響應面法優化葡萄籽蛋白質提取工藝

吳芳，李開雄，李應彪，陳帥，許程劍（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

響應面法優化葡萄籽蛋白質提取工藝

吳芳，李開雄，李應彪，陳帥，許程劍*
（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

為了提高赤霞珠葡萄籽的有效利用率，采用堿溶酸沉法提取葡萄籽中的蛋白質，并通過響應面法優化提取條件。在單因素試驗的基礎上，依據Central Composite中心組合設計原理，采用Design-Expert.8.05數據分析軟件，對蛋白質提取進行四因素三水平的優化分析。確立最佳提取條件：NaOH濃度0.001mol/L，提取溫度45℃，提取時間40 min，料液比1∶25（g/mL），在此條件下蛋白質的提取理論值達到9.75mg/g。

響應面法；堿溶酸沉；葡萄籽蛋白質

葡萄是世界普遍栽培的水果之一，大部分的葡萄用于釀酒，近幾十年來我國的葡萄酒行業發展迅猛，在葡萄酒的加工過程中，有約20%～30%的葡萄皮渣、籽等下腳料，大部分酒廠會直接扔掉或廉價賣給農民做飼料及燃料。這樣做不僅造成了環境污染，而且也是資源的浪費。而從中提取出有效物質并進行加工利用，既可以降低生產成本，又可以提高資源的利用率［1-2］。隨著對葡萄皮籽中化學成分的深入研究，發現葡萄皮籽中有豐富的營養物質，如油脂、蛋白、原花青素等。

目前，對葡萄籽的開發利用引起的國內外廣泛的關注，主要集中在葡萄籽油、抗氧化物質的提取與利用，而對葡萄籽蛋白的提取利用較少。葡萄籽制油后的餅粕中含有13%～16%的蛋白質，采用脫殼制油工藝餅粕蛋白質含量高達30.39%，且葡萄籽蛋白含有18種氨基酸，人體必需的8種氨基酸俱全，其中纈氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸含量都相當于大豆蛋白中的含量，由于其含有豐富的多種氨基酸、維生素及礦物質等，具有保健、美容之功效［2］。為合理利用這一資源，我們對新疆石河子本地的葡萄品種赤霞珠葡萄籽蛋白質的提取進行了研究。

1　材料與方法

1.1主要材料和儀器

赤霞珠葡萄籽：新疆石河子市；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、石油醚、氫氧化鈉、95%乙醇、磷酸等：均為國產分析純。

FW80型粉碎機：溫嶺市百樂粉碎設備廠；BS224S型分析天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；GRX20型干熱消毒箱：上海精宏實驗設備有限公司；SH21-1型磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；其他為實驗室常規儀器。

1.2方法

1.2.1蛋白質標準曲線的繪制

取6支試管（編號1、2、3、4、5、6）分別加入100μg/mL牛血清蛋白（BSA）0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL。各管用蒸餾水補齊至1.0 mL。各加考馬斯亮藍工作液5 mL?；旌暇鶆蚝笥诜止夤舛扔?95 nm處測吸光值，1 h內測完。以BSA濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2赤霞珠葡萄籽蛋白質等電點測定

將堿溶上清液的pH分別調到3.50、3.68、3.80、3.90、4.00、4.10、4.20、4.40、4.60、5.00，靜置30 min后離心，測定上清液蛋白質含量，含量最少的即為葡萄籽蛋白質的等電點。

1.2.3赤霞珠葡萄籽的預處理

將葡萄籽通過粉碎機粉碎，過40目篩。稱取40 g葡萄籽粉于250 mL燒杯中，按1∶5（g/mL）的料液比加入石油醚放在磁力攪拌器上攪拌6 h后，靜置5 min～6 min使固液分離，倒出上清液回收利用。然后向固相中按1∶10（g/mL）的料液比重新倒入石油醚，磁力攪拌6 h，倒出上清液回收利用，固相葡萄籽粉用蒸餾水清洗后曬干收集備用。

1.2.4葡萄籽蛋白質提取工藝流程

葡萄籽→預處理→堿溶酸沉［3］→離心（4 000 r/min，15 min）取上清液→加酸調節等電點→離心取沉淀→冷凍干燥→葡萄籽蛋白質

1.2.5單因素試驗

選擇影響蛋白質得率的因素：浸提溫度（30、35、40、45、50℃）、浸提時間（20、30、40、50、60 min）、NaOH濃度（1×10-5、5×10-5、10×10-5、50×10-5、100×10-5mol/L）、料液比［1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）］進行單因素試驗，分別考察各個單因素對葡萄籽蛋白質提取的影響。

1.2.6響應面優化試驗

在單因素的基礎上，選取對葡萄籽蛋白質提取效果影響較大的4個因素，采用響應面分析軟件Design-Expert.8.05建立四因素三水平的Central Composite模型，通過試驗確立最佳提取工藝參數。變量因素編碼表及水平見表1。

1.2.7數據分析

試驗一式三份進行，數據值為平均值±標準偏差（SD）。數據分析采用Origin 8.0以及Design-Expert. 8.05軟件。

表1　響應面自變量因素編碼及水平Table 1　Factors and levels in response surface test

2　結果與討論

2.1蛋白質含量測定的標準曲線

蛋白質含量標準曲線見圖1。

圖1　蛋白質含量標準曲線Fig.1　The standard curve of protein content

如圖1所示，蛋白質含量的標準曲線為y=0.00748x+ 0.008 05，R2=0.998 5。

2.2赤霞珠葡萄籽蛋白質等電點的測定

赤霞珠葡萄籽蛋白質的等電點測試見圖2。

圖2　蛋白質等電點的測定Fig.2　The determination standard of isoelectric point on protein

蛋白質在等電點沉淀的最多，上清液中蛋白質殘留越少說明沉降的蛋白質的量越多［4］，由圖2可知，赤霞珠蛋白質的等電點為pH 3.8。

2.3單因素試驗結果

2.3.1提取溫度對提取量的影響

在提取時間30 min、料液比1∶10（g/mL）、NaOH濃度0.01 mol/L、不同溫度的條件下，赤霞珠葡萄籽蛋白質的提取量如圖3所示。

圖3　溫度對蛋白質提取的影響Fig.3　Influence of temperature on protein extraction

由圖3可知，最佳提取溫度為45℃，之后隨著溫度的升高葡萄籽蛋白質提取量下降，可能是溫度過高導致蛋白質變性，溶解度降低。

2.3.2提取時間對提取量的影響

在提取溫度45℃、料液比1∶10（g/mL）、NaOH濃度0.01 mol/L、不同時間的條件下，葡萄籽蛋白質的提取量如圖4所示。

圖4　提取時間對蛋白質提取的影響Fig.4　Influence of time on protein extraction

由圖4可知，隨著浸提時間的延長蛋白質的提取量也隨之增長，在40 min之后增加較為緩慢，考慮到能耗等問題，最佳提取時間選取40 min為宜。

2.3.3NaOH濃度對提取量的影響

在提取溫度45℃、料液比1∶10（g/mL）、提取時間40 min、不同NaOH濃度的條件下，葡萄籽蛋白質的提取量如圖5所示。

由圖5可知，隨著NaOH濃度的升高，蛋白質的提取率也逐漸升高，但濃度過高會導致蛋白質變性，導致提取量變低［5］，綜合考慮選取NaOH濃度為50× 10-5mol/L為宜。

2.3.4液料比對提取率的影響

在提取溫度45℃、NaOH 50×10-5mol/L、提取時間40 min、不同液料比的條件下，葡萄籽蛋白質的提取量如圖6所示。

圖5NaOH濃度對蛋白質提取的影響Fig.5　Influence of the concentration of NaOH on protein extraction

圖6　液料比對蛋白質提取的影響Fig.6　Influence of liquid to solid ratio on protein extraction

由圖6可知，隨著液料比的增加，蛋白質溶解的量也增大，所以赤霞珠葡萄籽蛋白質的提取量也增加，但是在液料比在1∶20（g/mL）之后，蛋白質的提取量增加緩慢，綜合考慮，選取料液比1∶20（g/mL）為宜。

2.4響應面優化分析

赤霞珠葡萄籽蛋白質提取的響應面試驗設計及結果見表2，蛋白質提取量回歸模型方差分析見表3。

表2　響應面試驗設計及結果Table 2　Test design and results of response surface

續表2　響應面試驗設計及結果Continue table 2　Test design and results of response surface

表3　蛋白質提取量回歸模型方差分析Table 3　Analysis of variance to the extraction volume of protein

根據表2響應面分析法試驗結果，對試驗數據進行多元回歸擬合分析［6］，得到葡萄籽蛋白提取量與各因素變量的二次方程模型：蛋白質的提取量=3.89-0.14×A+0.49C+4.21×D-0.30×A×B-0.35×A×B+0.44×C× D-0.23×A2-0.22×B2+0.66×D2

由表3中的回歸模型的方差分析可知，模型的P＜0.000 1，失擬項的P=0.079 3＞0.05，不顯著，表明建立的該模型可以用來分析和預測葡萄籽蛋白提取的工藝參數。同時由表3中的回歸模型顯著性分析可知，A、C、D、AB、AC、CD、A2、B2、D2對葡萄籽蛋白提取率的影響顯著，B對葡萄籽蛋白得率的影響不顯著。

溫度與時間、溫度與NaOH濃度、NaOH濃度與料液比互作用的等高線和響應面圖分別見圖7、圖8、圖9。

圖7　溫度與時間互作用等高線和響應面圖Fig.7　Response surface and contour plots of temperature and time

圖8　溫度與NaOH濃度互作用等高線和響應面圖Fig.8　Response surface and contour plots of temperature and NaOH concentration

圖9　NaOH濃度與料液比互作用等高線和響應面圖Fig.9　Response surface and contour plots of NaOH concentration and liquid to solid ratio

由圖7可得，等高線圖呈橢圓形，說明溫度與時間之間的交互作用顯著，由溫度與時間的3D圖可看出，葡萄籽蛋白提取率隨溫度變化的坡度較陡，彼此之間的交互作用較顯著［7］，與回歸模型的方差分析結果相符。

由圖8可得，溫度和NaOH濃度的等高線圖呈橢圓形，說明兩者之間的交互作用較顯著，并且由溫度和NaOH的3D圖可知，葡萄籽蛋白提取率隨溫度變化的坡度較陡，溫度對其影響較大，兩者之間的交互作用較顯著［8］，與回歸模型的方差分析結果相符。

由圖9可得，等高線圖直線圓形，說明NaOH濃度和液料比之間的交互作用不顯著，由NaOH濃度和液料比的3D圖可看出，葡萄籽蛋白提取率隨液料比變化的坡度較陡，彼此之間的交互作用較不顯著。

2.5響應面結果分析及驗證試驗

由模型方程計算可得，葡萄籽蛋白提取率的最優試驗方案為溫度45.17℃、時間49.57min、料液比1∶ 25（g/mL），在此條件下的蛋白提取率的理論值達到9.78 mg/g。根據試驗的實際情況將試驗條件調整為溫度45℃、時間40 min、料液比1∶25（g/mL），重復試驗3次，最終得到的葡萄籽蛋白提取率的平均值為9.75 mg/g，與理論值基本一致。結果表明，該模型可以較好地反映出葡萄籽蛋白提取的條件，從而也證明了響應曲面法優化提取葡萄籽蛋白條件參數的可行性。

3　結論

在本文中，通過響應面法全面且直觀地分析了各因素對葡萄籽蛋白提取率的影響，以及各因素之間對提取過程的交互影響，建立了二次多項式數學模型，經驗證該模型合理可靠，表明影響浸提效果的主要因素是溫度與料液比。赤霞珠葡萄籽蛋白質最佳提取條件為：浸提溫度45℃，料液比1∶25（g/mL），浸提時間40 min，NaOH濃度0.001 mol/L，經過驗證試驗，葡萄籽蛋白的提取量為9.75 mg/g，工藝參數可供生產應用參考。

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Optimizing Extraction Technology of Protein from Grape Seed with Respones Surface Methodology

WU Fang，LI Kai-xiong，LI Ying-biao，CHEN Shuai，XU Cheng-jian*
（College of Food Sciences，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

Alkali-solution and acid-isolation method was used to extract protein from Cabernet Sauvignon grape seed to improve the utilization rate of grape seed，in which respones surface analysis was used to optimize extraction conditions.Based on the single factor experiments，the Central Composite design principles and Design-Expert.8.05 data ananlysis software were used to select four parameters of response surface design to optimize extraction process.The result showed the optimize extraction conditions：the concentration of NaOH 0.001 mol/L，extraction temperature 45℃，extraction time 40 min，liquid to solid ratio 1∶25（g/mL），the extraction value was 9.75 mg/g.

respones surface methodology；alkali-solution and acid-isolation；grape seed protein

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.025

吳芳（1982—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品加工與安全。
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許程劍（1978—），男，副教授，工學博士，天然產物制備與功能活性研究。

2015-04-20