乙肝解毒膠囊的微生物限度檢查方法驗證

佘金燕　任平遠　馬小兵　聶一鑫　何祖國　胡麗華

1.健民集團葉開泰國藥(隨州)有限公司，湖北　隨州　441300；2.湖北省隨州市中醫院，湖北　隨州　441300

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乙肝解毒膠囊的微生物限度檢查方法驗證

佘金燕1任平遠1馬小兵2聶一鑫1何祖國1胡麗華1

1.健民集團葉開泰國藥(隨州)有限公司，湖北隨州441300；2.湖北省隨州市中醫院，湖北隨州441300

【摘要】目的：建立乙肝解毒膠囊的微生物限度檢查方法。方法：采用2010年版《中國藥典》規定的平皿法、培養基稀釋法，驗證確認所采用的方法是否適合該藥品的微生物限度檢查。結果：細菌數測定采用培養基稀釋法；霉菌及酵母菌數測定采用平皿法；控制菌采用培養基稀釋法。5種試驗菌的回收率均高于70%。結論：該方法可用于乙肝解毒膠囊的微生物限度限度檢查。

【關鍵詞】乙肝解毒膠囊；微生物限度限度檢查；方法學驗證

乙肝解毒膠囊是治療乙肝的中成藥，其執行標準為WS3-B-0002-89[1]。該藥主要成份為黃柏、草河車、黃芩、大黃等8味中藥，成品中含兩種藥材原粉。按照《中國藥典》2010年版一部附錄XⅢC微生物限度檢查法[2]的要求，該藥應進行細菌數、霉菌和酵母菌數、大腸埃希菌、大腸菌群測定，研究對該藥的微生物限度具體檢查方法進行了驗證。

1儀器與材料

1.1儀器高壓滅菌鍋；LRH-250生化培養箱；PYX-DHS電熱恒溫培養箱。

1.2材料乙肝解毒膠囊(規格：每粒裝0.25g，批號：141202、150401、150902，健民集團葉開泰國藥(隨州)有限公司)。培養基：營養肉湯培養基，營養瓊脂培養基，改良馬丁瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基，4-甲基傘形酮葡萄苷酸培養基(MUG)，pH7.0無氧氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.3菌株大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]；白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]；黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]。

2方法與結果

2.1菌液制備取經35℃培養24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌的肉湯新鮮培養物1ml，加入到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-6～10-7約為50～100cfu/ml的菌懸液備用。

取經25℃培養24h的白色念珠菌改良馬丁液體培養物1ml，加入到9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5約為50～100cfu/ml菌懸液備用。

取經25℃培養一周的黑曲霉斜面培養物，加0.9%無菌氯化鈉溶液10ml，將孢子洗脫，然后吸出孢子液，用墊有脫脂棉的漏斗(濕熱滅菌)過濾，除去菌絲，收集孢子懸液至另一無菌試管內作為菌原液取此菌原液0.1ml加入到9.9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，稀釋至10-5每1ml含孢子數小于100cfu的孢子懸液備用。

2.2菌液計數大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌分別劃線接種至營養瓊脂培養基，置35℃培養2d；白色念珠菌、黑曲霉菌液分別劃線接種至改良馬丁瓊脂培養基，置25℃培養3d。

2.3供試液制備取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，45℃水浴振搖助溶，制成1:10的供試液。

2.4細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證試驗：

2.4.1平皿法(1ml/皿)

2.4.1.1試驗組取1∶10的供試液1ml和試驗菌液1ml，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，分別制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。

2.4.1.2菌液組平皿法測定所加的試驗菌數。

2.4.1.3供試品對照組取1∶10的供試液1ml，測定供試品本底菌數。

2.4.2培養基稀釋法

2.4.2.1試驗組取1∶10的供試液0.2ml和試驗菌液1ml，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，分別制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。

2.4.2.2菌液組測定所加試驗菌數。

2.4.2.3供試對照組取1∶10的供試液0.2ml，測定供試品本底菌數。結果見表1。

表1　乙肝解毒膠囊細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證結果(平皿法及稀釋法)

由表1可知，采用培養基稀釋法做驗證試驗，大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌人工染菌回收率達到70%以上；采用平皿法做驗證試驗，白色念珠菌、黑曲霉人工染菌回收率達到70%以上；采用以上方法，金黃色葡萄球菌人工染菌回收率低于70%。金黃色葡萄球菌驗證，需改用離心沉淀取上層液進行試驗。

2.5金黃色葡萄球菌計數方法的驗證試驗(離心沉淀上層液)

2.5.1試驗組取1∶10的供試液置尖底離心管，500轉/分，離心5min，取上層液0.2ml和試驗菌液1ml，分別注入平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，分別制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。

2.5.2菌液組平皿法測定所加的試驗菌數。

2.5.3供試品對照組取上層液0.2ml,測定供試品本底菌數。結果見表2。

表2　乙肝解毒膠囊金黃色葡萄球菌的驗證結果(離心沉淀上層液0.2ml/皿)計數方法的驗證結果(平皿法及稀釋法)

由表2可知，取離心沉淀上層液(0.2ml/皿)采用培養基稀釋法做驗證試驗，可消除供試品對金黃色葡萄球菌的抑菌作用，回收率均達到了70%以上，取離心沉淀上層液(1ml/皿)，采用平皿法做驗證試驗，人工染菌回收率為0。稀釋劑對照組回收率達到了70%以上。

2.6控制菌檢查方法的驗證

2.6.1大腸埃希菌的驗證(培養基稀釋法)

2.6.1.1試驗組取1∶10的供試液10ml及大腸埃希菌液1ml,加入到200ml的膽鹽乳糖增菌培養基中，35℃培養48h。取上述培養物0.2ml，接種至含5mlMUG培養基的試管內，35℃培養24h，在366nm在外燈下觀察呈現熒光，同時用未接種供試品的MUG培養基做本底對照。結果試驗管MUG陽性，靛基質試驗陰性，本底對照管為陰性。

2.6.1.2陰性菌對照組除加金黃色葡萄球菌液1ml外，其它操作同實驗組，結果金黃色葡萄球菌未檢出，試驗管MUG陰性，靛基質試驗陰性，本底對照管為陰性。

2.6.2大腸菌群的驗證(常規法)

2.6.2.1試驗組取10ml的膽鹽乳糖發酵培養基管3支，分別加入1∶10、1∶100、1∶1000的供試液1ml及大腸埃希菌液1ml，另取一支加入稀釋劑1ml作為陰性對照，35℃培養24h后觀察。供試液管產酸產氣，分別劃線接種曙紅亞甲藍瓊脂平板，35℃培養24h，均可見典型菌落生長。

2.6.2.2陰性菌對照組取10ml的膽鹽乳糖發酵培養管3支，分別加入1∶10、1∶100、1∶1000的供試液1ml及加金黃色葡萄球菌液1ml，其它操作同大腸菌群試驗組，各管未產酸產氣，接種曙紅亞甲藍瓊脂平板，35℃培養24h，無菌落生長。

3結論

根據驗證試驗結果，乙肝解毒膠囊按照中國藥典2010年版一部微生物限度檢查法(附錄XⅢC)檢驗，細菌數測定取離心沉淀上層液(0.2ml/皿)采用培養基稀釋法進行試驗，霉菌及酵母菌數測定采用平皿法進行檢驗，控制菌檢查按培養基稀釋法進行檢驗。

參考文獻

[1]中華人民共和國藥典委員會.衛生部藥品標準中藥成方制劑(第一冊)[M].北京:人民衛生出版社,1989:1.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄79-88.

【中圖分類號】R286.0

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)11-0010-02

(收稿日期：2016.04.07)

Methodological Validation of Microbial Limit Test Method of Yiganjiedu Capsule

SHE Jinyan1REN Pingyuan1MA Xiaobing2NIE Yixin1HE Zuguo1HU Lihua1

1.Jianmin Group Yekaitai Chinese Medicine (suizhou)Co.,Ltd, Suizhou,441300,China；2.Suizhou Hospital of TCM，Suizhou,441300,China

Abstract:Objective To establish a method for the microbial limit test of Yiganjiedu Capsule. Methods The routine method and the dilution method regulated by the Chinese Pharmacopoeia (2010 edition) were adopted. Whether the adopted methods suiting for the microbial limit test of Yiganjiedu Capsule was affirmed by the validation. Results The total bacterial count was performed by a dopting medium dilution method and the total molds and yeasts count adopted the conventional plate -count method. The recovery rates of 5 kinds of test organisms were above 70%. Conclusion This method can be used for the microbial limit test of Yiganjiedu Capsule.

Key words:Yiganjiedu Capsule；Microbial Limit Test; Methodological Validation