食品致癌物雜環胺的生物標記物的研究進展

彭利娟

(武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023)

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食品致癌物雜環胺的生物標記物的研究進展

彭利娟

(武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023)

摘要：高溫烹調加工肉類食品過程中所產生的雜環胺(HAAs)是一類具有致突變，致癌作用的物質。相關流行病研究顯示，長期攝入高溫烹調的、富含HAAs的肉類食物，提升了前列腺癌、乳腺癌、腸癌的患病風險。但現有研究成果尚不能對HAAs的攝入與相關癌癥風險的關系進行有效評估。尋找長效、穩定的生物標記物并建立高選擇性、高靈敏度的檢測方法是該項研究的關鍵所在。本綜述著重討論了可能應用于分子流行病學研究中HAAs的生物標記物，包括HAAs、HAA的代謝物、DNA加合物和蛋白質加合物。同時也對用于HAAs生物監控的分析方法進行了討論。

關鍵詞：雜環胺；致癌物；生物標記物；代謝物；加合物

1引言

在魚肉、紅肉、禽肉的高溫烹飪處理過程中所產生的雜環胺(heterocyclic aromatic amines, HAAs)是一類之于人類及鋸齒類動物具有致突變、致癌變作用的多環芳香族化合物。上世紀七十年代末，科學家Sugimura最先在熟魚肉中發現了致突變物[1-2]。而迄今為止已有20余種HAAs在烹制后的肉食里被發現和研究。這些HAAs分為兩大類(見圖1)。第一類HAAs是分子結構中含有N-甲基-2-氨基咪唑基團，包括喹啉類(如：2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉，IQ))，喹喔類(如:2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉，IQx))和2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP)等，被認為是氨基酸熱降解產物吡啶或吡嗪與糖類及肌酸的反應產物，通常是在150―250℃的加工溫度下產生[3]；第二類HAAs包括2-氨基-9H-吡啶[2，3-b]吲哚(AαC)和2-氨基3-甲基-9H-吡啶[2，3-b]吲哚(MeAαC)等,一般在250℃以上的高溫下生成，是蛋白質中谷氨酸和色氨酸的熱分解產物[4]。HAAs產生的多寡取決于肉的品種，烹制的時間和溫度等。PhIP和2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[ 4 , 5 -f〗喹喔啉(MeIQx)是煎烤紅肉時產生最多的兩種HAAs[5-7]。有研究顯示每克完全煮熟的豬肉里所含的PhIP可以高達480ng[6]?；趯H上HAAs毒理數據的采集與匯總，國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC)已將IQ歸類為很可疑致癌物(2A級)，而其他幾種包括PhIP和MeIQx在內的HAAs則被定義為潛在類致癌物(2B級)[8]。而美國國家毒理學項目(National Toxicology Program)也在第11期致癌物報告(Report on Carcinogenesis, ROC)中將常見的HAAs合理地預測為人類致癌物[9]。

早期對于肉制品中HAAs的定性和定量分析是使用多級層析法將HAAs從公斤級的熟肉中分離提純出來。每一步的純化均用Ames細菌致突變測試法對突變物進行監控，最后使用NMR和質譜對分離出的致突變物進行結構定性[1]。但是這類研究方法非常耗費人力。1992年，Gross使用硅基樹脂和混合陽離子交換/疏水樹脂發展了多級固相萃取的方法對肉制品中的HAAs進行提取，提取出的HAAs經HPLC進一步分離后進行UV或熒光定量[10]。這一方法樣品用量少、分析速度快、檢測靈敏度高。近年來多級固相萃取方法已被廣泛運用于各類肉制品中HAAs的提取。在結合使用液相色譜-多級質譜聯用技術(LC-MS/MS)后，實現了對熟肉中超微量的HAAs(pg/g)進行定量檢測[11]。

圖1　HAAs的化學結構

目前國際上對HAAs的研究全面且深入，包括生物毒理的研究、分離提純方法的優化、在各種肉食制品中含量的測定、不同加工方式和條件的影響、生物代謝方式、攝入量與致癌風險的關系等。

2HAAs的生物毒性和致癌機理

早期HAAs的生物毒性是使用Ames細菌致突變測試法進行致突變性測定。Ames細菌致突變測試法中，鼠傷寒沙門氏桿菌TA98菌株用于檢測移碼突變，而TAl00 菌株是檢測堿基對改變突變。Ames鼠傷寒沙門氏桿菌試驗顯示HAAs更易導致移碼突變，不同HAAs的致突變能力可相差上千倍。其中IQ和MeIQ是非常強的致突變物。但使用Ames測試法評估HAAs的致癌風險并不準確。例如，Ames測試顯示MeIQx的致突變能力強過PhIP約100倍。但它們對于鋸齒動物來說都是非常強的致癌物。長期喂食同等劑量的MeIQx和PhIP均誘發鋸齒動物多部位的腫瘤[1]。

動物實驗發現長期攝入HAAs可誘發鋸齒動物口腔、肝臟、胃、肺、結直腸、膀胱、前列腺和乳腺等多種靶器官的腫瘤。各種HAA誘發腫瘤的總投喂量(TD50)差異很大，同種HAA對于不同種類動物的TD50也有差別。已有報道顯示各HAA對鋸齒動物的TD50在0.1―64.6 mg/kg/day[1]。

在研究HAAs對人類的風險時發現，HAAs會引發姐妹染色單體交換，微核形成和非常規DNA合成；同時鋸齒動物體內實驗及人細胞和鋸齒動物細胞體外實驗顯示有些HAA可引發DNA的損傷和染色體的畸變[8，12]。人體內的HAAs在酶細胞色素P450的作用下N-羥基化，N-羥基化的HAA代謝物(HONH-HAA)再經二期酶N-乙酰轉移酶(N-acetyltransferases, NATs)或硫轉移酶(sulfotransferases, SULTs)的進一步激活產生nitrenium離子與DNA反應，誘發變異[13]。以PhIP為例示意如圖2。

圖2　PhIP在人體內的主要代謝途徑

3生物標記物

現有流行病學研究的數據尚不足以對癌癥和HAAs攝取之間的關系進行有效評估。有研究報告證實長期食用煮熟的肉類(含HAAs的肉制品)提高了患胃癌，結腸癌，胰腺癌，前列腺癌和乳腺癌的風險；但也有研究表明熟肉與癌癥風險之間并不存在直接關聯[14-20]。熟肉中產生的HAAs與癌癥風險之間的聯系之所以一直難以確定，一個最大的制約因素在于無法對長期攝入的HAAs做定量評估。因而確立穩定的、長期的生物標記物對于研究HAAs攝取與癌癥風險關系的至關重要。

3.1HAAs在尿液中的代謝物

尿液樣品通?？色@取量較其他生物樣本(如組織，血液，毛發等)多，其中所攜帶的致癌物及其代謝產物可在提取富集后用于對短期內相關致癌物攝入情況的評估。同時通過對致癌物的尿代謝物組成和結構的分析，可進一步了解致癌物在人體內的相關生物活化程度。

HAAs在尿液中主要是以其代謝物的形式存在。因為煎烤烹制的紅肉中PhIP和MeIQx含量最多，所以早期對尿液代謝物的研究主要集中于這兩種HAAs。PhIP在人尿中的主要代謝物是PhIP的N2-和N3-葡萄糖苷酸聚合物(PhIP-N2-Gl, PhIP-N3-Gl)和HONH-PhIP的N-葡萄糖苷酸聚合物(HON-PhIP-N2-Gl，HON-PhIP-N3-Gl)[21-22]。MeIQx的主要尿代謝物是MeIQx的氨基磺酸鹽(MeIQx-N2-SO3H)、IQx-8-COOH, MeIQx的N2-葡萄糖苷酸聚合物(MeIQx-N2-Gl)，和HONH-MeIQx的N3-葡萄糖苷酸聚合物(HON-MeIQx-N3-Gl)[23-24](見圖3)。這些代謝物主要是在葡糖醛酸基轉移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGTs)、酶細胞色素P450和SULTs的作用下產生。

圖3　PhIP和MeIQx的主要代謝物

目前從尿液中分離HAAs及其代謝物的分析方法包括：溶劑萃取[25]，固相萃取(SPE)[26]，免疫親和[27]等。分離好的相關代謝物配合使用熒光，氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)或LC-MS/MS進行定性定量分析。Gu等人使用SPE分離方法與超高效液相色譜-質譜聯用技術(UPLC-MS)所建立的快速、高靈敏度的分析方法在測量PhIP和MeIQx的代謝物時，定量限低至10―40 pg/mL[28]。通常情況下人們攝入的HAAs大部分在24―48h內隨尿液排出，所以尿液中所檢測到的HAAs含量只能反映短期內HAAs的攝入情況。對比相關研究，不同個體的尿液中所檢測到的HAAs含量差異特別大，這很可能是因為人們的吃食中所含HAAs的量存在差異[29-31]。

3.2毛發中HAAs

人和動物的毛發中已發現多種藥物和污染物累積。人和動物的毛發已用于對尼古丁、麻醉劑和荷爾蒙等化合物的生物監控。動物實驗發現PhIP在黑色素多的組織里沉積，標記的PhIP在攝入后4周還可以在毛發中檢測到[25]。在6個月期間對兩個雜食者的頭發樣本進行定期采集和分析發現，頭發中PhIP的含量分別是407―545和669―855pg/g期[32]。不同時間測量的偏差小于24%，這說明PhIP的攝入與其在頭發中的累積相對穩定。因而毛發里HAAs可用作生物標記物對長期的HAAs攝入情況進行評估。

PhIP是在頭發中沉積最多的HAA，通常含量在60―7 500 pg/g。目前對于這么微量的HAAs的檢測主要是選用高靈敏度的質譜手段結合各類萃取技術來進行。Alexander等人使用GC-MS對人發中的PhIP進行檢測[25]；而Kobayashi建立了LC-MS方法對人發中的PhIP進行定量[33]。這兩種方法都需要上百毫克的頭發樣品。近期的研究通過同時使用溶劑萃取和固相萃取方法對頭發中的HAAs進行分離，然后使用LC-MS/MS定量。該方法的頭發樣本用量只需50 mg, 定量限為50 pg/g[32]。使用該方法所檢測到的PhIP含量與前兩種方法相近。但是發現所測樣本的AaC和MeIQx均低于定量限。

在檢測人發中的PhIP時發現色素對PhIP有很強的親和性，色素含量高的頭發(深色頭發)更利于PhIP的沉積。所以定量不同顏色頭發中的PhIP來評估PhIP的長期攝入情況時應考慮這一因素?，F代社會越來越多的人熱衷于染發。使用染發劑進行染發的過程中，頭發中累積的PhIP很可能會發生化學反應變化，導致其含量減少；同時染發劑中大量的化學物質可能進入頭發中，這些化合物的存在會對PhIP的分離和檢測產生極大的干擾，從而影響檢測的靈敏度。近期高分辨率的Orbitrap質譜技術被用于對染色頭發中的PhIP分析。該方法采用多級質譜手段消減染色劑化合物對PhIP檢測的干擾。在對染色頭發中的PhIP進行測量時，定量限達到84 pg/g[34]。

3.3DNA-HAA 加合物

HAAs與DNA的反應主要是通過HAAs的N-羥基化代謝物(HONH-HAAs)酯化后所產生的中間體nitrenium離子與脫氧鳥苷(dG)上C-8原子反應生成dG-C8-HAA加合物。實驗室合成DNA-HAA加合物是使用乙烯酮或者乙酸酐作為?；瘎┡cHONH-HAA反應生成易形成nitrenium離子的活性N-乙?；?HAA中間體[35-37]。N-乙?；?HAA非常不穩定，目前只有N-乙?；?PhIP通過質譜確定了分子結構[36]。體內和體外實驗現已合成及檢測到包括PhIP[36], IQ[37]，MeIQ[38]， MeIQx[39]，2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(4,8-DiMeIQx)[40], AαC和MeAαC[41]的dG-C8加合物(見圖4)。

圖4　DNA-HAA加合物的結構

體內和體外實驗發現IQ與MeIQx雜環上的C-5原子也會與dG上的N2基團反應形成dG-N2加合物[39]。在使用dG或脫氧腺苷(dA)與N-乙?；?IQ進行反應時生成了dG-N7-IQ和dA-N6-IQ加合物[42]。動物實驗中發現老鼠的肝臟里有dA-N6-MeIQx加合物的存在[43]。

從理論上來說，選擇標靶組織中DNA加合物作為生物標記物去評估HAAs的致癌風險最為直接、合理。目前研究所用到的人體組織樣本經常是臨床診斷過程中從患者體內所切除的病變組織。在進行檢測分析時，一般假定病變組織中加合物的含量可反映癌變形成初期組織里加合物的含量。對于人體組織樣本中DNA-HAA加合物含量的測定, 目前主要運用的技術手段包括32P-postlabeling, 免疫組織化技術(IHC)和質譜技術。

32P-postlabeling技術在檢測DNA-HAA加合物方面非常靈敏。Totsuka等人使用該方法在人的直腸、結腸和腎臟中分別檢測到含量為14，18和1.8個dG-C8-MeIQx加合物/1010核苷酸[44]。大部分乳腺癌產生于導管上皮細胞。Gorlewska-Roberts等人使用32P-postlabeling技術方法對剝落在人乳里面的導管上皮細胞中的DNA加合物進行了分析，64個來自于健康、不吸煙母親的樣本中有31個樣本里檢測到了DNA-PhIP加合物，平均含量在4.7個加合物/107核苷酸[45]。數據證實人們對熟肉的消耗量和NAT2都對DNA-PhIP的形成有潛在的影響。

人的乳腺組織中也發現了DNA-PhIP加合物。這一研究應用了IHC手段對乳腺癌患者和非乳腺癌患者的正常乳腺組織進行了分析檢測，分別在82%的乳腺癌患者和71%非乳腺癌患者的組織樣本中發現了DNA-PhIP加合物，含量高于1個加合物/107堿基[46]。

GC-MS方法檢測DNA-HAA加合物是通過對在堿性環境下不穩定的dG-C8-HAA加合物水解后產生的HAAs進行定量。使用該方法對腸粘膜樣本和腸癌患者的淋巴細胞樣本進行分析發現每108個DNA堿基中的加合物在幾個范圍以內。其中30%的淋巴細胞樣本中檢測到dG-C8-PhIP加合物。比較吸煙者、食肉多的人、和食肉少的人的淋巴樣本，并未發現前二者加合物的含量明顯高過后者[47]。由于該項研究沒有個體的實際PhIP攝入量信息，因而無法確定DNA-PhIP加合物形成與PhIP攝入之間的關系。

上述的幾種檢測方法都不能準確提供DNA加合物的結構信息。近年來高選擇性，高靈敏度液相色譜質譜聯用技術(LC-MS)發展迅猛，可以對人組織樣本中的DNA加合物進行準確結構定性和含量分析。Gu等人使用該方法對乳腺癌患者的乳腺組織中的DNA-PhIP加合物進行了分析，數據顯示70個組織樣本中，只有一個樣本檢測到了dG-C8-PhIP加合物，其含量為3個加合物/109核苷酸[48]。這一含量遠低于32P-postlabeling和IHC方法檢測到的含量(差兩個數量級)。這表明非選擇性的32P-postlabeling和IHC方法可能檢測到了除dG-C8-PhIP加合物以外的DNA損傷。因此，對dG-C8-HAA或其他已知結構的加合物應選用LC-MS進行有選擇性的定量分析。

3.4蛋白質-HAA 加合物

由于檢測人體組織中的DNA加合物需要大批量的活檢標本通常難以獲得；同時DNA加合物在形成后經常會被修復，因此人體組織中DNA加合物的含量可能極低，即使運用現今高靈敏度的檢測手段也可能難以進行有效的定量分析。近年來已有研究采用血紅蛋白(Hb)及血清白蛋白(SA)與致癌物形成的加合物取代DNA加合物作為生物標記物對幾類致癌物質進行生物監控[49-52]。相較于DNA加合物，蛋白質加合物作為生物標記物的優勢在于：(1)血液中能提取的蛋白質量遠大于DNA的量。10 mL人血中可提取DNA的量只有100 μg左右，而Hb或SA的提取量高達幾百毫克。相應地，能獲取到的蛋白質加合物也就更多。(2)蛋白質加合物不會被修復。在蛋白質加合物穩定的情況下，長期攝入致癌物所形成的蛋白質加合物將在蛋白質的生命周期內進行積累。人Hb的生命周期為120天，如果長期攝入致癌物，人體內蛋白質加合物含量將是單次攝入的60倍。這將大大提高加合物檢測的靈敏度[49]。但在選用蛋白質加合物作為生物標記物研究癌癥風險時，需要考慮蛋白質加合物并不表征基因損傷情況，也不是產生于標靶位置。

在過去的三十年中，Hb和SA與多類不同的人體致癌物所形成的加合物已替代DNA加合物，被用作人體生物標記物對相關致癌物進行生物監控。多種芳香胺在人和實驗室動物體內與Hb形成了Hb-芳香胺加合物。通過對吸煙和不吸煙人群體內Hb-芳香胺加合物進行檢測，發現這種生物標記物與膀胱癌有很強的關聯性[53-54]。HAAs與Hb加合物的形成是通過其N-氧化代謝物先與氧合血紅蛋白(HbO2)反應生成N-亞硝化代謝物和高鐵血紅蛋白(met-Hb)，然后該N-亞硝化代謝物與Hb的β鏈上第93位的半胱氨酸(Cys93)反應形成加合物。近期有體外實驗研究顯示AαC的N-羥基化代謝物(HONH-AαC)可引發高鐵血紅蛋白癥，并產生Hb-AαC加合物。但PhIP和MeIOx的N-羥基化代謝物HONH-PhIP和HONH-MeIOx并沒有與HbO2反應產生加合物[55]。 Glu-P-1的N-羥基化代謝物和N-亞硝化代謝物也證實與Hb上的巰基反應[56]。而動物實驗顯示包括IQ、 MeIQx和PhIP在內的幾種HAAs在攝入后，只有很少的一部分(約攝入量的0.01%)與動物體內的Hb反應產生蛋白質加合物[57-59]。這些Hb-HAA加合物在人體內含量過低，無法進行定量檢測[60]。因而選用人體內的Hb-HAA加合物作為致癌物HAAs的生物標記物可能并不理想。

SA具有結合和運輸內源性與外源性物質，維持血液膠體滲透壓，清除自由基，抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能，在生命過程中有極其重要的意義。SA的肽鏈包含585個氨基酸，是血漿中含量最高的蛋白質，約占血漿總蛋白的60%。研究顯示SA與氰化物，氮芥，神經毒素雙鞭甲藻毒素B等多種有毒、致癌試劑生成蛋白質加合物[61-63]。SA的Cys34上擁有整個蛋白質肽鏈上唯一的自由巰基(-SH)。大量研究證實這一自由巰基對各種毒性化合物的代謝產物具有反應活性。包括IQ、MeIOx和PhIP在內的幾種HAAs與鋸齒類動物的SA或人血清白蛋白(HSA)上的Cys34發生反應形成SA-HAA加合物[60, 64-65]。這類SA-HAA加合物在酸性環境下不穩定，易水解釋放HAAs。近期的體外實驗證實了這些加合物是HAA的代謝物通過亞磺酰胺形式鏈接于SA的Cys34上而形成[66]。SA-HAA加合物在體內形成的過程以PhIP為例: 首先PhIP的N-氧化代謝物HONH-PhIP在細胞色素P450酶或過渡金屬的作用下氧化生成N-亞硝化代謝物(NO-PhIP), NO-PhIP能與SA上的Cys34結合形成蛋白質加合物(圖5)。

圖5　PhIP代謝物與SA反應形成的SA-PhIP加合物 (ROS：活性氧化物)

加速器質譜(Accelerated Mass Spectrometry, AMS)檢測方法發現人血中HSA-PhIP加合物的含量遠高于HSA-MeIQx加合物。人血中每毫克HSA所含的HSA-PhIP加合物量在飛摩爾級(fmol), 食肉人群血液中的加合物的含量是素食人群的10倍[60]。UPLC-MS檢測方法對HSA-PhIP加合物的檢測定量限可達300 fmol /mg HSA[67]。但對于臨床血樣的檢測, 這一方法還需要進一步優化。

4結束語

近年來高分辨率，高靈敏度LC-MS技術的迅速發展，實現了對人體內HAAs的代謝產物、DNA加合物和蛋白質加合物的定性和定量分析。通過檢測尿液中HAAs代謝物可了解HAAs在人體內的活化程度和短期內個體對HAAs的攝入情況。頭發中沉積的HAAs可提供個體在長時間內對HAAs的攝入情況。相關實驗顯示HAAs與血漿中的SA及白細胞中的DNA所形成的加合物可用做生物標記物研究HAAs的攝入與相關癌癥風險之間的關系。在流行病學研究中，對這些HAAs的生物標記物進行監控，有助于對HAAs的致癌風險進行合理評估。

參考文獻：

[1]Sugimura T, Wakabayashi K, Nakagama H, et al. Heterocyclic amines: Mutagens/carcinogens produced during cooking of meat and fish[J]. Cancer Sci, 2004,95: 290-299.

[2]Turesky R J. The role of genetic polymorphisms in metabolism of carcinogenic heterocyclic aromatic amines[J]. Current drug metabolism, 2004,5: 169-180.

[3]Skog K I, Johansson M A, Jagerstad M I. Carcinogenic heterocyclic amines in model systems and cooked foods: a review on formation, occurrence and intake[J]. Food Chem Toxicol, 1998,36: 879-896.

[4]Matsumoto T, Yoshida D, Tomita H. Determination of mutagens, amino-alphacarbolines in grilled foods and cigarette smoke condensate[J]. Cancer Lett, 1981, 12: 105-110.

[5]Guy P A, Gremaud E, Richoz J, et al. Quantitative analysis of mutagenic heterocyclic aromatic amines in cooked meat using liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr A ,2000, 883: 89-102.

[6]Felton J S,Jagerstad M,Knize M G,et al. Food Borne Carcinogens Heterocyclic Amines [M]. Chichester, England: John Wiley & Sons Ltd., 2000:31-71.

[7]Turesky R J, Taylor J, Schnackenberg L, et al. Quantitation of carcinogenic heterocyclic aromatic amines and detection of novel heterocyclic aromatic amines in cooked meats and grill scrapings by HPLC/ESI-MS[J]. J Agric Food Chem, 2005, 53:3248-3258.

[8]International Agency for Research on Cancer. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans[R]. Lyon, France: IARC, 1993:165-242.

[9]National Toxicology Program. Report on Carcinogenesis(Eleventh Edition)[R]. Research Triangle Park, N.C.: U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, 2005.

[10]Gross G A, Gruter A. Quantitation of mutagenic/carcinogenic heterocyclic aromatic amines in food products[J]. J Chromatogr,1992, 592: 271-278.

[11]Ni W, McNaughton L, LeMaster D M, et al. Quantitation of 13 heterocyclic aromatic amines in cooked beef, pork, and chicken by liquid chromatography-electrospray ionization/tandem mass spectrometry[J]. J Agric Food Chem,2008, 56(1):68-78.

[12]National Toxicology Program. Report on Carcinogenesis Background Document for Heterocyclic Amines: PhIP, MeIQ and MeIQx[R]. Research Triangle Park, N.C.: U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, 2002.

[13]Turesky R J, Le Marchand L. Metabolism and biomarkers of heterocyclic aromatic amines in molecular epidemiology studies: lessons learned from aromatic amines[J]. Chem Res Toxicol, 2011, 24:1169-1214.

[14]Augustsson K, Skog K, Jagerstad M, et al. Dietary heterocyclic amines and cancer of the colon, rectum, bladder, and kidney: a population-based study[J].Lancet, 1999, 353(9154): 703-707.

[15]Alaejos M S, Gonzalez V, Afonso A M. Exposure to heterocyclic aromatic amines from the consumption of cooked red meat and its effect on human cancer risk: a review[J]. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess,2008, 25: 2-24.

[16]De Stefani E, Ronco A, Mendilaharsu M, et al. Meat intake, heterocyclic amines, and risk of breast cancer: a case-control study in Uruguay[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev ,1997, 6(8), 573-581.

[17]Delfino R J, Sinha R, Smith C, et al. Breast cancer, heterocyclic aromatic amines from meat and N-acetyltransferase 2 genotype[J]. Carcinogenesis ,2000, 21(4):607-615.

[18]Sinha R. An epidemiologic approach to studying heterocyclic amines[J]. Mutat Res,2002, 506-507:197-204.

[19]Knize M G, Felton J S. Formation and human risk of carcinogenic heterocyclic amines formed from natural precursors in meat[J]. Nutr Rev,2005,63(5):158-165.

[20]Zheng W, Lee S A. (2009) Well-done meat intake, heterocyclic amine exposure, and cancer risk[J]. Nutr Cancer, 2005, 61:437-446.

[21]Kulp K S,Knize M G,Fowler N D,et al. PhIP metabolites in human urine after consumption of wellcooked chicken[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2004, 802:143-153.

[22]Walters D G,Young P J, Agus C,et al. Cruciferous vegetable consumption alters the metabolism of the dietary carcinogen 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP) in humans [J]. Carcinogenesis ,2004, 25:1659-1669.

[23]Turesky R J, Garner R C, Welti D H, et al.Metabolism of the food-borne mutagen 2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline in humans[J]. Chem Res Toxicol,1998, 11: 217-225.

[24]Turesky R J,Guengerich F P,Guillouzo A, et al. Metabolism of heterocyclic aromatic amines by human hepatocytes and cytochrome P4501A2[J]. Mutat Res,2002, 506-507:187-195.

[25]Alexander J, Reistad R, Hegstad S, et al. Biomarkers of exposure to heterocyclic amines: approaches to improve the exposure assessment[J]. Food Chem Toxicol,2002, 40: 1131-1137.

[26]Holland R D, Taylor J, Schoenbachler L, et al. Rapid biomonitoring of heterocyclic aromatic amines in human urine by tandem solvent solid phase extraction liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry[J]. Chem Res Toxicol, 2004, 17:1121-1136.

[27]Stillwell W G, Kidd L C,Wishnok J S,et al. Urinary excretion of unmetabolized and phase II conjugates of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine and 2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline in humans: Relationship to cytochrome P450 1A2 and N-acetyltransferase actvity[J]. Cancer Res,1997, 57: 3457-3464.

[28]Gu D, Raymundo M M, Kadlubar F F,et al. Ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for biomonitoring cooked meat carcinogens and their metabolites in human urine[J]. Anal Chem,2011, 83(3):1093-101.

[29]Ushiyama H, Wakabayashi K, Hirose M, et al. Presence of carcinogenic heterocyclic amines in urine of healthy volunteers eating normal diet, but not of inpatients receiving parenteral alimentation[J]. Carcinogenesis ,1991, 12: 1417-1422.

[30]Ji H,Yu M C, Stillwell W G, et al. Urinary excretion of 2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline in white, black, and Asian men in Los Angeles County[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1994, 3: 407-411.

[31]Kidd L C, Stillwell W G., Yu M C, et al. Urinary excretion of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine(PhIP) in White, African-American, and Asian-Americanmen in Los Angeles County[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1999, 8: 439-445.

[32]Bessette E E, Yasa I, Dunbar D, et al. Biomonitoring of carcinogenic heterocyclic aromatic amines in hair: a validation study[J]. Chem Res Toxicol,2009, 22(8):1454-63.

[33]Kobayashi M, Hanaoka T, Hashimoto H,et al. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine(PhIP) level in human hair as biomarkers for dietary grilled/stir-fried meat and fish intake[J]. Mutat Res,2005, 588:136-142.

[34]Guo J, Yonemori K, Le Marchand L,et al. Method to Biomonitor the Cooked Meat Carcinogen 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine in Dyed Hair by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Orbitrap High Resolution Multistage Mass Spectrometry[J]. Anal Chem,2015, 87(12):5872-5877.

[35]Turesky R J, Lang N P, Butler M A, et al. Metabolic activation of carcinogenic heterocyclic aromatic amines by human liver and colon[J]. Carcinogenesis,1991, 12:1839-1845.

[36]Frandsen H, Grivas S, Andersson R, et al. Reaction of the N2-acetoxy derivative of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine(PhIP) with 20-deoxyguanosine and DNA. Synthesis and identification of N2-(20-deoxyguanosin-8-yl)-PhIP[J]. Carcinogenesis ,1992, 13: 629-635.

[37]Snyderwine E G., Roller P P, Adamson R Het al. Reaction of the N-hydroxylamine and N-acetoxy derivatives of 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline with DNA. Synthesis and identification of N-(deoxyguanosin-8-yl)-IQ[J]. Carcinogenesis,1988, 9:1061-1065.

[38]Tada A,Ochiai M,Wakabayashi K,et al. Identification of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]quinoline(dG-C8-MeIQ) as a major adduct formed by MeIQ with nucleotides in vitro with DNA in vivo[J]. Carcinogenesis ,1994, 15:1275-1278.

[39]Turesky R J, Rossi S C, Welti D H, et al. Characterization of DNA adducts formed in vitro by reaction of N-hydroxy-2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline and N-hydroxy-2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline at the C-8 and N2atoms of guanine[J]. Chem Res Toxicol,1992, 5: 479-490.

[40]Frandsen H,Grivas S,Turesky R J,et al. Formation of DNA adducts by the food mutagen 2-amino-3,4,8-trimethyl-3H-imidazo[4,5-f]quinoxaline in vitro and in vivo. Identification of a N2-(2’-deoxyguanosin-8-yl)-4,8-DiMeIQx adduct[J]. Carcinogenesis,1994, 15: 2553-2558.

[41]Frederiksen H,Frandsen H, Pfau W. Syntheses of DNA-adducts of two heterocyclic amines, 2-amino-3-methyl-9Hpyrido[2,3-b]indole(MeAαC) and 2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole-(AαC) and identification of DNA-adducts in organs from rats dosed with MeAαC[J]. Carcinogenesis,2004, 25: 1525-1533.

[42]Jamin E L,Arquier D, Canlet C, et al. New insights in the formation of deoxynucleoside adducts with the heterocyclic aromatic amines PhIP and IQ by means of ion trap MSn and accurate mass measurement of fragment ions[J]. J Am Soc Mass Spectrom,2007, 18:2107-2118.

[43]Bessette E E, Goodenough A K,Langouet S,et al. Screening for DNA adducts by data-dependent constant neutral loss-triple stage mass spectrometry with a linear quadrupole ion trap mass spectrometer[J]. Anal Chem,2009, 81:809-819.

[44]Totsuka Y,Fukutome K,Takahashi M,et al. Presence of N2-(deoxyguanosin-8-yl)-2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f] quinoxaline (dG-C8-MeIQx) in human tissues[J]. Carcinogenesis,1996, 17: 1029-1034.

[45]Gorlewska Roberts K,Green B,Fares M,et al.Carcinogen-DNA adducts in human breast epithelial cells[J]. Environ Mol Mutagen,2002, 39: 184-192.

[46]Zhu J, Chang P,Bondy M L,et al. Detection of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine-DNA adducts in normal breast tissues and risk of breast cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2003, 12:830-837.

[47]Friesen M D,Kaderlik K,Lin D,et al.Analysis of DNA adducts of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine in rat and humantissues by alkaline hydrolysis and gas chromatography/electroncapture mass spectrometry: validation by comparison with32Ppostlabeling[J]. Chem Res Toxicol,1994, 7:733-739.

[48]Gu D, Turesky R J, Tao Y, et al. DNA adducts of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine and 4-aminobiphenyl are infrequently detected in human mammary tissue by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Carcinogenesis,2012, 33(1):124-130.

[49]Skipper P L,Tannenbaum S R. Protein adducts in the molecular dosimetry of chemical carcinogens[J]. Carcinogenesis, 1990, 11:507-518.

[50]Skipper P L,Peng X,SooHoo C K, et al. Protein adducts as biomarkers of human carcinogen exposure[J]. Drug Metab Rev,1994, 26:111-124.

[51]Liebler D C. Proteomic approaches to characterize protein modifications: new tools to study the effects of environmental exposures[J]. Environ Health Perspect,2002,110 (Suppl 1):3-9.

[52]Tornqvist M,Fred C,Haglund J,et al. Protein adducts: quantitative and qualitative aspects of their formation, analysis and applications[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2002, 778:279-308.

[53]Skipper P L,Tannenbaum S R,Ross R K,et al.Nonsmoking-related arylamine exposure and bladder cancer risk[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2003, 12: 503-507.

[54]Gan J,Skipper P L,Gago Dominguez M,et al.Alkylaniline-hemoglobin adducts and risk of non-smoking-related bladder cancer[J].J Natl Cancer Inst,2004, 96: 1425-1431.

[55]Pathak K V, Chiu T L, Amin E A,et al. Methemoglobin Formation and Characterization of Hemoglobin Adducts of Carcinogenic Aromatic Amines and Heterocyclic Aromatic Amines[J]. Chem Res Toxicol,2016, 29(3):255-69.

[56]Umemoto A,Monden Y,Tsuda M,et al. Oxidation of the 2-hydroxyamino derivative of 2-amino-6-methyl-dipyrido[1,2-a: 30,20-d] imidazole(Glu-P-1) to its 2-nitroso form, an ultimate form reacting with hemoglobin thiol groups[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1988, 151: 1326-1331.

[57]Turesky R J,Skipper P L,Tannenbaum S R.Binding of 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline to hemoglobin and albumin in vivo in the rat. Identification of an adduct suitable for dosimetry[J]. Carcinogenesis, 1987, 8: 1537-1542.

[58]Lynch A M,Murray S, Boobis A R,et al. The measurement of MeIQx adducts with mouse haemoglobin in vitro and in vivo: implications for human dosimetry[J]. Carcinogenesis,1991, 12:1067-1072.

[59]Dingley K H,Freeman S P,Nelson D O,et al. Covalent binding of 2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline to albumin and hemoglobin at environmentally relevant doses. Comparison of human subjects and F344 rats[J]. Drug Metab Dispos,1998, 26:825-828.

[60]Dingley K H,Curtis K D,Nowell S,et al. DNA and protein adduct formation in the colon and blood of humans after exposure to a dietary-relevant dose of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 1999, 8: 507-512.

[61]Fasco M J,Iii C R,Stack R F,et al. Cyanide adducts with human plasma proteins: albumin as a potential exposure surrogate[J]. Chem Res Toxicol,2007, 20: 677-684.

[62]Noort D,Hulst A G., Jansen R. Covalent binding of nitrogen mustards to the cysteine-34 residue in human serum albumin[J]. Arch Toxicol,2002,76: 83-88.

[63]Wang Z, Ramsdell J S.Analysis of interactions of brevetoxin-B and human serum albumin by liquid chromatography/mass spectrometry[J]. Chem Res Toxicol,2011, 24:54-64.

[64]Green L C,Skipper P L,Turesky R J,et al. In vivo dosimetry of 4-aminobiphenyl in rats via a cysteine adduct in hemoglobin[J]. Cancer Res,1984, 44: 4254-4259.

[65]Lynch A M,Murray S,Zhao Ket al. Molecular dosimetry of the food-borne carcinogen MeIQx using adducts of serum albumin[J]. Carcinogenesis, 1993, 14:191-194.

[66]Peng L, Turesky R J. Mass spectrometric characterization of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine N-oxidized metabolites bound at Cys34of human serum albumin[J]. Chem Res Toxicol,2011, 24(11):2004-2017.

[67]Peng L, Turesky R J. Optimizing proteolytic digestion conditions for the analysis of serum albumin adducts of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine, a potential human carcinogen formed in cooked meat[J]. J Proteomics,2014, 103:267-78.

Biomarkers of food-borne carcinogen heterocyclic aromatic amines

PENGLi-juan

(School of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：Heterocyclic aromatic amines (HAAs) are carcinogens and mutagens that are formed during the high-temperature cooking of meats. A number of studies have reported a positive association between well-done meat consumption and cancer risks of the human prostate, mammary and colon. However, the association of HAAs formed in cooked meat and cancer risks has been difficult to establish. There is a critical need to establish stable, long-term biomarkers of HAAs, and develop corresponding methods with high selectivity and sensitivity. In this review, we highlight the biomarkers of HAAs that may be implemented in molecular epidemiology studies, including HAAs, their metabolites, DNA adducts and protein adducts. The advanced analytical approaches that have been successfully developed to biomonitor biological effects of these chemicals are also discussed.

Key words：heterocyclic aromatic amine (HAA); carcinogen; biomarker;metabolite; adduct

收稿日期：2016-03-30.

作者簡介：彭利娟(1974-)，女，博士，副教授， E-mail: lijuan_peng@hotmail.com.

基金項目：國家自然科學基金項目(21405118).

文章編號：2095-7386(2016)02-0001-11

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.02.001

中圖分類號：TS 201.2；TS 201.6

文獻標識碼：A