電針對MCAO大鼠學習記憶功能及海馬CA1區IL-6、COX-2表達的影響*

彭洪衛俞坤強李曉潔宋長明李瓏林如輝柳維林陶靜，3，4陳立典，3，4△（1.福建中醫藥大學康復醫學院，福建福州350122；2.福建省康復技術重點實驗室，福建福州350122；3.國家中醫藥管理局中醫康復研究中心，福建福州350122；4.福建省康復產業研究院技術創新平臺，福建福州350122）

·薪火傳承·

電針對MCAO大鼠學習記憶功能及海馬CA1區IL-6、COX-2表達的影響*

彭洪衛1，2俞坤強1，2李曉潔1，2宋長明1，2李瓏1，2林如輝1，2柳維林1，2陶靜1，2，3，4陳立典1，2，3，4△
（1.福建中醫藥大學康復醫學院，福建福州350122；2.福建省康復技術重點實驗室，福建福州350122；3.國家中醫藥管理局中醫康復研究中心，福建福州350122；4.福建省康復產業研究院技術創新平臺，福建福州350122）

目的觀察電針對局灶性大腦中動脈閉塞模型（MCAO）大鼠學習記憶功能及海馬CA1區白細胞介素-6（IL-6）、環氧化酶-2（COX-2）表達的影響，并探討其可能的作用機制。方法將60只健康雄性SD大鼠隨機分為假手術組（15只）和手術組（45只），手術組參照Longa線拴法制備MCAO大鼠模型，假手術組只分離相應血管，不予結扎和插入線栓。將造模后符合納入標準的39只手術組大鼠隨機分為模型組、電針組及非穴組，各13只。電針組取“百會”和“神庭”穴，非穴組取雙脅下非經非穴，共電針干預7 d；假手術組和模型組在同等條件下飼養和抓取。通過神經功能評分判斷大鼠的神經功能缺損情況；Morris水迷宮試驗評估學習記憶能力；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色檢測腦梗死體積；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察海馬CA1區神經元形態變化；免疫組化技術檢測海馬CA1區IL-6、COX-2的表達。結果與模型組和非穴組相比，電針組大鼠神經功能缺損評分下降，逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.01），穿越平臺次數增加（P＜0.05），腦梗死體積明顯減?。≒＜0.01），海馬CA1區神經元損傷減輕，IL-6、COX-2的表達下降（P＜0.05）。結論電針能夠改善MCAO大鼠的學習記憶功能，其機制可能與下調炎癥介質IL-6、COX-2在海馬CA1區的表達有關。

電針腦缺血學習記憶IL-6 COX-2

【Abstract】Objective：To observe the roles of electro-acupunture on learning and memory function and the expression of IL-6 and COX-2 in hippocampal CA1 region of ratswith focal cerebral ischemia/reperfusion and inquire into its possiblemechanism.M ethods：60 healthymale Sprgue-Dawley ratswere random ly divided into the sham operation control group（n=15）and the operation group（n=45）.The focal cerebral ischemia/reperfusion model was established by suturemethod in the operation group.However，the sham operation control group only separated the corresponding blood vesselswithout ligating and inserting the suture.An amountof 39 qualified operation group ratswere randomly divided into the ischemiamodel group（n=13），the electro-acupuncture group（n =13）and the non-acupoint group（n=13）aftermodel establishment.For rats of the electro-acupuncture group，electro-acupuncture treatment at Baihui（DU20）and Shenting（DU24）was given for 7 days，and for rats of the non-acupointgroup，electro-acupuncture stimulation was applied to bilateral costal region for 7 days.Neurological deficit scoreswas assessed；the ability of learning and memory was determined by Morriswatermaze test；the volume of the cerebral infarction were estimated by TTC staining；the morphological changes of neurons in hippocampal CA1 region was observed by HE staining；the expression of IL-6 and COX-2 in hippocampal CA1 area was detected with immunohistochemistry technique.Results：Compared with the ischemia model group and thenon-acupoint group，the neurological deficit score decreased（P＜0.05）；the escape latency significantly decreased （P＜0.01）；the times of passing through the platform increased（P＜0.05）；the cerebral infarction volume profoundly reduced（P＜0.01）；the pathomorphology change of hippocampal CA1 neuron alleviated，and the expression of IL-6 and COX-2 in hippocampal CA1 region decreased（P＜0.05）in the electro-acupuncture group.Conclusion：The learning and memory ability ofMCAO rats can be ameliorated by electro-acupuncture，themechanism may be related to the down-regulation of the expression of IL-6 and COX-2 in hippocampal CA1 region.

【Key words】Electro-acupuncture；Cerebral ischemia；Learning andmemory；IL-6；COX-2

炎癥反應是腦缺血后常見的一種病理反應，可導致海馬及其周圍神經細胞的死亡或凋亡，抑制海馬區

神經元的再生，導致學習記憶障礙［1-2］，而白細胞介素-6（IL-6）、環氧化酶-2（COX-2）是參與腦缺血后炎癥反

應的重要炎癥介質，在炎癥反應的過程中發揮重要作

用。缺血性腦卒中后高達65%的患者伴發認知障礙，

常表現為學習記憶功能受損［3］。前期臨床和基礎研究

表明電針可以有效改善缺血性腦卒中后學習記憶障礙［4-6］。故本研究通過觀察電針對MCAO大鼠學習記憶

功能及海馬CA1區炎癥介質IL-6、COX-2表達的影響，探討電針改善缺血性腦卒中后學習記憶功能的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物60只成年健康雄性Sprgue-Dawley大鼠（動物批號：2007000638342），體質量（250±30）g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供［生產許可證號碼：SCXK（滬）2012-002］，由福建中醫藥大學實驗動物中心飼養（動物使用許可證號：2014-001）。實驗前于SPF環境中適應性飼養1周，均遵照國際動物保護和使用指南的規定實施。

1.2試劑與儀器2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）：sigma；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物技術研究所）；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）；IL-6一抗、COX-2一抗（Santa Cruz Biotechnology）；Morris水迷宮（中國醫學科學院藥物研究所）；華佗牌電針治療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；Leica DM4000B LED正置研究級顯微鏡；Motic Med 6.0圖像分析系統。

1.3分組與造模將60只SD大鼠按隨機數字表法隨機分為假手術組（n=15）和手術組（n=45），所有大鼠于術前禁食12 h，根據體質量予10%水合氯醛3mL/kg進行麻醉。麻醉后，手術組大鼠參照Longa等［7］報道的方法建立局灶性缺血再灌注大鼠模型：常規去毛消毒，于正中切開頸部皮膚，鈍性分離左側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈并充分暴露，而后于近心端結扎頸總動脈，于頸外、頸內動脈分叉處結扎頸外動脈，于頸內動脈遠心端用血管夾夾閉頸內動脈，在頸總動脈結扎處遠端約3 mm處剪一小口，經切口導入備好的線栓，撤去頸外動脈血管夾，經頸外動脈緩慢推入線栓至大腦前動脈近端，推入長度為距頸外、頸內動脈分叉處約18～22mm，而后將頸內動脈結扎，常規縫合切口。線栓插入2 h［8］后將其緩慢回抽栓線至頸總動脈分叉處，從而形成缺血再灌注模型。假手術組只分離動脈，不予結扎和插入線栓。術中注意保暖，使動物肛溫維持在（37±1）℃，保持室溫在25℃左右，直至大鼠重新恢復活動。

大鼠蘇醒后，根據Longa［7］評分法對其進行神經功能缺損評分，用以判斷模型成功與否。無神經功能缺失癥狀者評為0分；提尾倒懸時右側（偏癱側）前爪伸展不完全者評為1分；爬行時朝向右側轉圈者評為2分；爬行時向右側傾倒者評為3分；不能爬行，意識喪失者評為4分。1～3分的大鼠為符合標準的大鼠，將其納入，同時將0分、4分及死亡的大鼠剔除。最終各組大鼠納入情況為假手術組15只，模型組、電針組、非穴組各13只。

1.4干預措施電針組大鼠參考《實驗針灸學》［9］取“百會”“神庭”穴進行電針刺激。采用G6805電針儀，疏密波，電壓峰值6 V，頻率1/20 Hz，以大鼠安靜耐受、穴位周邊組織輕輕抖動為度，每次電針20 min，每日1次，手術后第1日開始干預，連續7 d。非穴組大鼠取其雙脅下非經非穴［10］（低于肋部，高于髂嵴10 mm 和15mm）進行電針刺激，刺激條件同電針組。假手術和模型組大鼠手術后回籠飼養，不予任何治療。

1.5標本采集與檢測

1.5.1神經功能缺損評分［7］在手術后的1、3、5、7 d，對模型組、電針組和非穴組大鼠進行評分。

1.5.2Morris水迷宮測試各組大鼠于手術后第3日開始進行為期5 d的水迷宮檢測。測試分兩部分進行，首先是定位航行試驗，而后進行空間探索試驗。1）定位航行試驗：試驗前讓大鼠適應性自由游泳2min，而后將大鼠按順時針方向依次由第1象限至第4象限放入水中，放入時使大鼠面朝池壁，記錄大鼠在90 s內找到平臺所需時間，即為其逃避潛伏期。若大鼠在設定時間內未找到平臺，則需將大鼠引導至平臺上并停留10 s，記錄其逃避潛伏期為90 s。試驗于手術后的第3～6日進行，歷時4 d。2）空間探索試驗：試驗時將逃逸平臺撤除，將大鼠從任一象限的相同入水點面朝池壁放入水中，記錄其在90 s內穿越原平臺所在位置的次數。試驗于手術后的第7天進行，歷時1 d。

1.5.3TTC染色檢測腦梗死體積大鼠麻醉后經左心室灌注生理鹽水，隨后迅速斷頭取腦，將腦組織放入-20℃冰箱中冷凍，20min后取出，從大腦半球額極至枕極連續作6個厚約2mm的腦冠狀切片，將切片放入1%TTC（pH=7.4）溶液中，于37℃恒溫箱中避光染色30min。染色結束后，腦片梗死區域呈白色，未梗死區域呈紅色，使用高分變率數碼相機進行對染色切片進行拍照。使用Motic Med 6.0圖像分析軟件對每個腦片的梗死區面積及整個腦片的面積進行計算，最后得出腦梗死體積占全腦體積的百分比=（S1×H）/（S×H），S1為所有腦片梗死區面積之和，S為所有腦片整個腦區面積之和，H為切片厚度。

1.5.4HE染色觀察海馬CA1區神經元細胞形態大鼠經麻醉后開胸，300 mL生理鹽水經其左心室快速灌入進行沖洗，4%多聚甲醛400mL進行灌流固定。固定完成后快速將腦取出，浸入4%多聚甲醛中于4℃冰箱內繼續固定24～48 h。常規脫水，石蠟包埋，切片機切取厚度5μm的切片，防脫載玻片撈片。將切片置于二甲苯中脫蠟、梯度酒精中水化、蘇木素和伊紅染液中染色，最后采用Leica DM4000B LED正置研究級顯微鏡（400倍）對海馬CA1區細胞形態進行觀察及拍攝。

1.5.5免疫組化檢測CA1區IL-6、COX-2表達取材至水化過程同HE染色法中所述步驟，而后采用微波法進行抗原修復，修復液為檸檬酸緩沖液（pH=5.9～6.1）?？乖迯屯瓿珊?，順序滴加內源性過氧化物酶阻斷劑、兔血清封閉液、一抗（IL-6：1∶50稀釋；COX-2：1∶100稀釋），一抗滴加后于濕盒中4℃過夜，第2天室溫（18～30℃）中復溫30min后滴加二抗（生物素標記的兔抗羊聚合物）及滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶，最后滴加DAB顯色液顯色。免疫組化具體操作步驟按試劑盒說明書進行，IL-6、COX-2免疫組化陽性標準為光學顯微鏡下細胞胞漿呈棕黃色。切片采用Leica DM4000B LED正置研究級顯微鏡（400倍）進行拍攝，拍攝時對每組大鼠海馬CA1區互不重疊的6個視野進行采像，每組8個樣本。使用Motic Med 6.0系統軟件中的免疫組化分析模塊對圖像進行分析，得出海馬CA1區積分光密度及面積，結果以海馬CA1區平均OD值表示，平均OD值=（IOD總/S總），IOD總為6個視野下海馬CA1區的積分光密度之和，S總為6個視野下海馬CA1區的面積之和。

1.6統計學處理應用SPSS18.0統計軟件分析。數據不符合正態分布采用秩和檢驗；符合正態分布采用單因素方差分析（ANOVA）。單因素方差分析時，對于方差齊者采用LSD法，方差不齊者使用Games-Howell法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1電針對MCAO大鼠神經行為學的影響見表1。假手術組大鼠未表現出神經功能缺損癥狀；模型組與非穴組相比無明顯差異（P＞0.05）；而電針組在4個時間點的神經功能缺損評分均低于模型組和非穴組（P＜0.05），說明電針能夠改善MCAO大鼠的神經功能缺損癥狀。

表1　各組大鼠神經功能缺損程度評分比較（分，±sE）

表1　各組大鼠神經功能缺損程度評分比較（分，±sE）

與模型組比較，*P＜0.05；與電針組比較，△P＜0.05。下同。

組別n非穴組13假手術組15模型組13電針組13 第1日第3日第5日第7日1.67±0.26 1.50±0.20 1.42±0.19△1.33±0.19△0 0 0 0 1.78±0.28 1.67±0.24 1.56±0.24 1.44±0.29 1.30±0.15 1.20±0.13 1.00±0.00*0.60±0.16*

2.2電針對MCAO大鼠學習記憶功能的影響見表2。在逃避潛伏期測試中，模型組逃避潛伏期在每個時間點均明顯高于假手術組（P＜0.01），但與非穴組之間無顯著性差異（P＞0.05），而電針組與模型組及非穴組相比逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.01）。在空間探索實驗中，模型組較假手術組穿越平臺次數減少（P＜0.05），較非穴組無顯著性差異（P＞0.05），電針組較模型組（P＜0.05）和非穴組（P＜0.01）穿越平臺的次數增加。兩種測試的結果表明電針能夠改善MCAO大鼠的學習記憶功能。

表2　各組大鼠逃避潛伏期比較及穿越平臺次數比較（s，±sE）

表2　各組大鼠逃避潛伏期比較及穿越平臺次數比較（s，±sE）

與假手術組比較，▲P《0.05。下同。

組別n非穴組13模型組13電針組13大鼠逃避潛伏期74.96±6.31 68.72±7.17△63.37±8.80△78.57±4.82 74.08±4.93▲64.17±9.28▲51.58±4.91 23.30±5.05*17.70±2.42*穿越平臺次數61.55±9.67△1.00±0.38△61.88±9.76▲1.63±0.50▲14.75±2.16*4.25±0.56*第3日第4日第5日第6日假手術組15 39.80±4.44 21.24±3.86 11.90±2.71 9.25±1.74 5.75±1.13

2.3電針對MCAO大鼠腦梗死體積的影響見表3。假手術組未觀察到腦梗死；模型組與非穴組相比腦梗死體積無顯著性差異（P＞0.05）；而與模型組和非穴組相比，電針組腦梗死體積顯著減?。≒＜0.01），說明電針能夠減少MCAO大鼠的腦梗死體積。

表3　各組大鼠腦梗死體積比較（%，±sE）

表3　各組大鼠腦梗死體積比較（%，±sE）

組別n梗死體積百分比假手術組7 0模型組5 32.61±0.60電針組5 17.70±0.91*非穴組5 30.75±0.88△

2.4電針對MCAO大鼠海馬CA1區神經元細胞形態的影響見圖1。假手術組海馬CA1區神經元細胞結構完整，無病理改變；模型組和非穴組海馬CA1區神經元細胞排列紊亂，損傷嚴重，多見核固縮及空泡樣變；相對于模型和非穴組，電針組神經元排列致密，損傷較輕，結構較完整。

圖1　各組大鼠海馬CA 1區神經元細胞形態（HE染色，4 0 0倍）

2.5電針對MCAO大鼠海馬CA1區IL-6、COX-2表達的影響見表4，圖2～3。假手術組海馬CA1區IL-6、COX-2表達較弱；模型組較假手術組IL-6、COX-2表達增高（P＜0.05）；與模型組比較，非穴組IL-6、COX-2表達無顯著性差異（P＞0.05）；而與模型組和非穴組大鼠相比較，電針組IL-6、COX-2表達降低（P＜0.05），說明電針能夠減少MCAO大鼠海馬CA1區IL-6、COX-2的表達。

表4　各組大鼠海馬CA 1區I L-6及COX-2表達比較（%，±sE）

表4　各組大鼠海馬CA 1區I L-6及COX-2表達比較（%，±sE）

組別n假手術組8模型組8電針組8非穴組8 IL-6 COX-2 0.027±0.004 0.012±0.002 0.093±0.026▲0.051±0.009▲0.034±0.004*0.022±0.002*0.074±0.011△0.041±0.003△

3　討論

作為缺血性腦卒中后常見的一種功能障礙，認知障礙嚴重制約患者運動和感覺功能等的康復，對患者的日常生活能力及生活質量產生直接影響［11-12］。同時，認知障礙常干擾患者感知和適應外部的環境，易使患者產生抑郁、焦慮等情感障礙，研究表明，腦卒中患者中約1/3會明確發展為癡呆［13］。

圖2　各組大鼠海馬CA 1區I L-6表達（免疫組化染色，4 0 0倍）

圖3　各組大鼠海馬CA 1區COX-2表達（免疫組化染色，4 0 0倍）

前期臨床和基礎研究表明電針百會、神庭穴可以有效改善缺血性腦卒中后學習記憶障礙［4-6］。百會是三陽五會的穴位、足太陽之會，神庭為督脈、足太陽、陽明之會。百會和神庭穴皆為督脈上的要穴，自古以來就有用于治療認知相關疾病的記錄?！夺樉拇蟪伞分兄赋?，百會主治“驚悸健忘，忘前失后”，神庭主治“登高而歌，棄衣而走”。兩穴共用，能起到形神共調的作用。

海馬系統在學習記憶過程中發揮著至關重要的作用［14］，炎性反應可引起海馬及其周圍神經細胞的死亡或凋亡，抑制海馬區神經元再生，損害學習記憶［1-2］。IL-6和COX-2為參與腦缺血后炎癥反應過程中的兩種重要的炎癥介質。IL-6主要來源于小膠質細胞，可由轉化生長因子-β（TGF-β）、白細胞介素-1（IL-1）等多種因子誘導產生。在腦缺血時，IL-6作為一種炎癥因子參與炎癥反應，致使腦損傷加重［15］。研究發現，在輕度認知功能障礙患者血清中IL-6、1L-12等炎癥因子含量顯著升高［16］。COX-2是花生四烯酸代謝的關鍵酶，作為一種炎癥介質，COX-2及其催化產物促進了炎癥反應的進展［17］。腦缺血可導致COX-2的表達和活性增加，酶的反應產物能夠引發缺血性腦損傷的演變［18］。同時COX-2的表達增強可引起興奮性谷氨酸增多，導致神經元損傷［19］。在本研究中，模型組大鼠海馬CA1區IL-6和COX-2較假手術組大鼠表達增高，而電針組較模型組和非穴組大鼠海馬CA1區IL-6和COX-2表達降低，模型組與非穴組之間IL-6和COX-2表達無顯著性差異。由此表明電針大鼠“百會”“神庭”穴在一定程度上能夠下調MCAO大鼠海馬CA1區IL-6和COX-2表達，這可能是電針改善腦MCAO大鼠學習記憶功能的機制之一。

綜上所述，電針可改善MCAO大鼠的學習記憶功能，其機制可能與下調大鼠海馬CA1區IL-6和COX-2表達有關。然而，由于腦缺血后認知障礙機制的復雜性及電針作用的多靶點性，本實驗的結果并不能完全闡釋電針改善MCAO大鼠的學習記憶功能的具體機制，尚需深入探討。

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Effects of Electro-acupuncture Intervention on Learning and Memory Function and the Expression of IL-6 and COX-2 of Hippocam pal CA1 Region in Rats with Focal Cerebral Ischem ia/Reperfusion

PENG Hongwei，YU Kunqiang，LI Xiaojie，et al.College of Rehabilitation Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fujian，Fuzhou 350122，China.

R245.9+7文獻標志碼：A

1004-745X（2016）07-1293-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.009

福建省自然科學基金項目（2015J01335）；福建省康復技術協同創新中心資助項目（X2012004-協同）
△

（電子郵箱：cld@fjtcm.edu.cn））

2016-03-26）