抑制ERK1/2通路對卡鉑誘導人卵巢癌細胞凋亡的影響*

齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院婦產科(齊齊哈爾161001)　李興媚　鄭立紅　劉　丹▲　李躍文　梅慶步　董　冰

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抑制ERK1/2通路對卡鉑誘導人卵巢癌細胞凋亡的影響*

齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院婦產科(齊齊哈爾161001)李興媚鄭立紅△劉丹△▲李躍文梅慶步△董冰

摘要目的：探討抑制ERK1/2通路對卡鉑誘導卵巢癌細胞凋亡作用的影響。方法：采用Hoechst 33258熒光染色法檢測抑制ERK1/2通路對卡鉑誘導卵巢癌HO-8910細胞凋亡的影響；用分光光度法檢測卡鉑濃度的增加及抑制ERK1/2通路對卵巢癌HO-8910細胞Caspase-8和Caspase-9活化的影響。結果：CBP組、PD98059組及聯用組部分細胞核呈現亮藍色熒光的為凋亡細胞，細胞核可見碎塊狀熒光信號，凋亡指數CBP組為20.35%，PD98059組為15.21%，聯用組為29.78%。隨著卡鉑濃度的增加，Caspase-8、Caspase-9活性的改變并不明顯(P>0.05)，而聯用組的Caspase-8、Caspase-9活性最高，抑制ERK1/2通路可促進卡鉑增強Caspase-8、Caspase-9的活性(P<0.01)。結論：抑制ERK1/2通路可促進卡鉑誘導卵巢癌細胞凋亡作用，并與Caspase-8、Caspase-9活化有關。

主題詞卵巢腫瘤/化學誘導卵巢腫瘤/預防和控制卡鉑/治療應用有絲分裂素激活蛋白激酶類/代謝半胱氨酸內肽酶類/代謝

卵巢癌是女性常見惡性腫瘤之一，因其發病隱匿，患病早期很難發現，所以預后不良。目前針對卵巢癌的治療手段主要是手術及以鉑類為基礎的化療相結合，然而卵巢癌的復發率和耐藥率較高，這嚴重制約患者的預后?？ㄣK(Carboplatin, CBP)是第二代鉑類化合物，為廣譜抗腫瘤藥，在預防卵巢癌術后復發轉移中顯示出良好的應用前景。細胞外信號調節激酶(Extracellular signal regulated protein kinase, ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPK)的重要成員之一[1]，它也是組成從細胞膜到細胞核的細胞信號系統之一，可以調控細胞增殖及細胞凋亡[2]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)活化是導致細胞凋亡的中心事件，Caspase-8和Caspase-9作為凋亡始動子，位于級聯反應的上游，活化后可激活下游的Caspase，使細胞發生細胞凋亡的生化及形態學改變[3]。進一步加強對卡鉑的研究，明確ERK1/2通路與腫瘤細胞凋亡的關系，探索其具潛能的腫瘤治療靶點。課題組前期研究結果顯示：卡鉑通過抑制ERK1/2激活，增強其抗卵巢癌細胞增殖作用[4]。本研究探討抑制ERK1/2通路對卡鉑誘導卵巢癌細胞凋亡作用的影響。

材料與方法

1實驗材料細胞系為卵巢癌HO-8910細胞，由哈爾濱醫科大學遺傳學研究室提供?？ㄣK注射液購自齊魯制藥(海南)有限公司，規格10ml: 50mg；PD98059為美國Promega產品，規格5mg；優級胎牛血清購自美國Hyclone公司，規格100ml；胰蛋白酶購自美國Amresco公司，規格25g；RPMI-1640 培養基購自美國Gibco公司，規格10×11；Hoechst 33258細胞凋亡熒光試劑盒(規格100 assays)、分光光度法檢測Caspase-8及Caspase-9試劑盒(規格20assays)購自南京凱基生物科技發展有限公司。

2實驗方法

2.1卵巢癌HO-8910細胞的體外培養：細胞接種于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養液中，在37℃、體積分數為5% CO2和90% 相對濕度的培養箱中培養，每24h換液1次，待細胞鋪滿瓶底約80%～90%后，用胰蛋白酶消化，以1∶2的比例分瓶傳代，進行實驗的細胞均取對數生長期。

2.2Hoechst 33258熒光染色法觀察卵巢癌細胞凋亡：設4個實驗組，分別為空白對照組、20μmol/L CBP組、50μmol/L PD98059(ERK1/2抑制劑)組、50μmol/L PD98059和20μmol/L CBP的聯用組，聯用組先用50μmol/L PD98059作用1h后，再加入20μmol/L CBP。細胞以1×105個/孔濃度接種于24孔板，每個實驗組設3個平行孔，培養24h后，加入上述4組不同的培養液0.5ml，繼續培養24h后，用冷Buffer A洗滌細胞2次，加入1ml 的4%甲醛溶液，4℃固定細胞10min，再用Buffer A洗滌細胞2次，最后滴加Hoechst 33258工作液100μl，室溫下染色10min，以紫外光340nm波長激發，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，實驗重復3次，并計算凋亡指數AI(%)，即：隨機計數1000個細胞，計算具備顯著凋亡特征的細胞核數量所占的百分比。

2.3檢測Caspase-8、Caspase-9活性：設6個實驗組，分別為空白對照組、10μmol/L 的CBP組、20μmol/L 的CBP組、40μmol/L 的CBP組、50μmol/L的PD98059組、50μmol/L PD98059和20μmol/LCBP的聯用組。①抽提蛋白，細胞以3×105個/孔濃度接種在6孔板中，每個實驗組設3個平行孔，培養24h后，加入上述不同濃度梯度的CBP培養液2ml，培養24h后，收集細胞，PBS液洗滌兩次，冰上加入蛋白抽提試劑200μl，小心吹打均勻，裂解40min，4℃ 10,000 rpm 離心2min，小心轉移上清液，并記錄各實驗組轉移上清液的體積。②蛋白定量，先將BSA標準品和待測蛋白樣品稀釋10倍，各取25μl加入96孔板，每個實驗組設3個平行孔，然后加入BCA工作液200μl混勻，再于37℃避光孵育30min，待冷卻至室溫時，在自動酶標儀中檢測570nm波長時的吸光度值，根據標準曲線計算待測樣品的蛋白濃度，用裂解液調整樣品蛋白濃度一致為2μg/μl。③檢測Caspase-8、Caspase-9活性，取50μl (100μg)的細胞裂解上清，加入50μl 2×Reaction Buffer(使用前每50μl 2×Reaction Buffer加入5μl DTT)，再加入5μl Caspase-8或Caspase-9 Substrate，于37℃避光孵育4h，最后用酶標儀檢測405nm的吸光度值，用藥物組與對照組的吸光度比值來表示各藥物組Caspase-8、Caspase-9的活化程度。

結果

1Caspase-8、Caspase-9活性檢測結果所有實驗組之間的Caspase-8、Caspase-9活性變化有顯著性差異(Caspase-8P<0.05；Caspase-9F=17.778，P<0.01)，但隨著卡鉑濃度的增加Caspase-8、Caspase-9活性改變并不明顯(P>0.05)，而聯用組的Caspase-8、Caspase-9活性最高，抑制ERK1/2通路可促進卡鉑增加Caspase-8、Caspase-9活性(P<0.01)，詳見附表。

附表　24h CBP、PD98059單用及聯用對Caspase-8、Caspase-9活性的影響

注：與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01；與聯用組比較, #P<0.05, ##P<0.01

2Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞凋亡情況CBP組、PD98059組及聯用組部分細胞核呈現亮藍色熒光的為凋亡細胞，細胞核可見碎塊狀熒光信號，而對照組細胞呈現均勻的暗藍色熒光(見附圖)；凋亡指數結果，CBP組為20.35%，PD98059組為15.21%，聯用組為29.78%。

附圖熒光顯微鏡下CBP、PD98059單用及聯用誘導HO-8910細胞凋亡的形態學變化(×200；A：對照組； B：CBP組； C：PD98059組； D：PD98059+CBP組)

討論

在觸發細胞凋亡的信號途徑中，Caspase家族蛋白酶發揮重要作用。一般情況下，Caspase以無活性的形式存在于細胞中，在受到內外因素的作用下，產生凋亡信號，傳至Caspase，引起其活化，Caspase-2、8、9、10等位于級聯反應的上游，活化后激活下游的Caspase-3、6、7，最終導致細胞發生凋亡，其中Caspase-3起關鍵作用[5]。而ERK1/2通路與Caspase家族之間的關系又是怎樣的呢?？Х人岜揭阴?天然藥物)能降低人結腸癌HT-29細胞ERK的mRNA和蛋白表達，增加Caspase-3的mRNA表達[6]。凝血因子Ⅶa依賴組織因子活化蛋白酶激活受體2，通過ERK1/2途徑，下調結腸癌SW620細胞Caspase-3表達，從而促進結腸癌細胞增殖[7]。抑制ERK1/2通路活化在抗卵巢癌研究中，取得了一定的成果。抑制ERK1/2可提高卵巢癌HO-8910細胞的對化療藥物的敏感性[8]。作者在研究ERK1/2通路對卡鉑誘導人卵巢癌HO-8910細胞周期阻滯的影響時，發現卡鉑抑制卵巢癌HO-8910細胞生長，阻滯其細胞周期進程與過度活化ERK1/2有關，應用MEK1/2特異性抑制劑PD98059抑制ERK1/2活化，卡鉑的抗增殖作用增強，誘導人卵巢癌HO-8910細胞S期和G1期阻滯[1]。本研究結果顯示：抑制ERK1/2通路可促進卡鉑誘導卵巢癌細胞凋亡作用，并與Caspase-8、Caspase-9活化有關?？ㄣK還可增加卵巢癌HO-8910和OVCAR3細胞凋亡率，并與EphA2蛋白表達降低有關[9]?？ㄣK可通過激活ERK1/2通路而誘導卵巢癌OVCA429細胞凋亡[10]。抑制ERK1/2信號通路的激活可明顯抑制卵巢癌細胞生長[11]。PD98059作為ERK1/2通路抑制劑，可以下調磷酸化ERK1/2的表達，從而抗卵巢癌SKOV3細胞增殖；PD98059與順鉑聯用可使SKOV3細胞的凋亡率明顯增加，增強順鉑的抗癌作用，提示抑制ERK1/2通路可提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[12]。

值得注意的是：在本研究結果中隨著卡鉑濃度的增加，Caspase-8、Caspase-9活性改變并不明顯，與卡鉑抗細胞卵巢癌增殖作用隨其濃度的增加而增強[4]并不一致；聯用組的Caspase-8、Caspase-9活性最高，抑制ERK1/2通路可明顯促進卡鉑增加Caspase-8、Caspase-9活性，提示卡鉑通過活化Caspase-8和Caspase-9調控細胞凋亡與ERK1/2通路關系密切。另外，熒光染色法顯示卡鉑(20μmol/l)能誘導卵巢癌細胞發生明顯的細胞凋亡的形態學改變，但其Caspase-8、Caspase-9活性未同步增強，提示卡鉑誘導卵巢癌HO-8910細胞凋亡可能與激活Caspase家族中其他凋亡始動子有關，其機制有待于進一步研究。

鉑類化療藥物通過激活或抑制ERK1/2通路而抑制卵巢癌細胞增殖，抑制ERK1/2激活又可進一步增強鉑類化療藥物的抗腫瘤作用，臨床上防治卵巢癌的復發轉移可以考慮聯合應用ERK1/2通路特異性抑制劑，提高腫瘤對鉑類化療藥物的敏感性，減少其劑量，降低其毒副作用及耐藥性的發生。

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(收稿：2015-12-10)

通訊作者▲

【中圖分類號】R737.31

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.05.004

Effects of carboplatin inducing apoptosis in human ovarian cancer cells through inhibiting ERK1/2 pathway

Department of Obstetrics and Gynecology, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University (Qiqihar 161001)Li XingmeiZheng LihongLiu Dan et al

ABSTRACTObjective：To explore the impacts of cell apoptosis treated by carboplatin in ovarian cancer cells through inhibiting ERK1/2 pathway. Methods： Hoechst 33258 assay was used to detect the effects of carboplatin inducing apoptosis in human ovarian cancer HO-8910 Cells through inhibiting ERK1/2 pathway. Spectrophotometry was used to detect the impacts of activation of Caspase-8 and Caspase-9 through increasing the concentration of carboplatin and inhibiting ERK1/2 pathway. Results： The nucleus of all drug groups appeared bright blue fluorescence, they were apoptotic cells. Some nuclei had fragmental fluorescence. Apoptosis index, CBP group was 20.35%, PD98059 group was 15.21%, combined group was 29.78%. The activities of Caspase-8 and Caspase-9 changed were not obvious, with increasing concentrations of carboplatin (P>0.05). And combined group's activities were the highest. Inhibition of ERK1/2 pathway could help carboplatin increasing Caspase-8 and Caspase-9 (P<0.01). Conclusion： Inhibition of ERK1/2 pathway can promote carboplatin inducing cell apoptosis in human ovarian cancer cells, and it relates to caspase-8 and caspase-9 activations.

KEY WORDSOvarian neoplasms/chemically induced Ovarian neoplasms/prevention and control Carboplatin/therapeutic use Mitogen-activated protein kinase kinases/metabolism Cysteine endopeptidases/metabolism

*黑龍江省衛生計生委科學技術研究項目(2013173)

△齊齊哈爾醫學院基礎醫學院生物遺傳教研室