電針足三里穴對大鼠小腸缺血再灌注損傷后腸黏膜屏障修復的影響*

耿艷霞 陳棟 魯俊 陳明祺 張海東 周江（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京210029）

·臨床觀察·

電針足三里穴對大鼠小腸缺血再灌注損傷后腸黏膜屏障修復的影響*

耿艷霞 陳棟 魯俊 陳明祺 張海東 周江△
（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京210029）

目的研究電針足三里穴對大鼠小腸缺血再灌注（I/R）損傷后腸黏膜屏障的保護作用。方法將24只大鼠隨機分為4組，即正常組、模型組、假電針組、電針組，每組各6只。于缺血30min再灌注2 h時，分別取大鼠門靜脈血和遠端回腸標本，檢測回腸組織病理學評分（Chiu′s），ELISA法檢測血清中白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）濃度，Western blot法檢測腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1濃度。從回腸灌注FITC-Dextran-4溶液30min后，測算其在血清中的濃度，觀察腸黏膜通透性的改變。結果與對照組比，I/R組和假電針組大鼠病理學Chiu′s評分和血清TNF-α、IL-6、FD4水平明顯升高，ZO-1表達明顯減少（P《0.05）；與I/R組和假電針組比，電針足三里可降低腸黏膜損傷評分，抑制血清TNF-α、IL-6和FD4水平（P《 0.05），促進ZO-1修復。結論電針足三里對大鼠小腸I/R損傷腸黏膜屏障具有保護作用。

電針缺血-再灌注損傷足三里穴腸屏障功能

【Abstract】Objective：To investigate the protection effectof electroacupuncture（EA）at Zusanli（ST36）on rat intestinal ischemia/reperfusion（I/R）injury.M ethods：Twenty-fourmale SD ratswere random ly divided into the control group（shame group），I/R group（themodel group），sham EA group（I/R+sham EA），and EA group（I/R+ EA），with 6 rats in each.Intestinal I/R ratmodel was based on superiormesenteric artery occlusion for 30 min and releasing for 2h，and distal ileum tissue and portal blood sampleswere taken for further detection.The pathological changes of ileum tissue were viewed and graded by Chiu′s score.Serum levels of IL-6 and TNF-αwere detected with ELISA method.Intestinalmucosal concentrations of tight junction protein ZO-1 were investigated with western blot assay.A solution of FITC-Dextran-4 solution was injected into a segment of terminal ileum for 30 min，and then the serum level of FD4 wasmeasured to assess the intestinal permeability.Results：Compared to the control group，Chiu′s score and serum TNF-α，IL-6，FD4 levels in I/R and sham EA group significantly increased，while ZO-1 expression significantly decreased.Compared with the I/R and shame EA group，EA at Zusanli（ST36）significantly promoted ZO-1 repair，and attenuated the pathological damage and serum levels of TNF-α，IL-6 and FD4.Conclusion：EA at Zusanli（ST36）can protect the intestinalmucosal barrier from I/R injury.

【Key words】Electroacupuncture；Ischemia/reperfusion injury；Zusanli（ST36）；Intestinal barrier function

腸道的缺血再灌注損傷常見于多種臨床疾病，如嚴重創傷、燒傷、膿毒癥、腸梗阻、腸移植、腸系膜動脈栓塞、失血性休克、腹主動脈手術等，是引起腸黏膜屏障功能受損的主要因素之一。腸上皮細胞結構和功能的破壞，將引起腸屏障功能障礙，腸黏膜通透性升高，細菌和內毒素易位，誘發全身炎癥反應綜合征（SIRS）甚至多臟器功能障礙綜合征（MODS），是臨床上經常遇到的難題。因此，探索促進缺血再灌注后腸屏障損傷修復的有效措施，具有重要的臨床意義。目前，探索治療腸道缺血再灌注損傷策略的研究眾多，如缺血預處理、抗氧化、補充NO及谷氨酰胺等，大多尚停留在動物模型層面，且療效不確切。針灸療法臨床應用十分廣泛，特別是針刺足三里穴在腸道缺血性疾病的臨床應用亦日益普遍，并取得了獨特的療效優勢。電針療法是針灸療法的一個分支，較單純針灸有治療效果好、范圍廣、易控制刺激量及可做持續運針等多種優點。既往研究驗表明，電針足三里穴可增加缺血再灌注腸黏膜血流量和二胺氧化酶（DAO）活性，減輕腸組織水腫，抑制促炎因子水平［1-2］，然而對腸黏膜屏障特別是緊密連接蛋白表達的影響卻未見報道。本實驗旨在探討電針足三里穴對小腸缺血再灌注損傷后炎癥反應和黏膜屏障的保護作用，為臨床胃腸功能障礙的電針治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級SD大鼠24只，雄性，體質量180～220 g，購自南京中醫藥大學附屬醫院動物實驗中心。

1.2試劑白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）的ELISA試劑盒購自R＆D公司；異硫氰酸熒光素-葡聚糖（FD4，MW 4400）購自Sigma公司；兔抗大鼠ZO-1抗體購自Santa cruz公司，HRP標記的羊抗兔IgG二抗購自GenScript公司。

1.3分組與造模24只大鼠隨機分為4組，即正常組、缺血再灌注損傷組、假電針組、電針組，每組各6只。小腸缺血再灌注損傷模型制作：將大鼠適應性飼養1～2周，氯胺酮腹腔麻醉后，取劍突下1 cm腹正中切口，游離腸系膜上動脈，以無損傷動脈夾夾閉其起始部，建立腸缺血模型?；丶{腸管，以濕潤的紗布覆蓋腹腔，30 min后松開血管夾，恢復腸系膜上動脈血流，建立再灌注模型。正常對照組同上剖腹、游離，但不夾閉血管。

1.4干預方法電針組缺血后即刻針刺雙側足三里穴（膝關節外后側，腓骨小頭下5 mm），直刺7 mm，針刺后接電針儀，頻率2～100 Hz，強度2～3 mA，時間30 min，以大鼠雙下肢出現輕微顫動為度。假電針組缺血后即刻以相同頻率和強度電針雙側非經非穴（足三里外側旁開0.5 cm）。

1.5標本采集與檢測于再灌注2 h時處死大鼠，取1 cm遠端回腸組織（距回盲部2 cm處）；抽取2mL門靜脈血，冰上靜置，離心，吸出上層血清于-80℃凍存；切除末端回腸10 cm腸段，置于預冷的生理鹽水中縱行剖開，漂洗去除糞便及表面血跡，用載玻片于冰上快速刮取表面黏膜，收集后于-80℃凍存。

1.5.1病理學檢查取回腸組織置于10%甲醛中，室溫下固定，常規HE染色，光鏡下按Chiu's法評價腸黏膜損傷程度：0分為正常絨毛；1分為絨毛頂端上皮下損傷，Gruenhagen間隙增大；2分為上皮下間隙擴張，上皮與固有層呈中度分離；3分為上皮下間隙進一步擴張，上皮層與固有層間呈大量分離，偶有絨毛頂端裸露；4分為絨毛破損裸露，伴固有層毛細血管擴張；5分為固有層破壞、不完整、潰瘍和出血。

1.5.2腸黏膜通透性測定于再灌注1.5 h用2-0絲線結扎10cm末端回腸腸管（距回盲瓣5 cm），向該段腸腔內注入FD4溶液0.5mL（20mg/mL），30min后取門靜脈血1～2mL，冰盒中靜置，離心。取0.2mL上清血漿，用熒光分光光度計測熒光強度（EX=480 nm，EM=520 nm，PMT=400 V）。以不同稀釋濃度的FD4標準品及相應熒光強度制作標準曲線，在標準曲線上換算出各樣品的FD4濃度。

1.5.3Western blot法檢測ZO-1蛋白取0.1 g回腸黏膜組織，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑的混合液，充分研磨，冰上靜置，離心，提取上清蛋白液，測定總蛋白濃度，調整標本濃度至1 g/L左右。蛋白變性后行SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉膜，封閉后一抗（ZO-1，1∶500）4℃孵育過夜，HRP二抗（1∶1000）室溫孵育2 h，加顯色劑后暗室中曝光，沖洗膠片，以β-actin作參照校正，用凝膠圖像分析系統分析目標條帶灰度。

1.5.4ELISA法檢測血清中IL-6和TNF-α的水平

操作按照試劑盒說明書進行，每個反應孔中滴加50μL血清樣本和50μL生物素標記的IL-6或TNF-α抗體，37℃溫育1 h；洗滌后加入60μL的親和鏈霉素-HRP，37℃溫育30min；洗滌后加入底物，37℃溫育10min后加入終止液，使用酶標儀測定各孔OD值（波長450 nm），由標準曲線換算出各樣品的IL-6和TNF-α含量。

1.6統計學處理應用SPSS18.0統計軟件處理。計量資料以（±s）表示，組間計量資料比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠回腸小腸組織病理學改變見圖1，表1。缺血再灌注損傷組及假電針組大鼠腸黏膜損傷明顯，絨毛脫落，固有層破壞，毛細血管暴露，大量中性粒細胞浸潤。電針組腸黏膜損傷較輕，僅有極少量絨毛脫落，中性粒細胞浸潤減少。Chiu′s評分在電針組明顯低于缺血再灌注損傷組及假電針組（P＜0.05）。

圖1　各組大鼠回腸光鏡組織病理學改變（HE染色，1 0 0倍）

2.2各組大鼠回腸腸黏膜通透性測定見表1。I/R組和假電針組大鼠血清的FD4濃度明顯高于正常對照組，電針組的FD4濃度與缺血再灌注損傷組和假電針組相比都有顯著降低（P《0.05）。

表1　各組回腸組織C h i u′s評分和血清F D 4濃度比較?

2.3各組大鼠腸黏膜緊密連接蛋白表達見圖2。與正常組比較，缺血再灌注損傷組和假電針組回腸黏膜組織緊密連接蛋白ZO-1表達明顯減少，電針組ZO-1較缺血再灌注損傷組和假電針組均顯著增加。

圖2　大鼠回腸黏膜ZO-1蛋白

2.4各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較見表2。缺血再灌注損傷組和假電針組血清IL-6和TNF-α濃度明顯高于正常對照組，電針組IL-6和TNF-α濃度與缺血再灌注損傷組和假電針組相比都有顯著降低（P《0.05）。

表2　各組血清IL-6、TNF-α水平比較（p g/mL，±s）

表2　各組血清IL-6、TNF-α水平比較（p g/mL，±s）

組別n IL-6 TNF-α電針組6 84.5±20.8*#△20.3±6.7*#△正常組6 46.3±7.8 15.9±4.3缺血再灌注損傷組6 158.2±37.1*47.5±11.5*假電針組6 151.1±44.9*45.7±22.7*

3　討論

針灸古籍即有“肚腹三里留”之說，足三里穴是治療胃腸疾病的經典穴和首選穴，臨床上應用十分廣泛，其治療效果被眾多醫務工作者及患者所認可。大量的臨床實踐和動物實驗證實，針刺對消化道的運動、分泌及消化吸收機能具有調整作用，可引起胃蛋白酶原、生長抑素、內皮素含量下降，NO及血管活性腸肽增加，在胃腸功能紊亂尤其是功能性胃腸道疾病的治療方面具有良好療效，其主要機制可能與止痛及促進胃腸蠕動有關［3］。而電針調節腸I/R損傷腸屏障結構及功能方面研究較少，僅有宋鐵山及胡森等人在電針抑制凋亡及炎性損傷方面進行過研究［1-2，4］，本實驗中我們針對腸屏障中重要的分子-緊密連接蛋白ZO-1進行了進一步研究。腸上皮細胞緊密連接是細胞間連接的主要方式，其中，ZO-1是一種220KD的膜蛋白，它將跨膜蛋白Occludin和Claudins的胞內端與骨架蛋白actin相連接［5］，在腸黏膜的機械屏障中起到至關重要的作用，在腸黏膜通透性的維持和損傷后修復中都起著重要作用［6］。本研究結果發現，腸黏膜缺血再灌注時，ZO-1表達明顯降低，電針足三里可以明顯促進缺血后ZO-1表達恢復及屏障功能修復。

研究中還發現，電針足三里穴對小腸缺血再灌注后炎性損傷還有顯著抗炎效應，可明顯降低重要炎性介質IL-6和TNF-α水平。眾多關于炎性疾病的實驗已證實，針灸穴位具有抑制促炎因子生成和提高抗炎因子水平的作用。研究表明，電針足三里可以改善盲腸結扎穿孔模型（CLP）大鼠的腸道損傷和高滲透性，提高腸黏膜上皮細胞中sIgA濃度和CD4+/CD8+比率，減少總體死亡率［7］；能改善膿毒癥患者的腸道通透性，盡快恢復腸道功能，早期實現目標喂養［8］。電針的這種抗炎效應主要是通過激活膽堿能抗炎通路、拮抗過度炎性損傷實現的。電針足三里的針刺信息可上傳到中樞，影響中樞迷走核團，興奮迷走神經及膽堿能通路。而腹腔迷走神經切斷將消除電針的保護作用，加重促炎因子表達及器官功能損傷［9-10］。此外，電針足三里穴對大鼠感染性休克［11］、失血性休克［12］、肝缺血再灌注損傷［13］、內毒素所致肝損傷［14］等均具有很好的抗炎效應和器官保護作用，但若預先切斷雙側迷走神經干或注射α7 nAChR拮抗劑，其治療作用則明顯減弱或消失，說明激活膽堿能抗炎通路可能是電針足三里發揮抗炎和臟器保護作用的主要機制之一，并且主要通過N型膽堿能受體α7 nAChR發揮作用［15］。目前認為，α7 nAChR被激活后，主要通過抑制核因子κB（NF-κB）通路和啟動酪氨酸激酶JAK2/信號轉導和轉錄激活子3 （STAT3）通路，從而抑制內毒素、創傷等誘導的促炎細胞因子的產生［16］。最近，Dhawan S等研究還表明，M型膽堿能受體在結腸炎體外實驗中對損傷組織也有保護作用，其機制可能與阻斷肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的轉錄及肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化有關［17］。緊密連接蛋白的破壞/開放是腸道黏膜屏障受損的關鍵，MLCK已被證明是誘導腸上皮緊密連接開放的一個至關重要的蛋白質，通過對肌球蛋白輕鏈（MLC）進行磷酸化，誘導周圍連接的肌動蛋白和肌球蛋白絲收縮，對緊密連接和細胞表面產生張力，從而使上皮細胞間緊密連接開放［18］；而刺激M型G-蛋白耦聯受體后，可能通過激活磷脂酶C（PLC），阻斷MLC磷酸化，促進緊密連接轉移到細胞膜，使得緊密連接保持關閉狀態，從而維護上皮屏障功能。以上電針基于膽堿能抗炎通路治療炎性疾病相關機制的深入探討，都將有助于電針足三里穴治療腸道缺血性疾病機制的闡明。

綜上，本實驗結果表明，電針足三里穴能顯著抑制大鼠小腸缺血再灌注損傷后炎癥反應，改善腸黏膜通透性及緊密連接蛋白表達，促進腸黏膜結構和功能修復。其機制可能與刺激膽堿能通路中N型及M型受體有關，這將是我們今后研究的方向和重點，以期為臨床治療提供理論支持。

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Effects of Electroacupuncture at Zusanli（ST36）on Mucosal Barrier Repair in Rats with Intestinal Is-chem ia Reperfusion Injury

GENG Yanxia，CHEN Dong，LU Jun，et al.Affiliated Hospital of Nanjing Univer-sity of TCM，Nanjing 210029，China.

·研究報告·

R245.9+7文獻標志碼：A

1004-745X（2016）07-1300-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.011

江蘇省中醫院院級課題（Y14015）；江蘇省中醫藥管理局項目（JD201501）
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（電子郵箱：1967chch@163.com）

2016-04-15）