫院檢驗科，河南開封　475000；2. 蘭州軍區烏魯木齊總醫院,新疆烏魯木齊　830000)

?

◇基礎研究◇

低壓低氧暴露條件下肺動脈高壓大鼠循環microRNA表達及其意義

徐嬌陽1,2，司馬玲2，是文輝2，付勇2，劉江偉2，周瑾2，余伍忠2，桂俊豪2

(1. 開封市中心醫院檢驗科，河南開封475000；2. 蘭州軍區烏魯木齊總醫院,新疆烏魯木齊830000)

摘要：目的研究低壓低氧暴露條件下肺動脈高壓(HPH)模型大鼠循環microRNA(miRNA)表達的變化。方法利用基因芯片技術定量檢測、分析HPH組及對照組大鼠血清中潛在的循環miRNA的表達及其差異?；诓±?對照設計，采用熒光定量PCR技術對差異化表達miRNA進行驗證。受試者工作特征曲線(ROC)分析測試4種差異化表達miRNA對HPH組及對照組的鑒別效能。結果與對照組比較，HPH組大鼠13種miRNA表達上調，10種miRNA表達下調，其中，熒光定量PCR初步證實miR-451、miR-505及let-7d表達上調，而miR-214表達下調。ROC分析結果顯示，miR-451、miR-505及let-7 d用于鑒別HPH組大鼠和對照組大鼠的曲線下面積(AUC)分別為0.979、0.938和0.993。結論低壓低氧暴露條件下HPH組大鼠與對照組大鼠循環miRNA的表達存在顯著差異，提示血清miRNA差異化表達可能與HPH病理變化相關。

關鍵詞：低氧性肺動脈高壓；循環miRNA；基因芯片；熒光定量PCR

低壓低氧暴露能夠誘發機體的一系列生理病理變化，其中，慢性缺氧誘發的低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是高原心臟病、高原肺水腫等高原特有的多發疾病發生發展的中心環節，低壓低氧暴露條件下HPH相關生物標志物的發掘對于疾病的早期預警和治療具有重要意義。

近來研究發現[1-2]，血清或血漿中穩定存在的循環microRNA(miRNA)有望成為多種臨床疾病的新型生物標志物。本文采用基因芯片及熒光定量PCR技術對低壓低氧誘發的HPH大鼠及其對照組血清miRNA表達譜進行分析和初步驗證，探索低壓低氧暴露條件下HPH大鼠循環miRNA表達的變化及意義。

1材料與方法

1.1主要試劑血清總RNA抽提試劑盒及熒光定量PCR試劑均購自Applied Biosystem公司；基因芯片購自Agilent Technologies公司。

1.2研究對象及分組6周齡清潔級SD雄性大鼠24只[體質量為(200±20 g)]，購自新疆醫科大學實驗動物中心，采用隨機數字表法分為HPH組和常氧對照組，每組12只。本研究方案經由新疆醫科大學動物倫理委員會審查通過。

1.3動物模型建立①西北特殊環境人工實驗艙(蘭州軍區烏魯木齊總醫院)參數設定。模擬海拔高度為6 000 m；艙內壓力47.3 kPa；溫度22 ℃；濕度23.4% RH；相對氧濃度約為11.3%。

②低壓低氧處理。將HPH組SD大鼠置于人工氣候艙內，運行時間為24 h/d，晝夜比12 h∶12 h，保證其水及飼料充足，每2 d開艙半小時為其更換飼料、水以及墊料。根據預實驗結果，以低壓低氧14 d作為暴露終點。常氧對照組除低壓低氧條件外，其他條件均同低氧組。

1.4肺動脈壓力檢測將兩組大鼠在出艙后立即進行肺動脈壓力檢測：大鼠經麻醉、固定后，氣管插管行機械通氣(呼吸頻率60次/min，潮氣量6 mL，呼吸比3∶2)，開胸后，用7號針頭在肺動脈根部1 cm處逆血流方向刺入肺動脈，針頭另一端連接壓力傳感器及生理信號記錄儀，記錄平均肺動脈壓力(mPAP)。

1.5標本采集經下腔靜脈采集大鼠靜脈血5 mL于無抗凝劑普通管，室溫靜置30 min，3 000×g離心10 min，將上層血清轉移至1.5 mL離心管，12 000×g離心10 min，將上清液轉移至新的離心管，-80 ℃凍存備用。

1.6基因芯片檢測參考相關文獻[3]制備血清池樣本，即：從每一份HPH組大鼠血清各取200 μL，共計12份，然后隨機將每3份血清充分混勻，獲得1份血清池樣本，由此共獲得4份HPH組大鼠血清池樣本。同法制備4份對照組大鼠血清池樣本。將此8個研究樣本用于miRNA的基因芯片檢測?；蛐酒瑱z測步驟如下：血清池樣本經過總RNA抽提、樣本質檢合格后，進行芯片雜交、洗滌、掃描及數據處理。芯片樣本根據變異系數(CV值)判定芯片體系的穩定性，通過兩組數據間的比較分析判斷芯片體系是否穩定。

1.7miRNA的熒光定量PCR檢測將HPH組及對照組共24份血清樣本，加入外源性人工合成的線蟲miR-39作為參照，隨后按照mirVana PARIS Kit(Ambion公司)試劑盒說明書進行血清總RNA抽提，對抽提得到的血清總RNA濃度進行定量，根據定量結果，將每一份樣本總RNA水平統一調整至2 ng/μL。

反轉錄(RT)和miRNA的熒光定量PCR檢測按照Applied Biosystem公司的TaqMan(R) microRNA RT Kit和TaqMan microRNA Assay試劑盒說明書進行。

PCR反應體系共10 μL，包括RT產物稀釋液4.5 μL、TaqMan基因表達定量主反應液(Universal Master Mix II)5.0 μL和探針引物混合液0.5 μL。同時每次擴增均設立無模板對照(no template controls, NTCs)以判斷系統是否出現污染。PCR循環參數設置為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min 40個循環，60 ℃進行熒光收集。每個樣本均做3個復孔。

2結果

2.1兩組大鼠平均肺動脈壓力(mPAP)的比較HPH組大鼠mPAP[(28.13±2.53)mmHg]較對照組大鼠[(19.13±1.25)mmHg]顯著升高(P<0.01)。

2.2兩組大鼠血清池總RNA的定量結果對8份血清池樣本進行血清總RNA的抽提，定量結果顯示，8份血清標本總RNA濃度差異不大，在8.6～9.8 ng/μL之間，抽提總體積為15 μL，標本RNA總量介于129.0～147.0 ng之間，符合芯片檢測限要求。

2.3基因芯片的數據分析結果本研究累計用于基因芯片檢測的血清池樣本共8份，其中4份來自HPH組大鼠(編號分別為H-1、H-2、H-3、H-4)，另外4份來自對照組大鼠(編號分別為C-1、C-2、C-3、C-4)。本實驗用經過10次重復的探針點信號的CV值計算芯片和技術的穩定性，芯片樣本符合Agilent芯片質控標準(CV值<15%，平均小于10%)。

聚類分析結果顯示，血清中差異化表達的循環miRNA可以明確地將8份樣本區分為HPH組和對照組(圖1)。其中，與對照組比較，HPH組大鼠13種miRNA表達上調，10種miRNA表達下調(圖2)。

圖18個血清池樣本循環miRNA表達的聚類分析(P<0.05)

Fig.1 Circulating miRNAs of 8 serum pool samples profiled using cluster analysis (P<0.05)

紅綠色階表明miRNA的表達量由低(綠色)到高(紅色)的變化。

圖223種差異化表達miRNAs及其倍數變化

Fig.2 Fold change of 23 differentially expressed miRNAs

2.4候選miRNA熒光定量PCR的檢測結果根據FC>2，P<0.05的閾值標準，對基因芯片篩選的6種候選miRNA進行熒光定量PCR的驗證。結果顯示，除miR-455、miR-455-5P外，miR-451、miR-505、let-7d及miR-214的PCR結果與基因芯片結果基本一致(圖3)。

圖36種差異化表達miRNAs PCR結果與芯片結果一致性的比較

Fig.3 Consistence comparison between PCR and microarray of 6 differentially expressed miRNAs

*基因芯片檢測出倍數差異>5倍，其中miR-505、miR-455和miR-455-5P的倍數差異分別為22.67倍、7.14倍和100倍以上。

2.5差異化表達miRNA的ROC曲線分析結果為探討差異化表達miRNA的意義，本文采用ROC曲線分析方法測試了4種差異化表達miRNA對HPH組及對照組的鑒別效能。除miR-214在兩組間△Ct值比較的P值>0.05外，miR-451、miR-505、let-7d的P值均<0.01，且用于鑒別HPH組和對照組的曲線下面積(area under curve，AUC)均大于0.9。通過最佳cut-off值分析，得到這3種miRNA的敏感性和特異性分別為91.67%和91.67%、75%和91.67%、100%和91.67%(圖4)。

圖4miR-451(A)、miR-505(B)、let-7d(C)及miR-214(D)對HPH組及對照組的鑒別效能

Fig.4 ROC curve analysis of miR-451 (A), miR-505 (B), let-7d (C) and miR-214 (D) in distinguishing different groups

3討論

多項研究表明，循環miRNA的表達可隨人體生理病理狀況、疾病進程等的不同而發生變化，進而可能為不同疾病的診斷、病程管理等提供新的參考[3-8]。

循環miRNA作為肺動脈高壓的標志物已有研究。RHODES等[9]通過基因芯片技術篩選了8名肺動脈血壓患者和8名健康對照志愿者的血漿總RNA中miRNA表達的變化，之后通過PCR技術證實miR-150表達水平減低，并進一步證實miR-150水平是獨立于年齡、6 min步行距離、病程、紅細胞分布寬度等的肺動脈血壓預后標志物。WEI等[10]通過基因芯片和熒光定量PCR等技術對肺動脈高壓患者血漿miRNA表達情況進行了研究，發現了幾種具有潛在診斷價值的miRNA。

大量研究表明，低壓低氧能夠誘發一系列機體應激反應。本研究應用基因芯片技術，篩選到HPH組和常氧對照組大鼠血清差異化表達的miRNAs 23種，其中上調的miRNA為13種，表達量下調的miRNA為10種，而后選取了6種miRNAs進行了熒光定量PCR驗證，結果顯示PCR定量結果與基因芯片結果基本一致，證實HPH組與對照組大鼠血清miRNAs表達譜存在顯著差異。ROC曲線分析表明，miR-451、miR-505及let-7d用于鑒別HPH組大鼠和對照組大鼠的AUC均大于0.9，通過最佳cut-off值分析，得到這3種miRNA的敏感性和特異性分別為91.67%和91.67%、75%和91.67%、100%和91.67%，說明此3種miRNA對于HPH組及對照組的鑒別診斷可能具有較高的敏感性和特異性。

結合之前的研究，GRANT等[11]評估了miR-451在肺動脈高壓病程發展中的作用，其表達上調，進而促進肺動脈平滑肌細胞遷移，這可能是導致肺動脈高壓早期血管肌化作用增強的原因之一。YANG等[12]研究發現，miR-505能夠抑制內皮細胞的遷移功能和管腔形成功能，在血管生成過程中也發揮一定程度的作用，而血管生成功能受損可能導致外周循環阻力增加進而引起血壓升高。而let-7d能夠影響血管平滑肌細胞增生[13]，miR-214能夠調控內皮細胞遷移和血管生成[14]。這些研究提示miR-451、miR-505、let-7d和miR-214可能參與了HPH的病程發展，進而導致了血清中的差異化表達。

總之，本文率先研究發現低壓低氧暴露條件下HPH大鼠相對于常氧狀態下大鼠存在差異化循環miRNA表達譜，可能為低氧暴露條件下HPH的診斷提供新思路。然而，本實驗僅基于動物模型對循環miRNA表達做了初步的研究，其中，對于“差異化表達miRNA的組織細胞來源”、“本實驗篩選出的3種循環miRNA是否可真正作為HPH的診斷標志物”等問題，尚需擴大樣本做進一步研究。

參考文獻：

[1] WEBER JA, BAXTER DH, ZHANG S, et al. The microRNA spectrum in 12 body fluids[J]. Clin Chem, 2010, 56(11):1733-1741.

[2] CHEN X, BA Y, MA L, et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J]. Cell Res, 2008, 18(10):997-1006.

[3] GUI J, TIAN Y, WEN X, et al. Serum microRNA characterization identifies miR-885-5p as a potential marker for detecting liver pathologies[J]. Clin Sci (Lond), 2011, 120(5):183-193.

[4] YANG IP, TSAI HL, HUANG CW, et al. The functional significance of microRNA-29c in patients with colorectal cancer: a potential circulating biomarker for predicting early relapse[J]. PLoS One, 2013, 8(6):e66842.

[5] BALA S, TILAHUN Y, TAHA O, et al. Increased microRNA-155 expression in the serum and peripheral monocytes in chronic HCV infection[J]. J Transl Med, 2012, 10(1):151.

[6] 黃婷，楊桂玲. MicroRNA-21在急性髓系白血病骨髓細胞中的異常表達及意義[J].西安交通大學學報(醫學版), 2016, 37(1):98-102.

[7] 張銘，趙朝，李曉利，等. 胰腺癌患者血漿中microRNA-100水平的測定及臨床意義[J]. 川北醫學院學報, 2015, 30(5):600-603.

[8] 季玉陳，李妍，胡京霞，等. 膠質瘤組織中microRNA-200a的表達及其與患者預后的關系[J]. 鄭州大學學報(醫學版), 2016, 51(1):105-108.

[9] RHODES CJ, WHARTON J, BOON RA, et al. Reduced microRNA-150 is associated with poor survival in pulmonary arterial hypertension[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187(3):294-302.

[10] WEI C, HENDERSON H, SPRADLEY C, et al. Circulating miRNAs as potential marker for pulmonary hypertension[J]. PLoS One, 2013, 8(5):e64396.

[11] GRANT JS, MORECROFT I, DEMPSIE Y, et al. Transient but not genetic loss of miR-451 is protective in the development of pulmonary arterial hypertension[J]. Pulm Circ, 2013, 3(4):840-850.

[12] YANG Q, JIA C, WANG P, et al. MicroRNA-505 identified from patients with essential hypertension impairs endothelial cell migration and tube formation[J]. Int J Cardiol, 2014, 177(3):925-934.

[13] YU ML, WANG JF, WANG GK, et al. Vascular smooth muscle cell proliferation is influenced by let-7d microRNA and its interaction with KRAS[J]. Circ J, 2011, 75(3):703-709.

[14] VANBALKOM BW, DEJONG OG, SMITS M, et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells[J]. Blood, 2013, 121(19):3997-4006, S1-S15.

(編輯韓維棟)

收稿日期：2015-11-29修回日期：2016-03-15

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(No.2015211C233)

通訊作者：桂俊豪. E-mail: Junhaog@gmail.com；余伍忠. E-mail: yuwz2013@126.com

中圖分類號：R446.1

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604017

The expression and significance of circulating microRNA of rats with hypobaric hypoxia-induced pulmonary hypertension

XU Jiao-yang1,2, SI Ma-ling2, SHI Wen-hui2, FU Yong2,LIU Jiang-wei2, ZHOU Jin2, YU Wu-zhong2, GUI Jun-hao2

(1. Clinical Laboratory, Kaifeng Central Hospital, Kaifeng 475000;2. Urumqi General Hospital of Lanzhou Military Command, Urumqi 830000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expression of circulating microRNA (miRNA) of rats with hypobaric hypoxia-induced pulmonary hypertension (HPH). MethodsCommercial rat miRNA microarray was employed to detect and analyze the circulating miRNA profile in the serum samples of Sprague-Dawley rats with hypobaric hypoxia-induced HPH and controls. Furthermore, differentially expressed candidate circulating miRNAs between HPH and control groups were validated by Real-time quantitative PCR based on the case-control study, and receiver operating characteristic curve (ROC) analysis was used to test the performance of four differentially expressed circulating miRNAs in discriminating HPH and control groups. ResultsCompared with those in the control group, 13 upregulated miRNAs and 10 downregulated miRNAs were identified in hypobaric hypoxia-induced HPH rats by using miRNA microarray. And differentially expressed miR-451, miR-505, let-7d and miR-214 were validated by using RT-PCR. ROC analysis showed that the area under the curve of miR-451, miR-505 and let-7d was 0.979, 0.938 and 0.993 in discriminating HPH and control groups, respectively. ConclusionThe aberrant expression of circulating miR-451, miR-505 and let-7d in serum may be correlated with the pathogenesis of HPH.

KEY WORDS:hypoxic pulmonary hypertension; circulating miRNA; microarray; RT-qPCR

Supported by the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region (No.2015211C233)

優先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160615.1029.016.html(2016-06-15)