人激活素受體結合蛋白2與結腸癌相關性研究

李占東，李　皓，朱可彤，包曉華，李　琳，劉飛舟，龔秀玲，楊海玲

(1．吉林工程技術師范學院 食品工程學院，吉林 長春130052；2.中國人民解放軍208醫院，吉林 長春130062；3.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；4.長春長生生物科技股份有限公司，吉林 長春130103；5.上海紫江企業集團股份有限公司長春分公司，吉林 長春130033)

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人激活素受體結合蛋白2與結腸癌相關性研究

李占東1，李皓1，朱可彤1，包曉華2，李琳3，劉飛舟4，龔秀玲5，楊海玲3

(1．吉林工程技術師范學院 食品工程學院，吉林 長春130052；2.中國人民解放軍208醫院，吉林 長春130062；3.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；4.長春長生生物科技股份有限公司，吉林 長春130103；5.上海紫江企業集團股份有限公司長春分公司，吉林 長春130033)

激活素是胞外信號蛋白TGF-超家族的成員。它具有多種調控功能，如細胞增殖和分化、細胞凋亡，代謝的動態平衡，免疫反應，創傷修復及各種內分泌功能[1,2]。激活素誘導胞內信號分子Smad蛋白磷酸化，Smad蛋白包括Ⅰ型和Ⅱ型受體。以往的研究表明，hARIP2可以通過與激活素Ⅱ型受體(ActRIIs)結合減弱激活素信號[3]。但是，hARIP2在結腸癌細胞中的表達分布尚不清楚。在本研究中我們發現，hARIP2能夠促進結腸癌細胞的增值，hARIP2的表達量隨著結腸腫瘤病理分級的升高而增強。而且，hARIP2的表達量與結腸癌腫瘤的體積、淋巴結轉移呈正相關。這些結果表明，hARIP2可能是一種結腸腫瘤中負反饋調節因子。

1材料與方法

1.1實驗材料

HCT8細胞、pcDNA3及構建好的pcDNA3-FLAG-hARIP2質粒為本課題組保存，隨機收集(2014年)吉林大學病理學與病理生理學系I級結腸癌組織40例，Ⅱ級結腸癌組織28例，Ⅲ級結腸癌組織10例。所有病理組織均為首次診斷病例，未進行放療、化療及生物治療等。

1.2抗體制備

合成hARIP2羧基端 50個氨基酸長度的小肽，將合成的小肽免疫新西蘭大白兔，制備抗hARIP2多克隆抗體。通過瓊脂糖凝膠蛋白A(Amersham Biosciences公司)對特異性抗血清進行純化，并用于免疫組化分析。anti-GAPDH抗體購于Abcam公司(英國)。

1.3免疫印跡分析

將pcDNA3及構建好的pcDNA3-FLAG-hARIP2質粒載體用脂質體2000細胞試劑(Invitrogen公司，美國)轉染結腸癌HCT8細胞。轉染兩天后，HCT8細胞在PBS溶液中洗滌三次，然后再放到裂解液中裂解(50 mM Tris- HCl(pH=7.5)，150 mM 氯化鈉，1 mM 氟化鈉，1%NP-40，1 mMPMSF，2 μg/ml 亮肽素，和2 μg/ml 抑肽酶)。離心分離裂解液，用考馬斯亮藍蛋白質測定試劑(上海生工)測定每種上清液的蛋白質。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白質，然后轉到PVDF膜上。膜用抗-GAPDH和抗-hARIP2抗體孵育，再將孵育后的膜與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育。用ECL (Piece Biotechnology公司,美國)化學發光法檢測。

1.4細胞增殖分析

HCT8細胞被分別轉染pcDNA3(對照組)，pcDNA3-FLAG-hARIP2質粒載體，轉染24 h后，細胞被接種到96孔板中，接種密度為1×104每孔，在含有10% FBS的DMEM培養基(Gibco)中分別培養。24、48、72和96 h。制備20 μl MTT儲備溶液(5 mg/ml溶于 PBS,Sigma)，然后將其加入到各孔中，并且進一步將板孵育4 h。孵育后，向每孔加入150 μl DMSO中，劇烈混合均勻，在37℃下孵育15 min后在570 nm處測定吸光度。

1.5hARIP2免疫組織化學染色

石蠟包埋結腸癌組織樣本塊進行切片，轉到聚L-賴氨酸包被的載玻片上。脫石蠟后，在10 mM檸檬酸鹽緩沖液的抗原表位測定非特異性的結合位點。切片在5%正常兔血清的PBS (pH 7.4)中孵育20 min。用PBS洗滌，切片組織加入抗hARIP2抗體，1∶500倍稀釋，稀釋液為的1% PBS溶液，4℃孵育12 h。用PBS充分洗滌后，加入生物素標記的二抗，并在室溫孵育20 min。PBS洗滌，切片與過氧化物酶標記的抗生物素蛋白-生物素復合物在室溫下孵育20 min。用DAB顯色液顯色。

1.6統計學分析

所有的體外實驗至少重復3次，每個結果是3次獨立實驗的平均值。由t檢驗分析組之間的差異，P值小于0.05被認為統計學上具有顯著性。

2結果

2.1HCT8細胞中hARIP2過表達的免疫印跡分析

為確定hARIP2對結腸癌細胞的作用，用轉染pcDNA3-FLAG-hARIP2載體上調其表達。在HCT8細胞中，hARIP2的表達量增加。在其他結腸腫瘤細胞中也獲得相似的結果(結果未示出)。這些結果表明，pcDNA3-FLAG-hARIP2載體使hARIP2在結腸癌細胞中的表達量上調；以合成小肽做為抗原制備的hARIP2多克隆抗體能夠識別結腸癌細胞內天然hARIP2抗原決定簇(圖1)。

圖1　HCT8細胞中hARIP2過表達的免疫印跡分析

pcDNA3-FLAG-hARIP2載體及陰性對照組(control )分別被轉染HCT8細胞，每個樣品都添加等量細胞裂解液，抗體選用抗GAPDH抗體和抗hARIP2抗體，通過免疫印跡進行分析。

2.2hARIP2對結腸癌細胞增殖的影響

用pcDNA3及pcDNA3-FLAG-hARIP2載體轉染HCT8細胞，研究hARIP2在人結腸腫瘤細胞中的增殖的作用。采用MTT法測定轉染有對照及hARIP2的HCT8細胞在體外的增殖。MTT實驗均在24、48、72和96 h的條件下進行，在570 nm處測定吸光度，每個數據表示為平均值±SD，根據MTT實驗繪制細胞增殖曲線。細胞增殖活性如圖2所示，實驗重復3次。MTT法檢測的結果表明，過表達hARIP2增加細胞增殖。在其他的腫瘤細胞中也得到同樣的結果。這些結果表明是hARIP2促進了人類結腸腫瘤細胞的增殖。

圖2　體外實驗驗證hARIP2對HCT8 細胞增殖的作用

2.3hARIP2在不同病理分級的結腸癌組織中的表達

免疫組織化學染色實驗結果發現，與對照相比，在40例Ⅰ級結腸癌組織(圖3B)中為中強度至低強度染色；28例Ⅱ級結腸癌組織以及10例Ⅲ級結腸癌組織(圖3C、3D)在結腸癌中檢測到是高強度染色。實驗結果顯示隨著結腸癌組織的病理分級的增高，hARIP2的表達量也相應增高。

圖3免疫組化分析hARIP2在結腸癌組織中的表達情況。組織被染成棕黃色為陽性免疫反應，細胞核呈藍色，A.陰性對照(未加一抗)。B.病理Ⅰ級組織。C.病理Ⅱ級組織。D.病理Ⅲ級組織。放大倍數是×20。

2.4hARIP2免疫強度的分析

統計表明，hARIP2在病理分級程度高的結腸癌組織(89.3%Ⅱ級結腸癌組織；100%Ⅲ級結腸癌組織；表1)中表達更強，比它在病理分級程度低的結腸癌組織(62.5%Ⅰ級結腸癌組織，表1)中表達更強。此外，我們的結果表明，hARIP2的表達與在淋巴結轉移(表2)，結腸癌腫瘤大小(表3)是呈正相關的。

表1　hARIP2染色強度與結腸癌組織病理分級的關系

表2　hARIP2染色強度與結腸癌組織淋巴結狀態的關系

表3　hARIP2染色強度與結腸癌組織體積大小的關系

3討論

結腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，在我國近20年以來其發病率逐年升高，以大城市更為明顯，且出現結腸癌多于直腸癌的趨勢，雖然最近診斷和治療手段的進展挽救了許多早期腫瘤患者的生命，但晚期及轉移患者的預后仍不理想。隨著分子生物學技術的發展，多步驟、多階段及多基因方面研究結腸癌的發生發展尤為重要。

激活素屬于轉化生長因子超家族成員中的一種多功能生長和分化因子，能抑制結腸癌細胞的增殖。激活素通過其I型和Ⅱ型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體介導產生不同的生物學功能。激活素直接與其Ⅱ型受體結合，導致募集、磷酸化I型受使其激活，一旦被激活，Ⅰ型受體結合并磷酸化Smad蛋白。這些轉錄后的Smad蛋白，將細胞內信號轉運到細胞核內，進而調控靶基因的轉錄[4]。到目前為止，已知的ActRIIs的功能僅限于與配體結合，募集Ⅰ型受體和轉磷酸化作用。激活素Ⅱ型受體包括兩種亞型，即激活素Ⅱ型受體A和激活素Ⅱ型受體B，每一個亞型都由單獨的基因編碼。此外，還有兩個ActRIIA的剪接突變體及五個ActRIIB的剪接突變體已被發現[5-7]。據推測，ActRIIs在激活素信號中起著重要的作用。

已有研究表明，激活素能夠抑制多種類型腫瘤細胞的增殖[8]。且激活素與結腸癌密切相關。激活素信號轉導成分已被確定為腫瘤抑制基因[9]。激活素信號成分的缺失或減少，使某些腫瘤變得更具有侵襲性，此外，激活素已被報道通過激活Smad蛋白抑制腫瘤細胞的生長。由于hARIP2可以增強ActRII的內吞作用，并通過Ral/RalBP1-depending的通路降低ActRIIA在細胞膜上的表達，并具有抑制激活素介導的信號轉導的能力。因此，可以認為hARIP2可能參與結腸癌的功能調節。在本研究中，我們通過對不同結腸癌病理階段進行免疫組化實驗分析發現，hARIP2表達水平在不同病理分級的結腸癌組織中呈正相關，說明hARIP2與腫瘤的分化有著密切的聯系。hARIP2對結腸腫瘤細胞增值的促進作用及hARIP2表達量與腫瘤體積及淋巴結轉移呈正相關，說明hARIP2能促進腫瘤的發生發展。因此，我們推測hARIP2在結腸腫瘤形成過程中起著一定的作用。

參考文獻：

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[3]Li ZD，Wu Y，Bao YL，et al.Identification and characterization of human ARIP2 and its relation to breast cancer[J].J Cyto，2009，2(46)：251.

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[9]Deacu E，Mori Y，Sato F，et al.Activin type Ⅱ receptor restoration in ACVR2-deficient colon cancer cells induces transforming growth factor-beta response pathway genes[J].J Cancer Res，2004，64：7690.

基金項目：吉林省科技廳科技發展計劃項目資助(2012050)；吉林省科技廳自然科學基金項目(20130101156JC)

文章編號：1007-4287(2016)06-0893-03

作者簡介：李占東(1979-)，男，講師，博士，研究方向為腫瘤發生機制研究。

(收稿日期：2015-11-19)