GPER介導雌激素對兔耳增生性瘢痕的影響

邵 寧, 程代薇, 曾 琪, 鄭慶桂, 錢 寧, 吳曙光

作者單位：563003 貴州 遵義，遵義醫學院(邵 寧,曾 琪)；貴州省人民醫院 燒傷整形科(程代薇,鄭慶桂);貴陽中醫學院 實驗動物中心(錢 寧,吳曙光)

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GPER介導雌激素對兔耳增生性瘢痕的影響

邵 寧, 程代薇, 曾 琪, 鄭慶桂, 錢 寧, 吳曙光

G蛋白偶聯雌激素受體； 增生性瘢痕； 轉化生長因子

皮膚及其附件是雌激素(E2)的重要靶器官之一，所以,E2對于瘢痕的形成具有影響作用[1]。有研究表明，通過阻斷E2來治療瘢痕增生是有效的[2]。但是，如果單純為了阻斷瘢痕生長而直接抑制E2會帶來各種嚴重的不良反應，如骨質疏松、心血管疾病、更年期綜合征等[3],而這些不良反多以E2核受體為主導，G蛋白偶聯雌激素受體(G protein coupled estrogen receptorgper, GPER)對其影響相對較小。研究還發現，GPER與多種腫瘤細胞的增殖存在密切關系，而增生性瘢痕與腫瘤也有相似的細胞學特性。自2015年3～9月，我們通過建立兔耳增生性瘢痕模型，局部應用17-β-雌二醇(E2)、GPER特異性激動劑(G1)和拮抗劑(G15)來觀察瘢痕的增生情況，并檢測瘢痕增生的相關因子和GPER的mRNA表達量，以探討GPER在對增生性瘢痕的影響，為臨床治療增生性瘢痕提供新的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇3～6個月齡健康的新西蘭大耳兔36只(由第三軍醫大學實驗動物中心提供)，均為雌性；體質量2.5～3.0 kg。將36只兔造模后隨機分為6組：空白對照組、DMSO組、E2組、G1組、 E2+G15組、G1+G15組；每組6只。

1.2 主要材料與儀器

17-β-雌二醇(E2)和二甲基亞砜(DMSO；美國SIGMA公司)；GPER特異性激動劑(G1)及其特異性拮抗劑(G15；美國CAYMAN公司)；鹽酸氯胺酮(英國TOCRIS公司)；鹽酸塞拉嗪(英國LGC公司)；戊巴比妥鈉(德國MERCK公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 兔耳瘢痕模型制備 參照文獻[4]方法：每只兔給予肌注氯胺酮(40 mg/kg)和鹽酸塞拉嗪(4 mg/kg)麻醉后，用無菌手術刀在兔的單側耳腹面共做6個直徑為10 mm的圓形創面，間距大于15 mm,深達軟骨層并刮除軟骨膜，創面暴露，自然愈合。每日觀察創面情況，確保創面干燥無感染。

1.3.2 分組給藥及組織處理 參照小鼠的皮下給藥劑量[5]，根據體表面積直接換算法[6]，設計出給藥方案。E2組、G1組、 E2+G15組、G1+G15組4個給藥組分別用微量注射器在兔耳根部皮下注射。注射劑量：E2(0.025 mg/kg·d),G1(0.06 mg/kg·d),G15(0.06 mg/kg·d)。DMSO組注射經PBS稀釋為10%DMSO溶液；對照組不予任何處理。從第15天開始給藥[7]，連續給藥15 d后取標本。采用戊巴比妥鈉90 mg/kg于兔心內注射，將其處死；距瘢痕邊緣0.5 mm切取標本,并經瘢痕最高點將其一分為二，分別放入10%甲醛及RNAiso Plus液中固定，保存于-80℃冰箱中。

1.3.3 組織學檢測 將切取標本在10%甲醛中固定24 h后，石蠟包埋，并切成5 μm厚，分別進行HE染色和MASSON 染色，用于光鏡下組織學觀察及瘢痕增生指數測量(圖1)[8]。

圖1 瘢痕增生指數

1.3.4 RT-PCR法檢測增生性瘢痕組織中TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達 將兔耳瘢痕組織標本浸于TRIZOL試劑并提取總RNA后，利用PrimeScript?RT Master Mix試劑盒逆轉錄合成cDNA。根據其在目的基因ncbi庫中的對應序列，利用PRIMER 5軟件分別設計特異引物(表1)。最后選擇GAPDH 為內參，通過SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行qRT-PCR檢測。記錄各樣本Ct值作為統計參數，利用 2-ΔΔCt公式計算各個基因mRNA相對表達。實驗至少重復3次。

表1 各基因引物序列及產物大小

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 瘢痕形態學觀察

E2和G1組較對照組瘢痕明顯凸出皮表，顏色較深，多呈暗紅色，中央部最為厚實，質地較硬；經G15處理后，瘢痕中央厚度明顯降低，顏色較淺呈粉紅色，部分與正常皮膚接近，質地明顯變軟；而DMSO組與對照組差別較小(圖2)。

2.2 組織學觀察

2.2.1 HE 染色 經HE染色后鏡檢，E2組和G1組存在大量的成纖維細胞，血管生長豐富，細胞外基質有大量沉積，膠原纖維多且粗大；經G15處理后，成纖維細胞明顯減少，血管分布較少，細胞外基質沉積減少，膠原纖維也相對減少；DMSO組相對于空白對照組的變化不明顯。見圖3。

2.2.2 Masson 染色 經Masson染色后鏡檢，E2組和G1組的膠原纖維致密粗大，排列紊亂；經G15處理后，膠原纖維稀疏，排列較整齊；DMSO組相對于空白對照組的膠原纖維差別較小(圖4)。

2.3 瘢痕增生指數

E2和G1明顯高于空白對照組(P<0.05)，E2+G15組和G1+G15組分別低于E2和G1組(P<0.05)，而空白對照組和DMSO組比較，其差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

2.4 兔耳瘢痕組織中TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達

結果顯示：E2和G1組的表達量均明顯高于空白對照組(P<0.05)；而E2和G1組經G15處理后的表達量均明顯降低(P<0.05)；DMSO組與空白對照組比較，其差異無統計學意義(P>0.05，圖6)。

3 討論

圖2 各組兔耳瘢痕形態對比 a.對照組 b.DMSO組 c.E2組 d.G1組 e.E2+G15組 f.G1+G15組 圖3 兔耳瘢痕組織HE染色(×200) a.對照組 b.DMSO組 c.E2組 d.G1組 e.E2+G15組 f.G1+G15組

Fig 2 Comparison of the morphology of rabbit scar in each group. a.control group. b.DMSO group. c.E2 group. d.G1 group. e.E2+G15 group. f.G1+G15 group. Fig 3 HE staining of rabbit scar tissue (×200). a.control group. b.DMSO group. c.E2 group.d.G1 group. e.E2+G15 group. f.G1+G15 group.

圖4 兔耳瘢痕組織Masson染色(×200) a.對照組 b.DMSO組 c.E2組 d.G1組 e.E2+G15組 f.G1+G15組 圖5 E2、G1和G15組對于瘢痕指數的影響[ns:無顯著差異,*：P<0.05 (n=18)] 圖6 Real-time PCR檢測瘢痕組織中TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達[ns:無顯著差異,*：P<0.05 (n=6)] a.TGF-β1的mRNA的表達 b.膠原Ⅰ的mRNA的表達 c.膠原Ⅲ的mRNA的表達 d.GPER的mRNA的表達

Fig 4 Masson staining of rabbit scar tissue (×200). a.control group. b.DMSO group. c.E2 group. d.G1 group. e.E2+G15 group. f.G1+G15 group. Fig 5 The effect of E2、G1 and G15 on SEI [ns: not significant,*:P<0.05 (n=18)]. Fig 6 Expression of TGF-β1, collagen Ⅰ, collagen Ⅲ and GPER determined by real-time PCR analysis [ns: not significant,*:P<0.05 (n=6)].a. expression of TGF-β1 mRNA. b. expression of collagen Ⅰ. c. expression of collagen Ⅲ. d. expression of GPER.

雌激素通過與雌激素受體特異性結合，形成E2-受體復合物才能發揮其生物學效應，包括E2核受體Erα和Erβ 2個亞型。隨后研究發現，E2還存在1個G蛋白偶聯受體。2009年，國際藥理學聯合會正式將其命名為GPER。E2通過GPER快速激活細胞的第二信使系統，間接調節第一系列基因轉錄，從而在各種細胞類型中發揮生物學效應[9]。大量的研究發現，GPER在多種癌細胞中均有表達并促進其增殖和存活[10]。如惡性乳腺癌[11]、套細胞淋巴瘤[12]、肺癌[13]、平滑肌瘤[14]等。而增生性瘢痕的細胞病理學特性與腫瘤極為相似，因此，本實驗探究GPER對于增生性瘢痕是否有影響。在觀察中發現，使用E2相比對照組的兔耳瘢痕增生明顯，并且檢測瘢痕組織中TGF-β1 、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ[15]和GPER的mRNA表達量也同比增高。這與之前文獻報道一致[16]。E2能夠促進瘢痕增生，但GPER是否在其中產生影響，尚未確定。因此，本實驗設計給藥GPER特異性激動劑(G1)和拮抗劑(G15)，并觀察瘢痕增生的情況。我們發現，使用G1與使用E2的兔耳瘢痕增生情況十分相似，經G15處理后的兔耳瘢痕比G1和E2組明顯扁平、變軟，顏色接近周圍正常皮膚，而且成纖維細胞及膠原纖維減少，且排列整齊；觀察檢測瘢痕組織中，TGF-β1、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達量也明顯下降。這表明：⑴GPER對于瘢痕有明顯的影響作用，而激活GPER可促進瘢痕形成，反之則抑制。⑵GPER拮抗劑(G15)同樣能抑制E2對瘢痕的促進作用，進一步說明GPER在E2促進瘢痕增生中發揮著重要作用。但是，E2核受體對瘢痕有無影響尚需進一步研究證實。

綜上所述，E2在增生性瘢痕的作用中GPER發揮著十分重要的作用。GPER不僅是腫瘤治療的新型靶點，而且也是治療增生性瘢痕的潛在靶點。但是，由于GPER是新興的研究熱點，其介導的信號通路紛繁復雜，究竟是哪條信號通路起作用，還有待進一步研究。

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Influences of estrogen mediated by GPER on hypertrophic scar in rabbit ears

SHAONing,CHENGDai-wei,ZENGQi,ZHENGQing-gui,QIANNing,WUShu-guang.

(ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

ChengDai-wei,Email:dwcheng0851@163.com

Objective To observe the influences of G protein-coupled estrogen receptor (GPER) on hypertrophic scar of rabbit ears. Methods Thirty-six New Zealand white rabbits were chosen to establish the models of hyperplastic scar in rabbit ears. Rabbit models were randomly assigned to 6 groups, in which E2, G1, E2+G15, G1+G15, DMSO and blank control groups; Specimens were taken at 15 days after receiving subcutaneous injection at the ear roots of the rabbits and observations were made in each group. The scar elevation index (SEI), fibroblasts quantity, orientation of collagen fiber and real-time quantitative PCR detected the expressions of TGF-β1, collagen Ⅰ, collagen Ⅲ and GPER mRNA. Results Compared with the blank control group, the scar hyperplasia in the E2 and G1 groups was obvious with more fibroblasts and higher collagen density with irregularly arrangement; that in the E2 and G1 groups significantly reduced after G15 treatment by gross observation and microscopic examination. The SEI and the expression of TGF-β1, collagenⅠ, collagen Ⅲ, and GPER mRNA were significantly higher in those in the E2 and G1 groups compared with the blank control group (P<0.05), which were lower in the E2 and G1 groups treated with G15 treatment (P<0.05); the DMSO group. The blank control group had few obvious differences (P>0.05). Conclusion Estrogen mediated by GPER has a promoting effect on hypertrophic scar in rabbit ears.

GPER; Hypertrophic scar; TGF-β1

貴州省科學技術基金(黔科合J字[2012]2237號)

作者單位：563003 貴州 遵義，遵義醫學院(邵 寧,曾 琪)；貴州省人民醫院 燒傷整形科(程代薇,鄭慶桂);貴陽中醫學院 實驗動物中心(錢 寧,吳曙光)

邵 寧(1985-)，男，河南人，碩士研究生.

程代薇，550002，貴州省人民醫院 燒傷整形科，電子信箱：dwcheng0851@163.com【摘要】 目的 觀察G蛋白偶聯雌激素受體(GPER)對于兔耳增生性瘢痕的影響。方法 選取36只新西蘭大耳兔建立模型,隨機分為6個組，分別為E2組(17-β-雌二醇)、G1組(雌激素受體激動劑)、E2+G15組(17-β-雌二醇+雌激素受體拮抗劑)、G1+G15組、DMSO組(溶劑)和空白對照組。于兔耳根部皮下持續注射給藥15 d后切取標本，觀察各組瘢痕增生情況。瘢痕增生指數(SEI)、成纖維細胞數量、膠原纖維排列以及通過實時定量PCR檢測TGF-β1、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達情況。 結果 通過大體觀察及顯微鏡檢發現，E2和G1組相比空白對照組的瘢痕增生明顯，成纖維細胞數量明顯增多，膠原排列紊亂；E2和G1組經G15處理后，瘢痕明顯縮??；檢測并分析數據SEI以及TGF-β1、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和GPER的mRNA表達量，E2和G1組相對于空白對照組均明顯升高(P<0.05)，而E2和G1組經G15處理后則顯著降低(P<0.05)；DMSO組相對于空白對照組，其差異無統計學意義(P>0.05)。結論 GPER介導雌激素對于兔耳增生性瘢痕具有促進作用。

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.09.019

R619.6

A

1673-7040(2016)09-0572-05

2016-06-10)