冬蟲夏草菌粉對腎缺血-再灌注損傷大鼠Klotho基因和免疫調節的影響*

李莉 楊敏 何華瓊 張秋芳 吳勝英（湖北醫藥學院機能實驗室，湖北十堰442000）

·證治探討·

冬蟲夏草菌粉對腎缺血-再灌注損傷大鼠Klotho基因和免疫調節的影響*

李莉 楊敏 何華瓊 張秋芳 吳勝英△
（湖北醫藥學院機能實驗室，湖北十堰442000）

目的觀察冬蟲夏草菌粉對大鼠腎缺血-再灌注損傷動物模型Klotho基因和免疫調節的影響，探討其可能的機制。方法30只Wistar大鼠分為假手術組、模型組、實驗組。模型組和實驗組大鼠采用夾閉雙腎動脈45min后復灌方法造模，假手術組不夾閉雙腎動脈作為對照。術后實驗組給予10%冬蟲夏草菌粉按2.0mL/（kg·d）灌胃，假手術組和模型組則給予2.0mL/（kg·d）生理鹽水。灌胃治療7 d后，檢測尿磷（UP）含量、血清總蛋白（STP）、白蛋白（ALB）和腎功能3項［胱抑素C（Cys C）、肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）］，RT-PCR法檢測腎組織Klotho蛋白和Klotho-mRNA表達及腎組織勻漿中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脫氫酶（LDH）含量。結果模型組腎組織勻漿中Klotho蛋白和Klotho-mRNA與假手術組比較下調（均P＜0.05）；模型組大鼠心室內血STP和ALB治療后與假手術組比較差別不大（均P＞0.05）。實驗組Klotho蛋白、Klotho-mRNA、STP和ALB與模型組比較均升高（均P＜0.05）。模型組心室內血清SOD與假手術組比較降低，而MDA升高（均P＜0.05），LDH則差別不大（P＞0.05）。實驗組MDA與模型組比較降低，SOD活性增強（均P＜0.05）。模型組Cys C、Scr、BUN和UP與假手術組比較均升高（均P＜0.05）。實驗組Cys C、Scr、BUN 和UP與模型組比較均降低（均P＜0.05）。結論冬蟲夏草菌粉在抑制腎缺血-再灌注造成的脂質過氧化反應的同時，免疫力得以提升，并通過上調Klotho蛋白和lotho-mRNA達到抗衰老、增加UP排泄來減輕腎功能損害。

腎缺血-再灌注損傷冬蟲夏草菌粉Klotho基因免疫調節腎功能大鼠

【Abstract】Objective：To establish the rat renal ischemia-reperfusion injury animalmodel，to observe the effect of Cordyceps sinensis on the Klotho gene and immune regulation of the anti-ischemia-reperfusion injury and immune regulation mechanism.Methods：30 Wistar rats were random ly divided into sham operation group，the model group and the experimental group.Themodel group and the experimental group weremodelled with reperfusionmethod 45min after clamping bilateral renal，sham operation group without clamping bilateral renal as control.After operation，the experimental group received 10%Cordyceps powder，with gavage of 2.0mL/（kg·d），sham operation group and themodel group with 2.0mL/（kg·d）irrigation saline as control.7 days after gavage administration，urine phosphorus（up）contentwas detected；heart blood sampleswere taken formeasurement of STP，ALB and renal function in three［Cys C，SCRand BUN］.Rats were sacrificed from the right kidney and detected through RT-PCR to detect Klotho protein and Klotho-mRNA expression，then the contentof MDA，SOD and LDH in renal tissue.Results：Compared with the model group，STP，ALB and SOD in the experimental group increased；Klotho protein and Klotho-mRNA significantly up-regulated；Cys C，SCR，BUN and UP decreased，and MDA was significantly inhibited（P＜0.05）.Compared with sham operation group，Klotho protein and Klotho-mRNA significantly down-regulated in the model group（all P＜0.05）；there was little difference between the two groups in STP and ALB after treatment（all P＞0.05）.Compared with themodel group，Klotho protein，KlothomRNA，STP and ALB in the experimental group rose（all P＜0.05）.Compared with the sham operation group，the serum SOD in themodel group was lower，while the MDA was increased（all P＜0.05）.Compared with themodelgroup，MDA activity of the experimental group decreased，and the activity of SOD was enhanced（all P＜0.05）.Cys C，Cr，BUN，UP and Cys in themodel group were higher than that in the sham operation group（all P＜0.05）.Cys C，Cr，BUN，UP and Cys in the experimental group was lower than that of themodel group（all P＜0.05）.Conclusion：Cordyceps sinensis can inhibit lipid peroxidation caused by renal ischemia reperfusion injury；immunity can be improved，and through the regulation of Klotho protein and klotho-mRNA，it can have an effect of anti-aging and ramped-up excretion to reduce renal damage.

【Key words】Renal ischemia-reperfusion injury；Cordyceps sinensis；Klotho gene；Immune regulation；Rat

腎缺血-再灌注損傷（IRI）導致的缺血性急性腎功能衰竭（ARF）病死率極高，存活者多轉變為終末期腎?。?］。IRI包括腎血流再通后再灌注損傷和腎缺血性損傷［2］。IRI腎功能損傷與機體氧化應激密切相系，因此，抗氧自由基或及時清除氧自由基可能改善IRI造成的急性腎功能損傷［3］?，F代醫學證實Klotho基因在腎組織表達上調可改善腎功能并達到抗衰老作用［4］，并且利用滋補性中藥冬蟲夏草進行腎缺血預處理和控制自身免疫反應可減輕腎細胞毒性反應，減輕腎小管上皮細胞損傷，促進腎小管細胞功能恢復而達到調節自身免疫和治療作用［5］。在本研究中，筆者應用冬蟲夏草菌粉對IRI進行干預和治療，通過比較大鼠腎組織Klotho基因表達及酶學等指標改變來探討冬蟲夏草菌粉對大鼠IRI的保護作用機制?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物雄性Wistar大鼠30只，周齡39～40周，體質量182～193 g。大鼠許可證為SCXK（鄂）2011-0008，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供［SYXK（鄂）2011-0031］。實驗盡量減少實驗動物，減輕動物術中疼痛，創口消毒時盡量減少動物的疼痛和不適等，滿足實驗動物基本福利要求［6］。室內溫度恒定在20～22℃，濕度60%～80%。術后單籠飼養，24 h交替光照，普通飼料喂養，動物自由飲水，每日室內紫外線消毒并及時清理糞便。

1.2藥物與試劑冬蟲夏草菌粉購自杭州華東制藥（批號：20120121），使用前用注射用水配制成10%混懸液；戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司，德國進口分裝，批號：061222）；丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠可溶性Klotho蛋白檢測試劑盒及RT-PCR檢測試劑盒購自深圳市科潤達生物工程有限公司。

1.3造模與分組30只大鼠采用隨機數字表隨機分為假手術組、模型組和實驗組共3組，各10只。參照文獻［7］造模，術前動物均禁食12 h，不禁水。3%戊巴比妥鈉腹腔注射（1mL/kg）麻醉，動物麻醉后腹部向上仰臥位固定于鼠臺，整個腹部碘伏消毒后用75%酒精脫碘，自劍突下2 cm腹部正中切開長1.5～2.0 cm切口，逐層分離皮膚和大網膜，采用37℃無菌生理鹽水浸泡過的無菌紗布包裹胃、腸等器官防止器官干燥壞死。用玻璃分針順腹主動脈向下找到雙側腎臟動脈并分離干凈腎臟周脂肪及結締組織，用動脈夾夾閉雙腎動脈45min后松開動脈夾復灌的方法造模。一般在夾閉雙腎30min左右后可見腎臟由鮮紅逐漸變紫黑色，說明血液阻斷成功動脈。45min后去掉動脈夾復灌，恢復血流后可見腎臟由紫黑色迅速轉變為鮮紅色。造模后清理無菌紗布，分層關閉腹腔，縫合皮膚并用碘伏消毒。假手術組手術開腹并分離雙腎動，但不夾閉雙腎動脈，45min后關閉腹腔作為對照。肌肉注射慶大霉素預防感染（每日1次，連續3 d）。

1.4給藥方法術后實驗組給予10%冬蟲夏草菌粉2.0 mL/（kg·d）灌胃，假手術組和模型組則給予2.0 mL/（kg·d）生理鹽水。3組大鼠灌胃治療7 d。

1.5標本采集與檢測1）治療7 d后再次麻醉動物，收集1 mL尿液檢測尿磷（UP）含量，然后心臟采血1 mL置于0℃冰箱備用，檢測時取1mL樣品血于離心管（4500 r/min）離心5min，然后取上血清于檢驗科測定血清總蛋白（STP）、白蛋白（ALB）、肌酐（Scr）、胱抑素（Cys C）和尿素氮（BUN）等指標。2）采血完成后處死動物取腎，置于0℃冰箱備用，檢測SOD、MDA和LDH含量時，取少量腎組織樣本，研磨勻漿，嚴格按說明檢測腎組織勻漿中SOD、MDA和LDH含量。3）參考文獻［8］采用RT-PCR法檢測Klotho基因，取動物腎組織樣本用Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，PCR擴增目的基因Klotho片段，上游引物5′-GTTTCT GCTGCCTTGTAT-3′；下游引物5′-ACTATGTCGCTTT CTTGG-3′。93℃預變性5min，61℃退火1min，71℃延伸50 s，35個循環，72℃延伸10min。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統拍照分析條帶灰度值以確定Klotho-mRNA表達量。

1.6統計學處理應用SPSS17.0統計軟件處理。計數資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠Klotho基因、STP和ALB水平比較見表1。結果示，模型組腎組織勻漿中Klotho蛋白和Klotho-mRNA與假手術組比較下調（均P＜0.05），血STP和ALB治療后與假手術組比較差別不大（均P＞0.05）。實驗組Klotho蛋白、Klotho-mRNA、STP和ALB與模型組比較均升高（均P＜0.05）。

表1　各組大鼠K l o t h o基因、STP和ALB水平比較（±s）

表1　各組大鼠K l o t h o基因、STP和ALB水平比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別n實驗組10假手術組10模型組10 Klotho蛋白灰度值Klotho-mRNA灰度值STP（g/L）ALB（g/L）152.17±17.14△109.26±14.35△57.25±7.68△29.17±4.61△101.57±14.73 73.01±11.22 47.25±7.02 23.42±3.27 72.57±9.25*51.85±7.34*46.35±6.76 22.39±4.81

2.2各組大鼠腎組織勻漿中MDA、LDH和SOD水平比較見表2。結果示，模型組心室內血清SOD與假手術組比較降低，而MDA升高（均P＜0.05），LDH則差別不大（P＞0.05）。實驗組MDA與模型組比較降低，SOD活性增強（均P＜0.05）。

表2　各組大鼠腎組織勻漿中MDA、LDH和SOD比較（±s）

表2　各組大鼠腎組織勻漿中MDA、LDH和SOD比較（±s）

組別n SOD（U/L）實驗組10 130.52±20.57△假手術組10 127.21±15.46模型組10 80.55±13.37*MDA（nmoL/mL）LDH（U/L）3.03±0.17△375.71±67.29 2.51±0.33 372.07±59.35 7.01±0.52*379.75±71.04

2.3各組大鼠Cys C、Scr、BUN和UP水平比較見表3。結果示，模型組Cys C、Scr、BUN和UP與假手術組比較均升高（均P＜0.05）。實驗組Cys C、Scr、BUN和UP與模型組比較均降低（均P＜0.05）。

表3　各組大鼠腎功能Cy s C、Sc r、BUN和UP比較（±s）

表3　各組大鼠腎功能Cy s C、Sc r、BUN和UP比較（±s）

組別n實驗組10假手術組10模型組10 CysC（mg/L）Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）UP（mg/L）17.25±9.17△90.03±12.11△30.57±5.86△12.21±4.09△15.51±3.56 52.57±7.31 27.27±5.41 12.01±4.43 42.72±9.51*143.71±15.50*39.53±6.32*20.25±7.09*

3　討論

冬蟲夏草是由蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲感染麥角菌科真菌后形成復合體［8］。蟲草含有多種氨基酸、多糖、核苷及甾醇類等化學成份，其中蟲草多糖具有護腎、抗炎及增強免疫力等作用，《本草從新》記載蟲草“保肺益腎、止血化痰”之功效，是我國重要的滋補性中藥［9］。在治療手術創傷、藥物腎毒等急慢性腎功能損害性疾病時，冬蟲夏草主要通過改善腎小管濾過和重吸收等代謝機制，增加Cys C、Scr、BUN和UP的排泄率，減少尿蛋白和腎臟病理改變而發揮改善腎功能的作用［10］，同時冬蟲夏草還具有明顯的抗衰老及提高免疫力作用，在多病因造成的急慢性腎功能損害被作為免疫調節劑而廣泛應用并取得了可靠療效［10］。

本實驗研究中所用冬蟲夏草菌粉的藥理成分與中藥冬蟲夏草一致，在用其灌胃治療7 d后，實驗組Klotho蛋白和Klotho-mRNA上調，UP則降低。腎臟保護性因子Klotho基因主要在大腦脈絡膜和腎臟腎小管上皮細胞上表達。Klotho基因是Kuro等在1997年在小鼠模型中被發現，是一種新型抗衰老基因-Klotho，Klotho具有抗氧化、調節鈣磷代謝和抗凋亡等多種作用［11］，Klotho基因表達上調能夠延緩人類衰老，在調整機體磷代謝中也起到重要作用，Klotho主要在腎組織尤其在腎小管上皮細胞上表達，故其表達下調是腎損傷的標志，Klotho高表達可減緩腎臟損傷促進損傷腎小管內皮修復，其基因上調可調整機體磷代謝、保護腎功能而延緩人類衰老［4］。冬蟲夏草上調Klotho基因的機制不太明確，冬蟲夏草菌粉吸收后有可能參與拮抗膜外的磷對細胞的毒性作用，抑制腎小管上皮細胞凋亡，增加UP的排泄而減緩腎缺血-再灌注損傷。實驗組Cys C、Scr、BUN和腎組織勻漿中MDA降低，提示冬蟲夏草菌粉能明顯降低腎缺血-再灌注損傷動物模型大鼠腎功能的作用；同時SOD升高，提示冬蟲夏草菌粉減少腎缺血-再灌注MDA和氧自由基的產生，抑制腎缺血-再灌注后脂質過氧化反應而達到保護腎功能的目的。冬蟲夏草菌粉保護腎缺血-再灌注腎臟機制可能與其增加腎小管對Cys C、Scr和BUN的排泄率，改善腎小管濾過和重吸收，促進腎缺血-再灌注后脂質過氧化反應受到損傷的腎小管細胞修復，抑制醛糖還原酶和腎小球代償性肥大，降低腎小管和集合管對Na+、K+重吸收而減輕腎組織水腫有關［12-13］。冬蟲夏草中的腺苷可提高SOD活性，在清除自由基和降低脂質過氧化產物MDA方面已有大量實驗報道，在改善腎缺血-再灌注腎血流和腎功能等起著重要作用［14］。實驗組大鼠STP、ALB亦升高，研究證實冬蟲夏草菌粉對免疫系統具有雙向調節作用，一方面可降低細胞免疫（降低T淋巴細胞吞噬功能），另一方面提高體液免疫（STP、ALB）而達到提高免疫力，這與宋艷麗、劉江等報道冬蟲夏草菌粉具有增強免疫功能和抗氧化保護腎功能作用一致［14-15］。

綜上所述冬蟲夏草可通過“補虛損、益精氣、實腠理”［16］，并上調Klotho基因和增加UP排泄，提高SOD活性來抑制腎缺血-再灌注后氧自由基生成、提高免疫力、減輕腎功能損害而達到腎缺血-再灌注損傷的保護作用。

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Effect of Cordyceps Sinensis on Rat K lotho Gene and Immune Regulation of Renal Ischem ia-reperfusion

Injury

LILi，YANGMin，HEHuaqiong，etal.Hubei University ofMedicine，Hubei，Shiyan 442000，China.

·研究報告·

R285.5文獻標志碼：A

1004-745X（2016）07-1290-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.008

湖北省教育廳重點項目（D20122402）
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（電子郵箱：csxchensaoxuo@163.com）

2016-03-25）