小球藻Chlorella sorokiniana C74營養素分析

張玲，劉平懷，羅寧，陳晨，何沂飛，李昂（海南大學熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室/教育部熱帶多糖資源利用工程研究中心，海南?？?70228）

小球藻Chlorella sorokiniana C74營養素分析

張玲，劉平懷*，羅寧，陳晨，何沂飛，李昂
（海南大學熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室/教育部熱帶多糖資源利用工程研究中心，海南?？?70228）

測定小球藻Chlorellasorokiniana C74營養成分，為其綜合利用提供依據。結果顯示，Chlorella sorokiniana C74含有豐富的營養物質，粗蛋白、多糖、油脂、灰分、粗纖維和色素分別占藻粉干重的20.4%、34.28%、22.16%、12.20%、20.22%和4.50%。脂肪酸分析顯示Chlorella sorokiniana C74中含有多種不飽和脂肪酸，其中亞油酸和亞麻酸含量分別為22.73% 和14.87%；氨基酸含量為17.50%，其中必需氨基酸為6.17%，通過必需氨基酸指數評價，說明Chlorella sorokiniana C74是一種優質的蛋白來源；維生素含量豐富，尤其是維生素B1、B3和B6；藻粉含有多種礦物質元素，其中鉀、鎂、鈣、鐵和鋅5種元素含量較高，重金屬鉛、汞、砷和鎘含量均未超標。

小球藻；營養成分；分析

小球藻（Chlorella sorokiniana C74）為小球藻屬（Chlorella）的一種微藻，細胞呈球形，卵形或者橢圓形，是一種生長在池塘、湖泊的淺水港灣中微型（3 μm～8 μm）單細胞綠藻。近年來，國內外對小球藻（Chlorella sorokiniana）的研究集中在培養條件優化［1-2］、產油性能評價及污水廢氣處理等方面［3-5］，對其胞內營養物質研究較少。有研究顯示，不同營養元素條件下，小球藻的營養成分有顯著差異［6］。本研究對規?；囵B的小球藻C74進行一般營養成分、維生素、微量元素、氨基酸和脂肪酸等營養構成分析，為此株小球藻的開發利用提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1藻種

小球藻（Chlorella sorokiniana C74）：由海南大學生物工程綜合實驗室提供。

1.1.2試劑

維生素A（分析純）：阿拉??；維生素E（GR）：上海安譜科學；維生素B1、B2、B3、B6（分析純）：都萊生物；維生素B12（GR）：阿拉??；抗壞血酸（分析純）、5-磺基水楊酸（分析純）：廣州化學試劑廠。

1.1.3儀器

CR22GⅡ高速冷凍離心機：日立；LGJ-25C冷凍干燥機：北京四環儀器；TU-1810紫外可見分光光度計：普析通用；AA-6800原子吸收分光光度計：島津；X Series-電感耦合等離子體質譜儀：美國賽默飛世爾（Thermo Fisher）公司；TAS-990 Super AFG原子吸收光譜儀：普析通用。

1.2試驗設計

1.2.1開放式培養

向微藻培養管道加入適量的自來水（約700 L），加入微藻培養所需營養元素，主要添加有尿素、甘氨酸、磷酸二氫銨、氯化鐵等，另適當添加微量元素，打開管道循環泵（可調速），約30 min后接入種子液（50 L～80 L）?？刂茰囟炔怀^40℃。培養周期約7 d。培養結束后，6 000 r/min離心6 min，藻泥經去離子水洗滌3次，真空冷凍干燥后保存于-20℃冰箱，備用。營養成分見表1。

表1 營養成分組成Table 1　The composition of nutrition

1.2.2常規成分測定

蛋白質：雙縮脲法；總糖：蒽酮硫酸法；油脂：參照Luyen HQ［7］的方法測定；灰分：GB 5009.4-2010《食品安全國家標準食品中灰分的測定》灼燒重量法；粗纖維：GB/T 5009.10-2003《植物類食品粗纖維測定法》；色素參照Wellburn AR［8］的方法進行測定。

1.2.3脂肪酸分析

取藻粉0.5 g，加入0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液5 mL，震蕩混合10 min，60℃水浴10 min，待溶液冷卻后加入1%硫酸-甲醇溶液8mL，震蕩混合10min，50℃水浴10 min，依次加入2 mL水和3 mL正己烷，分層后收集上層溶液（正己烷），重復萃取1次，合并正己烷溶液，待揮發濃縮至1 mL后，0.22 μm微孔濾膜過濾，密封保存待檢測，通過氣質聯用儀進行檢測。

1.2.4氨基酸分析

1.2.4.1水解及檢測

稱取適量樣品于研缽中研磨破碎細胞壁，加入10%磺基水楊酸20 mL，混合均勻，于4℃下放置15 h～17 h，5 000 r/min離心6 min，濾液用4 mol/L NaOH調整pH至6.0，加入超純水定容至50 mL，取1 mL濾液用0.22 μm濾膜過濾，取混合氨基酸標準溶液及待測濾液10 μL，進行柱前衍生處理后采用Waters 2695液相色譜儀進行檢測。

色氨酸參照GB/T 15400-1994《飼料中色氨酸測定方法分光光度法》來測定。

1.2.4.2必需氨基酸指數（EAAI）

根據蛋白質飼料的評價方法——必需氨基酸指數（EAAI），評價氨基酸作為蛋白質的可用性。EAAI計算公式［9］如下：

式中：aai為待測樣品中某必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分數，%；AAi為參比蛋白質中該必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分數，%；n為必需氨基酸數。

1.2.5維生素含量測定

1.2.5.1樣品處理

水溶性維生素（維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6、維生素B12）：準確稱取一定量的小球藻藻粉于研缽中研磨破碎細胞壁，用15 mL 0.1 mol/L的鹽酸浸泡，用超聲清洗器振蕩15 min，5 000 r/min下離心6min，上清液過濾，取濾液100 μL進樣分析。

脂溶性維生素（維生素A、維生素E）：參照GB/T 5009.82-2003《食品中維生素A和維生素E的測定》處理樣品。

1.2.5.2檢測方法

1）維生素B1

Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動相：0.05 mol/L KH2PO4-乙腈（0.2%三乙胺，pH=6）= 97∶3；檢測波長為254 nm；流速1.5 mL/min。

2）維生素B2

Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動相：A為0.05 mol/L KH2PO4-乙腈（0.2%三乙胺，pH=6）=9∶1，B為甲醇，A∶B=75∶25；檢測波長270 nm；流速1.0 mL/min。

3）維生素B3

Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動相0.05 mol/L KH2PO4-甲醇=9∶1；檢測波長266nm；流速1.0 mL/min。

4）維生素B6

Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動相：A為0.05 mol/L KH2PO4-乙腈（0.2%三乙胺，pH=6）=97∶3，B為甲醇，A∶B=9∶1；檢測波長為226nm；流速1.2 mL/min。

5）維生素B12

Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；其他色譜條件參照GB/T 5009.217-2008。

6）維生素A、維生素E

色譜柱：Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動相：甲醇∶乙腈=1∶1；檢測波長325 nm（維生素A），295 nm（維生素E）；流速1.0 mL/min。

7）維生素C

參照GB/T 5009.86-2003《蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定熒光法和2，4-二硝基苯肼法》測定。1.2.6微量元素及重金屬測定

準確稱取0.2g藻粉于聚四氟乙烯坩堝中，加入5mL HNO3和2 mL H2O2為消解酸體系，加蓋后于電熱板上100℃加熱。2 h后，開蓋，將溫度升高至160℃繼續加熱，應經常搖動坩堝。當坩堝內溶液呈澄清狀時，消解完成，取下待其冷卻，用超純水輕輕沖洗坩堝蓋和內壁，定容至25 mL。

采用電感藕合等離子發射光譜-質譜（ICP-MS）方法，對小球藻中Mg、Ca、Fe、Cu、Zn、Se、Ga等28種微量元素進行定量分析，采用原子吸收光譜儀對Na、K兩種常量元素進行含量測定。

2　結果與分析

2.1常規成分

蛋白質、多糖、油脂是生命的三大物質基礎，是維持生命必不可少的營養成分，膳食纖維是健康飲食不可缺少的，纖維在保持消化系統健康上扮演著重要的角色，同時攝取足夠的纖維也可以預防心血管疾病、癌癥、糖尿病以及其它疾病。

按照《中華人名共和國國家標準》及相關文獻測定小球藻藻體內的粗蛋白、碳水化合物、油脂、色素、灰分、粗纖維等成分。測定結果見表2。

表2數據表明，小球藻中多糖含量最高（34.28%），其次為油脂，約占22%，有研究報道小球藻的油脂含量可達50%，說明小球藻具有作為產油微藻的潛能［3］。粗蛋白和粗纖維的含量相近，約為20%，蛋白含量在小球藻中相對較低，這可能與培養條件相關；灰分含量約占藻體干重的12%，微藻中的灰分含量及組成與自然條件和成熟度等因素有關［10］。小球藻中色素含量約為4.5%左右，葉綠素和類胡蘿卜素是細胞中的重要色素，其中葉綠素a是人類和動物血紅素的直接原料，被稱作是“綠色的血液”，類胡蘿卜素是一種高度不飽和化合物，具有抗氧化與增強免疫等功效。

2.2脂肪酸分析

脂質的主要功能是組成生物膜、提供能量、作為脂溶性物質的媒介。流行病學證明多食不飽和脂肪酸有利于身體健康，具有降血壓、降血脂以及抗動脈粥樣硬化、增強記憶力和思維能力等生理活性［11］。本研究采用氣相色譜和氣質聯用儀對小球藻脂肪酸成分進行定量和定性分析，結果見表3。

表2 小球藻主要營養成分的含量Table 2　Contents of main nutritional component in Chlorella sorokiniana C74

表3　小球藻脂肪酸的組成Table 3　Fatty acids composition of Chlorella sorokiniana C74

從表3可見，測定出13種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的72%，而且鏈長集中在C16～C18，其中順-9，12-十八碳二烯酸（亞油酸），順-9，12，15-十八碳三烯酸（亞麻酸）含量分別為22.73%和14.87%。亞油酸和亞麻酸是生命代謝的必需脂肪酸，是人體內高度不飽和脂肪酸（EPA和DHA等）的合成前體。有資料顯示必需脂肪酸不僅能夠吸引水分滋潤皮膚細胞，還能防止水分流失，具有改善高血壓、預防心肌梗死、預防膽固醇造成的膽結石和動脈硬化的作用。本研究中小球藻富含亞油酸和亞麻酸，可作為人體多不飽和脂肪酸的來源。

2.3氨基酸

研究表示，缺乏氨基酸可以導致人體營養不良，并出現多種不良反應。特別是老年人在缺乏蛋白質的情況下，極容易引起球蛋白和血漿蛋白的降低，導致老年人貧血。

氨基酸樣品經高效液相共檢測到17種氨基酸，包含7種人體必需氨基酸。另外，色氨酸通過分光光度法測得。氨基酸測定結果兼表4。

從表4可知，小球藻氨基酸含量為17.50%，其中必需氨基酸為6.17%，為總氨基酸的35.26%。

將小球藻必需氨基酸與幾種常見食物必需氨基酸進行比較［11］，見表5。

表4　小球藻氨基酸種類與含量Table 4　Contents of amino acid in Chlorella sorokiniana C74%

表5 小球藻及常見食物的必需氨基酸含量比較及EAAI值Table 5　The EAA comparation between Chlorella sorokiniana C74 and the common food and EAAI of microalgae with the common food as a reference

由表5可知，小球藻必需氨基酸高于玉米和小麥，低于大豆餅、亞麻仁餅、芝麻餅、魚粉、豬肉和對蝦。與常見食物相比，小球藻EAAI值均超過1，當n=6＞12時，EAAI＞0.95為優質蛋白源，說明小球藻是一種優良的植物蛋白源。

2.4維生素

小球藻中維生素測定結果見表6，小球藻與其它食物中維生素含量的比較如表7所示。

表6 小球藻維生素種類與含量Table 6　Contents of vitamin in Chlorella sorokiniana C74mg/100 g

表7　部分常見食物的維生素含量Table 7　Contents of vitamin in part of the common foodmg/100 g

表6顯示小球藻藻粉中含有多種維生素，其中水溶性維生素B1、維生素B3、維生素C以及脂溶性維生素E含量較高，分別為33.81、15.29、27.50、8.84 mg/100 g。表7列出了部分常見維生素食物的維生素含量［12］，通過比較表6和表7可知，小球藻中維生素B1及維生素B3的含量遠遠高于常規食物，維生素B1和維生素B3含量是分別是淀粉和瘦牛肉的3.75、2.43倍；維生素C的含量豐富，可與韭菜及橙相當；藻粉中維生素A、維生素E的含量較高，分別是雞蛋黃的1.35倍和1.75倍；小球藻藻粉中維生素B6含量為2.52 mg/100 g，高于常見食品；維生素B12含量低于動物類食品和黃豆，高于其他植物類食品，這是因為植物性食品中多不含維生素B12。Watanabe［13］研究發現可食性藻類富含維生素B12，如：紫菜含有具生物活性之維生素B12，含量為32 μg/100 g～78 μg/100 g干重。

維生素是維持身體健康所必需的一類有機化合物，有研究顯示，維生素B1具有保護神經系統的作用；還能促進腸胃蠕動，增加食欲；維生素B2能夠促進生長發育和細胞的再生，增進視力；維生素B3促進血液循環，使皮膚更健康，同時還能預防和緩解嚴重的偏頭痛；維生素C具有強的抗氧化能力，能抑制酪氨酸酶的形成，從而達到美白，淡斑的功效，是一種天然的抗氧化劑；維生素E能促進生殖，抗自由基氧化、抑制血小板聚集等多種作用，還對燒傷、凍傷、毛細血管出血、更年期綜合癥、美容等方面有很好的療效。本研究中小球藻藻粉維生素種類齊全，含量豐富，且多種成分高于常規食物，是一種天然的優質的維生素來源，加工成食品或保健品對改善維生素缺乏的人群的身體健康狀況具有重要的意義。

2.5微量元素及礦物質

小球藻中礦質元素和重金屬種類及含量分別見表8和表9。

表8　小球藻礦物質元素種類及含量Table 8　Contents of mineral element in Chlorella sorokiniana C74 mg/kg

表9　小球藻重金屬及含量Table 9　Contents of heavy metals in Chlorella sorokiniana C74

由表8、表9可知，小球藻含有豐富的礦物質元素，其中以鉀、鎂、鈣、鐵和鋅5種元素含量最高，分別為12 305.67、2 064.28、879.0、280.92 mg/kg和78.36 mg/kg。重金屬鉛、汞、砷、鎘的含量均較低，且均遠遠低于國家食品衛生標準（GB2762-2012《食品安全國家標準食品中污染物限量》），證明此藻粉是安全無毒害的。小球藻包含有多種人體必需微量元素，如銅、鐵、鋅、硒、鉬、鉻、鈷及鎳等。盡管這些微量元素在人體內含量極小，但它們對維持人體中的一些決定性的新陳代謝卻是十分必要的。鐵是構成血紅蛋白的主要成分之一，缺鐵可引起缺鐵性貧血；缺硒會引起大骨節病發生，主要發生于青少年，嚴重地影響骨發育和日后勞動生活能力。國外曾有報道，機體內含鐵、銅、鋅總量減少會降低免疫能力，助長細菌感染。小球藻富含多種礦物質元素，由此可推斷小球藻具有作為人體必需微量元素的重要來源的潛能。

3　結論

小球藻細胞中含有豐富的營養成分，粗蛋白質、多糖、油脂、灰分、粗纖維和色素分別占藻粉干重的20.4%、34.28%、22.16%、12.20%、20.22%和4.50%。小球藻細胞成分的利用除了提取油脂外，還應得到綜合利用。例如在提取油脂制備生物柴油后，用于蛋白和多糖的提取，蛋白質可以作為人體或動物食品的蛋白添加，而小球藻多糖具有調節機體免疫、抗腫瘤、抗病毒和抗輻射等多種生物學活性，可開發成保健食品或醫藥原料。

小球藻除了含有大量的蛋白質、多糖和油脂等營養成分外，還含有多種活性物質，具有較高的綜合利用價值。脂肪酸分析顯示藻粉中含有多種不飽和脂肪酸，其中包含兩種人體必需氨基酸——亞油酸和亞麻酸，含量分別為22.73%和14.87%；氨基酸種類豐富，必需氨基酸含量較高，可以作為人體或動物食品的蛋白來源；維生素含量豐富，尤其是維生素B1、B3和B6，可加工成食品或維生素保健品，改善因維生素缺乏而引起的不良反應；藻粉含有多種生長的必需常量和微量礦物質元素，其中鉀、鎂、鈣、鐵和鋅5種元素含量較高，重金屬鉛、汞、砷和鎘含量未超標，符合食品安全標準。

總之，小球藻細胞含有多種值得利用的成分，對其利用應不僅局限在制備生物柴油上，對其綜合利用也應更加全面。

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Nutrient Analysis of Chlorella sorokiniana C74

ZHANG Ling，LIU Ping-huai*，LUO Ning，CHEN Chen，HE Yi-fei，LI Ang
（Key Study Center of the National Ministry of Education for Tropical Resources Utilization/Ministry of Education Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Determination of Chlorella sorokiniana C74 nutrients，the results showed that Chlorella sorokiniana C74 contains kinds of nutrients，crude protein，carbohydrates，fat，ash，crude fiber and pigment was accounted for 20.4%，34.28%，22.16%，12.20%，20.22%and 4.50%by algae powder dry weight respectively. Fatty acid analysis showed that algae powder contains a variety of unsaturated fatty acids，and linoleic acid and linolenic acid contents were 22.73%and 14.87%.Contents of amino acid in Chlorella sorokiniana C74 was 17.50%，of which the essential amino acids was 6.17%.Through essential amino acid index evaluation，indicating that Chlorella sorokiniana C74 was an excellent source of protein；Chlorella sorokiniana C74 was rich in vitamins，especially vitamin B1，B3and B6.Algae powder contains a variety of trace mineral elements，and potassium，magnesium，calcium，iron and zinc was higher，the heavy metal lead，mercury，arsenic and cadmium was no more than the national standard.

Chlorella sorokiniana；nutritional components；analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.003

國家科技支撐計劃項目課題（2011BAD14B01）；海南省中藥現代化科技專項（ZY201327）；國家科技型中小企業技術創新基金（13C26244604892）；海南省產學研一體化項目（CXY20150034）

張玲（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：微藻生物質能源。
*

劉平懷（1967—），男，教授，藥學研究員，主要從事微藻生物質能源及天然產物的研究。

2015-04-07