黃芪注射液對大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡的影響

孫艷秋

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黃芪注射液對大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡的影響

孫艷秋

（河北省承德市中醫院， 河北 承德 067000）

【摘 要】目的：探討黃芪注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其可能的作用機制。方法：大鼠腦缺血再灌注模型的制備采用改良的四血管（4-VO）阻斷法。采用TUNEL法檢測海馬神經元凋亡情況，RT-PCR法和免疫組織化學法分別檢測caspase-3 mRNA及蛋白的表達。結果：模型組大鼠海馬組織神經細胞凋亡指數及caspase-3表達均明顯增多，與假手術組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）；而黃芪注射液可明顯抑制腦缺血再灌注后的神經細胞凋亡，減少caspase-3的表達，與模型組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論：黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠腦損傷具有明顯的腦保護作用，該作用機制可能與抑制caspase-3表達有關。

【關鍵詞】黃 芪； 注射液； 腦缺血再灌注； caspase-3； 凋 亡

腦缺血再灌注后的神經細胞凋亡是腦損傷的重要標志，同時也可以作為檢測藥物療效的指標［1］。細胞凋亡的發生是一個由基因調控的自主性、程序性細胞死亡過程，其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）的表達與細胞凋亡密切相關。黃芪注射液是中藥黃芪提取物制成的針劑，每毫升含生藥2g，是臨床治療缺血性腦血管病的常用藥物，療效確切［2］，但目前對其發揮腦保護作用的具體機制尚無統一意見。本實驗采用改良的四血管阻斷法建立腦缺血再灌注大鼠模型，通過觀察黃芪注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及對caspase-3表達的影響，以探討其治療腦血管病的作用機制。

1　材料與方法

1.1 實驗動物及試劑：選用成年健康SD大鼠72只，體質量220～280g，清潔級。原位細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche公司；兔抗大鼠caspase-3多克隆抗體購自美國Bioworld公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司；RT-PCR試劑盒購于大連寶生物公司。

1.2 方 法

1.2.1 分組及模型的制備：實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組和黃芪注射液組（每組24只動物）。腦缺血再灌注大鼠模型的制備采用改良的四血管阻斷法。首先采用直徑0.5mm的電凝針燒灼雙側椎動脈，造成永久性閉塞。術后恢復24h，然后再分離雙側頸總動脈，用血管夾夾閉30min，造成短暫性腦缺血，然后松開血管夾恢復腦血流灌注。假手術組不夾閉血管，只需要切開皮膚后分離血管。黃芪注射液組造模前連續給藥3d，每天腹腔注射黃芪注射液6mL/kg。

1.2.2 標本制備：腦血流恢復24h后從每組大鼠中隨機選取8只，處死后取海馬組織，石蠟包埋，制成4μm厚連續切片；而其余各組大鼠處死后于低溫環境下分離海馬組織，-80℃保存，備用。

1.2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡：石蠟切片經二甲苯脫蠟、酒精脫水后按TUNEL試劑盒具體方法操作染色后顯微鏡觀察。凋亡細胞核呈棕黃色染色。于400倍光鏡下計數海馬CA1區中1/3段內凋亡細胞數，并計算凋亡指數（Apoptosis Index，AI）。AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4 RT-PCR法檢測caspase-3 mRNA表達：稱取凍存的各組大鼠海馬組織，按試劑盒操作說明用TRIzol一步法提取RNA后并逆轉錄為cDNA，PCR儀擴增后采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。數據分析使用的是凝膠分析軟件Quantity one。

1.2.5 免疫組化法檢測caspase-3蛋白表達：取各組大鼠海馬組織的石蠟切片脫蠟至水，按試劑盒說明書步驟操作，caspase-3一抗濃度為1：100，DAB顯色后封片觀察。陰性對照片采用PBS代替一抗。于400倍光鏡下隨機選取4個視野進行觀察，選用Med6.0軟件測定陽性反應物的灰度值。

2　結 果

2.1 海馬神經細胞凋亡指數：凋亡細胞的細胞核呈棕黃色細顆粒狀，假手術組大鼠的海馬區僅有少量細胞凋亡。與假手術組相比，則模型組大鼠海馬組織的神經細胞凋亡指數則明顯增高（P＜0.05）；，與模型組相比，黃芪注射液組大鼠海馬組織神經細胞的凋亡指數明顯減少（P＜0.05），結果見表1。

表1　各組大鼠海馬組織神經細胞凋亡情況

2.2 各組大鼠海馬組織caspase-3表達情況：各組大鼠海馬組織caspase-3的表達趨勢在免疫組化和RTPCR結果是一致的。假手術組大鼠海馬組織caspase-3 mRNA及蛋白均呈弱表達，而模型組大鼠海馬組織caspase-3 mRNA及蛋白表達明顯增多，與假手術組相比差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪注射液組大鼠海馬組織caspase-3 mRNA及蛋白的表達明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖1，表2、3。

圖2　各組大鼠海馬組織Caspase-3 RT-PCR結果

表2　各組大鼠海馬組織Caspase-3mRNA表達情況

表3　各組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達情況

3　討 論

腦血管病是目前世界上最常見的疾病之一，由于其發病率高、致殘率高、死亡率高的特點，對人類生命及健康的危害性極大。缺血性腦血管病的主要治療方法即溶栓治療，目的是使腦血流恢復再灌注，但一些患者在缺血再灌注后不僅組織功能沒有得到恢復，反而進一步加重缺血所導致的功能障礙和結構破壞，即腦缺血再灌注損傷。因此積極尋求預防及治療腦缺血再灌注損傷的藥物及治療是治療腦血管病的關鍵。

腦缺血再灌注后的神經細胞死亡與凋亡有關，這個觀點是Shigeno等［3］于1990年首先提出的。細胞凋亡是由 caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應。caspase家族是哺乳動物細胞凋亡的啟動著和執行者，其中Caspase-3是整個凋亡過程的核心環節，它的激活可通過裂解DNA依賴性的蛋白激酶，改變其結構，最終導致細胞凋亡的發生［4］。

本實驗采用先進的凋亡細胞檢測技術TUNEL法來檢測細胞凋亡。內源性核酸內切酶在核小體間切斷DNA鏈，產生大量的3’-OH是細胞凋亡的生化反應特點，TUNEL法就是基于該原理而創建的，該方法可在組織切片上顯示出尚未發生形態改變的早期凋亡細胞，并進行原位定量定性分析，是最常用亦為特異性細胞凋亡檢測方法［5］。本研究通過TUNEL法檢測細胞凋亡，結果顯示在腦缺血再灌注大鼠的海馬區可檢測到較多的凋亡細胞，說明腦缺血再灌注后的神經細胞凋亡確是細胞死亡的途徑之一，這一結果與既往研究結果相一致［6］。本研究還發現大鼠腦缺血再灌注前連續3d腹腔注射黃芪注射液可明顯減少大鼠海馬區的神經細胞凋亡，說明腦缺血后預防性應用黃芪注射液可以減少再灌注引起的腦損傷，從而起到腦保護作用。

【參考文獻】

［1］ 陳建珍，葉蓓.復方丹參注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響［J］.中國老年學雜志，2011，31（14）：2711～2713.

［2］ Lipton P.Ischemic cell death in brain neurons［J］.Physiol Rev，1999，799（4）：1431.

［3］ Shigeno T，Yamaski Y，Kato G，et al.Reduction of delayed neuronal death by inhibition protein synthesis［J］.Neurosci Lett，1990，120（1）：117～119.

［4］ 袁恒杰，陳宇華，任耘，等.丹參素鈉對大鼠腦缺血再灌注損傷耐缺氧作用研究［J］.中國醫院藥學雜志，2010，30 （18）：1545～1549.

［5］ Gavrieli Y，Shermany，Ben Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation［J］.Cell Biol，1997，119（3）：493～501.

［6］ 張亞麗，高維娟，閆鳳霞，等.黃芪注射液抑制缺氧缺糖后復氧復糖大鼠海馬神經細胞凋亡的研究［J］.中國老年學雜志，2009，29（7）：793～796.

【文章編號】1006-6233（2016）07-1147-03

【文獻標識碼】A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.07.036