加味生脈補心丹對冠心病氣虛血瘀證大鼠動脈粥樣硬化的影響*

潘繼興鄧文祥曾光△陳青揚吳華英李亮劉平安何軍峰黃惠勇，3△（1．湖南省長沙市中醫醫院，長沙市第八醫院，湖南長沙410100；.湖南中醫藥大學，湖南長沙41008；3.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南長沙410007）

·證治探討·

加味生脈補心丹對冠心病氣虛血瘀證大鼠動脈粥樣硬化的影響*

潘繼興1，2鄧文祥2曾光2△陳青揚2吳華英2李亮2劉平安2何軍峰2黃惠勇2，3△
（1．湖南省長沙市中醫醫院，長沙市第八醫院，湖南長沙410100；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；3.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南長沙410007）

目的制備模擬人類發病過程的大鼠冠心病模型，初步探討加味生脈補心丹對動脈粥樣硬化的影響及干預機制。方法將30只大鼠分為正常組、模型組、西藥組、中藥高、低劑量組，正常組予普通飼料喂養，其余組高糖高脂飼料喂養5周，第6周造模組采用腹腔3次注射垂體后葉素制備冠心病心肌缺血模型。中藥高、低劑量組予加味補心丹藥液2.25、0.75 g/mL劑量灌胃，西藥組予單硝酸異山梨酯藥液灌胃，連續18周。觀察各組對空腹血糖、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、脂聯素、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C反應蛋白（CRP）、心肌病理切片和主動脈弓切片結果的影響。結果1）與正常組比較，模型組的TG、TC、LDL-C、脂聯素水平降低，HDL-C、IL-6、TNF-α、CRP、FBG升高。2）與模型組比較，中藥組和西藥組的動脈粥樣硬化程度降低，斑塊程度下降；中藥組和西藥組的心肌纖維化程度降低，心肌受損程度下降。中藥組和西藥組的外在表現均優于模型組；中藥組和西藥組TG、TC、LDL-C的值降低，HDL-C的值升高；脂聯素水平升高，IL-6、TNF-α、CRP降低。結論加味生脈補心丹組可以降低冠心病大鼠的血糖、血脂，抗動脈粥樣硬化及抗心肌纖維化，機制可能與改善脂聯素水平和改善炎癥反應有關。

加味生脈補心丹中藥冠心病心肌缺血動脈粥樣硬化

【Abstract】Objective：To prepare coronary heart disease（CHD）in ratsmodel similar to human disease process，and observe the effect of Jiawei shengmaibuxin Decoction on atherosclerosis，and discuss its intervention mechanism.M ethods：After ordinary adaptive feed for 1 w，30 ratswere divided into the normal group（n=6），themodel group（n=6），western medicine group（n=6），high-dose group（n=6），low-dose group（n=6）.The ordinary groupswere normally fed，while the restwere fed with high sugar and high fat feed for 5 w.In 6th week，modules weremade with 10%chloral hydrate with intraperitoneal injection of 0.3 g/kg，supine position fixed in rats after anesthesia on stage，connecting physiological recorder，recording a standardⅡlead electrocardiogram of rats.later，themodel group received injection of pituitrin 6 U/kg（1 concentration for 2 U/m）with 5 s constant speed；the normal group received normal amount of saline injection，3 times，each time interval of 15 days.According to the following methods，the indicators were observed.After validation of coronary heart disease，myocardial ischemia modelwas established；they continued being fed with high sugar and high fat feed for 18 weeks.The effects of Jiawei Jiawei shengmai buxin Decoction on fasting blood glucose，serum total cholesterol，triglyceride，low density lipoprotein cholesterol（LDL-C），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C），adiponectin，TNF，IL-6，CRPwereobserved，as well as the results ofmyocardial pathologic biopsy and the aortic arch.Results：1）Compared with the normal group，in the model group，TG，TC，LDLC，and adiponectin level reduced，and HDLC，IL-6，TNF-α，CRP and FBG rose.2）Compared with the model group，in traditional Chinese medicine and western medicine groups the extent of atherosclerosis reduce，as well as plaque，myocardial fibrosis degree，myocardial damage.The outward sign of traditional Chinese medicine group and western medicine groups were better than those of the model group；in Traditional Chinesemedicine and western medicine groups，TG，TC，and LDLC value reduced，as well as IL-6，TNF-α，CRP；HDLC value increased，as well as Adiponectin levels.Conclusion：Jiawei shengmai buxin Decoction can reduce the blood sugar，blood fat of coronary heart disease（CHD）in rats，with resistance against atherosclerosis and myocardial fibrosis，whose mechanism may be related to improving the level of adiponectin and the improvementof the inflammatory response.

【Key words】Jiawei shengmai buxin Decoction；Traditional Chinesemedicine（TCM）；Coronary heart disease；Myocardial ischemia；Atherosclerosis

當前，冠心病成為患者致死、致殘的主要因素，尋求有效的防治方法是全球醫療面臨的挑戰性工作［1］。中醫藥治療此病歷史悠久，積累了很多有效的經驗方，中醫藥對其治療和防治具有良好的效果。加味生脈補心丹是湖南中醫藥大學第一附屬醫院應用10余年的經驗方，具有良好的治療效果，臨床研究表明加味生脈補心丹防治冠心病有潛在優勢［2］。本實驗研究觀察此方對冠心病大鼠動脈粥樣硬化的影響，并初步探討其作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物30只SPF級SD雄性大鼠，體質量140～160 g，平均（150±10）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXX（湘）2011-0003。飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF實驗室，室溫（20±3）℃，相對濕度55%～70%，自由飲水，分籠飼養。普通飼料：實驗鼠全價飼料，由湖南中醫藥大學實驗動物中心制作提供（玉米粉53%、豆餅粉24%、麥麩16%、魚粉5%、骨粉1%、食鹽1%，其他營養添加劑均按產品說明添加）。高脂飼料（D12492 Rodent Dietwith 60 kcal%Fat）購于美國Research Diet公司。所有飼料均進行高溫消毒與輻射照射處理。

1.2試劑與藥物總膽固醇（TC）測定試劑盒，甘油三酯（TG）測定試劑盒，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定試劑盒，糖化血清蛋白測定試劑盒，葡萄糖（Glu）測試盒，脂聯素（ADP）測試盒，胰C反應蛋白（CRP）測試盒，均由南京建成公司提供。Rat IL-6 ELISA kit（欣博盛，批號ERC003.96），Rat TNF-αELISA kit（批號ERC102a. 96）。單硝酸異山梨酯（魯南貝特制藥有限公司，批號29150653）10mg，溶于生理鹽水，按10mg/（kg·d）予大鼠灌胃，備用。垂體后葉素注射液pit（6 U/mL，南京新百藥有限公司，批號111204）。加味生脈補心丹，藥物組成：生地黃、人參、茯苓、柏子仁、五味子、天花粉、丹參、枳實、水蛭、檀香、荷葉、炙甘草等，藥物均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，按成年人60 kg體質量劑量加水煎煮2次，合并煎液，分別離心過濾，濃縮至含生藥0.75 g/mL（低劑量組）、2.25 g/mL（高劑量組），分別離心過濾，高壓滅菌后于4℃冰箱保存備用。

1.3模型制備參考文獻［1，3］，普通適應性喂養1周后將30只大鼠分為正常組6只和造模組24只，高糖高脂飼料喂養5周。第6周造模組大鼠用10%水合氯醛0.3 g/kg腹腔注射，麻醉后仰臥位固定于鼠臺上，連接生理記錄儀，記錄大鼠標準Ⅱ導聯心電圖。準備完畢后，模型組注入垂體后葉素6 U/kg（濃度為2 U/mL），5 s恒速注射完畢，正常組注射等量生理鹽水，在造模后30min按照下述方法觀測各項指標。1）體溫：將電子體溫計插入大鼠肛門約2 cm處，直到電子體溫計數值穩定，讀取屏幕數據。2）心電圖指標：記錄造模后30min內標準Ⅱ導聯心電圖，以QRS波群的終點與ST段交接處的J點位移判斷心肌缺血發生與否，并以PR段為基線記錄J點位移，以J點上升或下降I＞0.1mV視為發生心肌缺血心絞痛，同時記錄大鼠心率變化。若大鼠出現以下癥狀為造模成功。1）體征：正常組大鼠唇周、爪子、耳殼、尾巴顏色淡紅，溫度正常，大便成形；模型組大鼠唇周、爪子顏色紫暗，爪溫下降，耳殼、尾巴變白發涼，大便濕爛。2）體溫：造模前，與正常組體溫（36.28±0.52）℃比較，模型組大鼠體溫（36.27±0.62）℃，差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后，正常組（36.32±0.48）℃，模型組（35.24±0.58）℃，兩組體溫差異有統計學意義（P＜0.05）。3）心電圖：與正常組比較，模型組大鼠J點在造模前差異無統計學意義（P＞0.05），在造模后J點位移顯著增加（P＜0.05）。模型組大鼠造模后心率減慢。

1.4分組及給藥造模成功后，將24只造模成功的大鼠隨機分為4組，即模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組，每組6只。各組大鼠予以高糖高脂飼料喂養，普通組予以普通飼料喂養。正常組、模型組予2 mL生理鹽水灌胃，中藥各劑量組予2mL相應劑量灌胃，西藥組予按10 mg/（kg·d）予單硝酸異山梨酯灌胃［3，6-7］，每日灌胃1次，連續18周。

1.5標本采集與檢測第18周末各組大鼠行ECG，記錄心電圖結果。腹主動脈取血：灌胃18周結束后，大鼠隔夜禁食12 h，腹腔取血，離心取血清，放免法檢測血脂、血清脂聯素、甲狀腺素，酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測CRP-s、IL-6、TNF-α；取血漿，全自動血液流變儀檢測全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積；檢測空腹血糖（FBG）。第19周處死各組大鼠，截取心臟，置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋。HE染色后，光鏡觀察。截取主動脈弓，一部分置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋。HE染色后，光鏡觀察，用于主動脈斑塊檢測。觀察各組大鼠體質量、進食量、飲水量、尿量、毛發變化情況、活動及精神狀態、墊料潮濕情況、大便等指標。

1.6統計學處理應用SPSS20.0統計軟件處理。計量資料以（±s）表示，多組間兩兩比較采用單因素方差分析法，方差齊采用LSD檢驗，方差不齊則用，Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1外觀特征注射垂體后葉素后，與正常組相比，模型組大鼠活動明顯減少，心率、呼吸加快、皮膚、嘴唇顏色變白。隨著灌胃時間的累積，中藥組和西藥組的一般狀況逐漸改善。

2.2各組大鼠糖、脂代謝指標比較見表1。1）糖代謝指標：與正常組比較，各組大鼠FBG均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療完成時，與模型組比較，各給藥組FBG均有不同程度的下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。2）脂代謝指標：模型組的TG、TC、LDL-C水平較正常組明顯增高，說明模型組有明顯脂代謝紊亂。與模型組比較，西藥組TC、TG、LDL-C含量明顯降低（P＜0.05），各中藥組的TC、TG、LDL-C含量也較模型組出現不同程度的降低（P＜0.05），說明西藥組和中藥高、低劑量組都能糾正脂代謝紊亂。而各組在HDLC方面比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1　各組大鼠糖、脂代謝指標比較（mmo l/L，±s）

表1　各組大鼠糖、脂代謝指標比較（mmo l/L，±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別n正常組6模型組6西藥組6 TC TG HDL-C 1.47±0.18 0.81±0.31 1.41±0.29 2.91±1.43*3.94±1.69*0.99±0.24 1.78±0.22*△2.01±0.12*△1.36±0.26*△LDL-C FBG 0.31±0.52 12.38±3.76 0.39±0.23*29.87±1.39*0.31±0.11*△13.21±11.22*△中藥高劑量組6 1.47±0.18*△1.55±1.03*△1.25±0.20*△0.34±0.07*△17.85±10.48*△中藥低劑量組6 2.13±0.17*△2.27±0.43*△0.88±0.34*△0.37±0.03*△23.15±5.94*△

2.3各組脂聯素、IL-6、TNF-α、CPR比較見表2。與模型組比較，中藥組和西藥組脂聯素水平升高，IL-6、TNF-α、CRP水平降低（P＜0.05），說明西藥組和中藥高、低劑量組都能升高脂聯素水平，可降低炎癥反應IL-6、TNF-α、CRP水平。

表2　各組大鼠脂聯素、I L-6、TNF-α、CRP水平比較（±s）

表2　各組大鼠脂聯素、I L-6、TNF-α、CRP水平比較（±s）

組別n正常組6模型組6西藥組6脂聯素（mg/mL）IL-6（mg/mL）TNF-α（pg/mL）3.46±0.65 52.51±6.89 14.80±10.81 3.11±0.33*68.86±9.83*31.97±0.53*5.25±0.46*△57.52±9.26*△25.42±4.59*△CRP（mg/mL）0.91±0.57 1.91±0.57*1.57±0.45*△中藥高劑量組6 5.90±0.76*△62.38±8.43*△24.57±4.73*△1.51±0.59*△中藥低劑量組6 3.96±0.36*△65.58±7.33*△29.10±4.23*△1.82±0.42*△

2.4各組主動脈弓病理切片HE染色結果見圖1。模型組出現粥樣硬化斑塊，有脂肪浸潤，有空泡細胞，有血栓形成，正常組、中藥組和西藥高、低劑量組不明顯。

圖1　各組主動脈弓病理切片果（HE染色，4 0 0倍）

2.5各組心肌病理切片HE染色結果見圖2。正常組心肌細胞均勻、纖細，心肌纖維排列整齊，細胞核清晰可見。與正常組比較，模型組的心肌纖維粗大，排列紊亂，甚至有纖維斷裂現象，心肌細胞肥大，細胞核邊緣不清，心肌細胞排列紊亂；西藥組細胞體積有不同程度的縮小，心肌細胞排列規則，斷裂現象少見，細胞核大小均勻；中藥高劑量組細胞體積有不同程度的縮小，心肌細胞排列規則，斷裂現象少見，細胞核大小均勻；中藥低劑量組細胞體積有不同程度的縮小，心肌細胞排列規則，斷裂現象少見，細胞核大小均勻。

圖2　各組心肌組織切片（HE染色，2 0 0倍）

3　討論

大鼠的冠心病模型較困難，但動物來源、飼養條件要求不是很高，李同達等［8］有采用Wistar大鼠高糖高脂喂養加上每月腹腔注射維生素D31次，誘導冠心病大鼠模型。有單次腹腔注射垂體后葉素誘導急性心肌缺血模型，但缺乏穩定性［3，9］。有手術冠狀動脈結扎法致急性心肌梗死模型，但死亡率很高，不便于中藥的干預研究［10］。筆者在多次預實驗的基礎上，發現通過采用高糖高脂膳食喂養5周后，采用腹腔3次注射垂體后葉素，導致多次持續復制冠心病心肌缺血模型，在此基礎上，高糖高脂喂養誘導高脂血癥，終致冠狀動脈粥樣硬化，在冠心病模型基礎上再繼續高糖高脂喂養18周，冠心病大鼠明顯表現有尾巴、嘴唇、耳尖顏色變白，血脂紊亂、心肌損傷、心肌纖維化、聯素水平降低、IL-6、TNF-α、CRP升高，論證冠心病心肌缺血的模型成立。造模成功后，冠心病大鼠有少食、便溏及少動懶動、精神萎靡的表現，符合中醫“氣虛證”的表現［11-12］；大鼠形體肥胖，舌質紫黯，高血糖、高血脂、低脂聯素水平，其舌色、爪色比正常組大鼠要深，呈淡紫色，心肌纖維化，符合中醫“瘀證”的表現［13-15］。從中醫的角度推之，造模成功后，大鼠的病理因素有痰和瘀，證明冠心病心肌缺血模型氣虛痰瘀證成立。造模成功后，予以經驗方加味生脈補心丹干預，旨在挖掘中藥方藥的可能作用機制。

研究中與正常組比較，模型組的TG、TC、LDLC、脂聯素水平降低，HDL-C、IL-6、TNF-α、CRP、FBG升高。與模型組比較，中藥組和西藥組的動脈粥樣硬化程度降低，斑塊程度下降；中藥組和西藥組的心肌纖維化程度降低，心肌受損程度下降。中藥組和西藥組的外在表現均優于模型組；中藥組和西藥組TG、TC、LDLC的值降低，HDL-C的值升高；脂聯素水平升高，IL-6、TNF-α、CRP降低。說明加味生脈補心丹和西藥組均有降血脂、血糖，改善心肌纖維化，減輕心肌受損程度作用。加味生脈補心丹由生地黃、人參、茯苓、麥冬、柏子仁、五味子、天花粉、丹參、枳實等中藥組成。本方心脾腎同治，陰陽兼顧，共奏滋陰清熱、補脾益氣、活血化瘀之功效。加味生脈補心丹組能夠有效地改善冠心病心肌缺血，機制可能為通過降低冠心病大鼠的血糖、血脂及改善脂聯素水平和改善炎癥反應，起到抗促進循環、保護心肌作用。

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Effect of Jiawei Shengmai Buxin Decoction on Coronary Atherosclerosis in Rats with Qi Deficiency and Blood Stasis

PAN Jixing，DENG Wenxiang，ZENG Guang，et al.Changsha Hospital of Traditional Chinese Medicine（Changsha Eighth Hospital），Hunan，Changsha 410208，China.

R285.5文獻標志碼：A

1004-745X（2016）07-1303-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.012

國家自然科學基金面上項目（81373551）；教育部博士點博士導師課題（20134323110001）；湖南省科技廳社會發展支撐計劃重點項目（2014S2032）；湖南省中醫藥科研計劃項目（2014153）；湖南省研究生創新課題（CX2015B332）；湖南中醫藥大學中醫診斷學國家重點學科開放項目（2013ZYZD04，2014-5，2014-28，2015ZYZD32）；湖南省學位與研究教育教學改革研究課題（JG2015B068）
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（電子郵箱：zengguang033@126.com）

2016-03-16）