電針聯合穴位注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用*

黃萍 郭俐宏陳少秀（湖北省十堰市太和醫院，湖北醫學院附屬醫院，湖北十堰442000）

·實驗報告·

電針聯合穴位注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用*

黃萍 郭俐宏△陳少秀
（湖北省十堰市太和醫院，湖北醫學院附屬醫院，湖北十堰442000）

目的觀察電針聯合穴位注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用。方法SD大鼠40只，按隨機數字表法分為模型組、電針組、穴位注射組及聯合組，4組大鼠均采用右側頸動脈線栓大腦中動脈Willis環，阻斷血流45min后再灌注45min，并反復3次的方法，建立大鼠腦缺血/再灌注損傷的動物模型。電針組施平補平手法，取風池、百會、四神聰、腎俞、三陰交為主穴電針刺激30min；穴位注射組穴位注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液；聯合組治療方法為電針組加穴位注射組；觀測0min、4 h及1 d、7 d、14 d、21 d局部腦血流量（RCBF）、腦電圖病理性棘波波幅（EEG）；取腦組織TTC染色后記數頂葉皮質層幸存神經元，并分別測定腦梗死率、血漿肌酸激酶同工酶BB（CK-BB）。結果聯合組在第7日、14日、21日顯著提高RCBF及幸存神經元密度值、降低CK-BB、EEG病理性棘波波幅及梗死率，與模型組、電針組及穴位注射組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論其作用機制應與電針刺激以疏通經絡、激發經氣，松弛缺腦血管平滑肌、改善微循環而增加RCBF，單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉營養、再生與重構中樞神經細胞，電針與穴位注射共同促進缺血腦能量代謝而起到保護作用有關。

電針聯合穴位注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉腦缺血/再灌注損傷局部腦血流血漿肌酸激酶同工酶BB

【Abstract】Objective:To observe the protective effect of electroacupuncture combined with acupoint injection of sodium monosialotetrahexosylganglioside on cerebral ischemia/reperfusion in rats.M ethods:40 SD ratswere randomly divided into the model group，electro acupuncture group，acupoint injection group and the combined group.Four groups of rats received the right carotid artery occlusion of middle cerebral artery occlusion Willis ring，45minutes after reperfusion for another 45minutes，and repeating 3 times to establish the animalmodel of brain injury ischemia/reperfusion in rats.Electro acupuncture group took reinforcing technique，taking Fengchi，Baihui，Sishencong，Shenshu，Sanyinjiao acupoints electroacupuncture for 30 min.Acupoint injection group took acupoint injection of sodium monosialotetrahexosylganglioside.The combined group took electro acupuncture and acupoint injection.The data of 0min，4 hours and 1st day，7thday，14thday and 21stday was observed，such as regional cerebral blood flow（RCBF），EEG pathologic spines；popo（EEG）from the brain tissue TTC staining.The number of survival neurons in parietal cortex，and the cerebral infarction rate were measured，as well as serum creatine kinase isoenzyme BB（CK-BB）.Results:On 7thday，14thday，21stday，surviving neuron density and RCBF obviously rose，and CK-BB，pathological spike wave amplitude of EEG and rate of infarction dropped. Compared with the other groups，the differenceswere statistically significant（P《0.05）.Conclusion:Themechanism may be related to the stimulation of electroacupuncture，which can dredge the channels，promote themovementof the channel Qi，relax cerebral vascular smoothmuscle，and improvemicrocirculation to increase RCBF.At the same time，sodium monosialotetrahexosylganglioside can nourish，regenerate and reconstruct the central ner-vous system.Electroacupuncture combined with acupoint injection can promote cerebral energy metabolism in cerebral ischemia，so as to play a protective role.

【Key words】Electroacupuncture combined with acupoint injection；Sodium monosialotetrahexosylganglioside；Cerebral ischemia/reperfusion injury；Local cerebral blood flow；Plasma creatine kinase isoenzyme BB

腦梗死（ACI）即急性缺血性腦卒中，是血管粥樣硬化脫落斑塊栓塞腦血管而引起急性血流障礙，造成局灶性腦缺血梗死，并最終導致腦功能障礙的一類急性腦功能缺損疾?。?］。其起病急促，致殘率及病死率極高，是臨床嚴重威協人類健康的疾病。根據中醫“正氣存內，邪不可干”的觀點［2］，尋找有效的防治急性缺血性腦卒中方法、減輕腦缺血/再灌注對神經元損害、促進神經元功能恢復成為當務之急。筆者應用大鼠缺血再灌注損傷模型，采用“風池、百會、四神聰、腎俞、三陰交”電刺激并聯合穴位注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉路注射液，觀察其對大鼠缺血/再灌注后局部腦血流量（RCBF）及葉皮質層幸存神經元等的影響?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1動物及分組SD大鼠40只，體質量160～200 g，雌雄不拘，由湖北省實驗動物中心提供，實驗動物設施使用許可證：SYXK（鄂）2011-0031；實驗動物生產許可證：SCXK（鄂）2011-0008。采用隨機數字表編號，隨機分為模型組、電針組、穴位注射組及聯合組，每組10只。術后每日碘伏消毒，頭孢哌酮0.2 g/（kg·d）肌肉注射，動物房溫度保持18～25℃，濕度保持50%～75%，大鼠應單籠飼養，12 h交替光照，蘇醒后自由飲水、喂養，每日觀察動物進食情況，稱體質量，及時清理糞便［3］。

1.2試藥及儀器BL-420L生物信號采集記錄系統（成都市泰盟公司）。FM-600科研型倒置數碼熒光系統（上海普丹光學儀器有限公司，型號FM-600）；電解式組織血流計（日本松下，FBR-1）；精密電子天平（上海精密電子天平醫療儀器公司，FA-1004）；醫學影像分析儀（日本SNOY，X52-H）。栓線（將釣魚線剪成長約50 mm，并在18 mm處作標記，酒精消毒后置于生理鹽水中備用）。SDZ-II型電子針療儀（上海坤弘，型號SDZ-II）；單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉（長春翔通藥業有限公司，批號H20066833）；弗氏完全佐劑（上海實生細胞生物技術有限公司）；0.9%氯化液注射液；TTC染色劑（上海日初生物科技有限公司）。

1.3模型制備參考文獻［4］，將動物用3%戊巴比妥鈉（10mg/100 g）經腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術臺，頸部正中切口，分離出右側頸總動脈并找到頸總動脈入顱之翼腭動脈起始部，分離翼腭動脈并用微動脈夾夾閉，置另一微動脈夾同時夾閉右側頸總動脈及頸內動脈主干遠心端。在頸外動脈近心端剪一T字小口，用制備好的栓線緩慢插入，此時將頸外動脈殘端處絲線的松結拉緊，除去頸內動脈的動脈夾，繼續將絲線沿著頸內動脈插入18 mm或有阻力感即阻塞了大腦中動脈Willis環，阻斷血流30 min后再灌注30min并反復3次后即可抽出絲線并除去微動脈夾。分層關閉頸部肌肉及皮膚，術后共有39只大鼠存活，術后24 h以局部腦血流量及腦電圖幅度急劇下降，左側前肢內收，提尾懸空不能伸展左側前爪，行走向左側轉圈為入選標準，挑選其中32只大鼠符合腦缺血再灌注損傷動物模型入選標準，模型成功率為80%。電針組手術同上但不插入栓線阻塞了大腦中動脈Willis環。

1.4干預方法參照大鼠穴位圖譜文獻［5］，電針組取“風池、百會、四神聰、腎俞、三陰交”為正極，施平補平手法用一次性無菌針灸針齊刺至針感，旁開5～8 mm為負極，接SDZ-Ⅱ型電子針療儀，連續波，頻率10 Hz，留針30 min；穴位注射組取“百會、足三里、血?！毖ㄎ蛔⑸鋯瓮僖核崴募禾巧窠浌澻罩c注射液（0.1mL）；聯合治療組先給予電針組相同治療，在電針治療后休息1 h，取“百會、足三里、血?！毖ㄎ蛔⑸鋯瓮僖核崴募禾巧窠浌澻罩c注射液；模型組每日僅作對照觀察。以上治療每日1次，7 d為1個療程，連續治療3療程。

1.5標本采集與檢測1）腦梗死率及幸存神經元測定。4組大鼠于治療21 d后斷頭處死，參照大鼠穴位圖譜文獻［6］，迅速分離腦組織后濾紙吸干稱重，-20℃冰凍30 min，37℃的1%TTC避光染色30 min后用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋、將視交叉平面至乳頭體后部平面切成2mm厚腦片，由于梗死區著色加深，精確剝離梗死部位，精密電子天平精確稱量并記錄重量，計算梗死率［腦梗死率（%）=（梗死部位質量/腦總質量）×100%］。光鏡下記數觀察幸存神經元密度值，采用C5 0.5網形目鏡尺分號別對各組大鼠頂皮質Ⅰ區進行記數，記數與任一測點外上角和測線（橫線）上緣交叉的幸存神經元，每片腦片取3個視野，每鼠共42個視野，累加記數取均值，即為該鼠幸存神經元密度值。2）局部腦血流量（RCBF）、生物信號采集記錄系統記錄及腦電圖（EEG）及血漿肌酸激酶同工酶（CK-BB）測定。RCBF（mL/100 g/min）采用日本生物醫藥公司生產的電解式組織血流計（FBR-1）測量。在大鼠的顱頂右側皮下安置銀絲電極，采用EEG棘波波幅，大鼠缺血/再灌注0min、4 h及1 d、7 d、14 d、21 d EEG波幅（參數設置為速度12mm/div；波寬0.05 s；電壓2 mV；頻率100 Hz）。

1.6統計學處理采用SPSS15.0統計軟件分析。RCBF及EEG的影響采用重復測量方差分析，CKBB、梗死率及幸存神經元密度值比較采用兩兩比較t檢驗，計量資料以（±s）表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠CK-BB、梗死率及幸存神經元密度值比較見表1。電針組及穴位注射組CK-BB、梗死率有一定程度降低，幸存神經元密度值明顯提高，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），電針組及穴位注射組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；聯合組CK-BB、梗死率明顯降低，幸存神經元密度值明顯提高，與電針組及穴位注射組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1　各組大鼠腦缺血梗死率、CK-B B及幸存神經元密度值比較

表1　各組大鼠腦缺血梗死率、CK-B B及幸存神經元密度值比較

與模型組比較，*P＜0.05；與電針組比較，△P＜0.05；與穴位注射組比較，▲P＜0.05。

組別幸存神經元（個/100mm2）梗死率（%）模型組1.12±0.15 33.18±2.74 n CK-BB（IU/L）8 531.18±45.74電針組1.52±0.18*25.01±2.35*8 450.01±43.35*穴位注射組8 422.32±37.62*2.17±0.21*27.33±2.42*聯合組8 341.17±26.97△▲3.10±0.27△▲18.54±1.75△▲

2.2各組大鼠RCBF比較見圖1。BL-420L記錄顯示，4組大鼠采用右側頸動脈線栓大腦中動脈Willis環后，RCBF立即急劇下降，在4 h時降至最低點，治療至第7日時，模型組維持在低水平，電針組、穴位注射組及聯合組均有不同程度升高，其中電針組、穴位注射組組間比較無差異，聯合組升高明顯優于電針組、穴位注射組，且于第14日已恢復至正常水平。

圖1　各組大鼠RCB F比較

2.3各組大鼠EEG比較如圖2。4組大鼠腦缺血再灌注0 min、4 h及1 d、7 d、14 d、21 d EEG圖形變化情況。各組大鼠在阻塞了大腦中動脈Willis環術后EEG棘波波幅即刻均急劇上升，于4 h達峰值。治療7 d時電針組、穴位注射組降低并持續到21 d，聯合組降低更明顯，與電針組、穴位注射組比較降低更明顯。

圖2　各組大鼠E EG比較

3　討論

缺血性腦卒中時，實驗室檢查常見RCBF降低及出現異常EEG，血漿CK-BB在腦損傷極為敏感［7］，此時腦組織因缺血缺氧，能量供應不足，細胞Na-K+-ATP酶大量釋放，導致線粒體的結構及功能破壞，細胞能量代謝發生障礙，加速神經細胞凋亡。單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液主要成分為單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉，系自豬腦中提取制得的對神經細胞功能損傷具有修復和保護作用的物質。其與神經細胞膜結合，改善細胞膜酶的活性減輕腦細胞水腫，對損傷后繼發性神經退化有保護作用，可治療腦萎縮腦梗死、脊髓損傷、腦出血、新生兒缺氧缺血性腦病顱神經病變［8］。

在治療21 d時實驗結果顯示，測得值顯示，聯合組在第7日、14日、30日3個時點顯著提高RCBF及幸存神經元密度值、降低CK-BB、EEG病理性棘波波幅及梗死率，且這種改變明顯優于電針組及穴位注射組。本實驗表明，電針“風池、百會、四神聰、腎俞、三陰交”穴，針刺穴位能激發經氣，疏通經絡，符合“治未病”中醫的觀點［9］，治療當以調補肝腎、益精生髓、醒腦開竅、舒經通絡為治法［10］。風池、百會、四神聰、腎俞、三陰交等穴位是歷代中醫治療腦癱的經驗穴，其中百會、四神聰位于頭部，頭為諸陽之首，是臟腑經絡匯聚之所，針刺二穴具有通調督脈、醒腦益智，激發人體陽氣之功效；風池為祛風要穴，配以腎俞及三陰交，可舒經通絡、補益氣血、強筋健骨，從而糾正患兒肢體畸形及異常姿勢，促進肢體功能的恢復［11］。故電針以上穴位時，擴張局部腦血管，增加RCBF，進而減少了其腦梗死面積。經穴位注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液吸收后，該藥具有生理作用是促進“神經重塑”［12］。幸存神經元密度值增高提示該藥物可能具有改善細胞膜系統的鈣運轉能力，減少鈣離子在線粒體內過多的堆積，促進細胞的能量代謝以恢復缺血再灌注受損的腦組織功能。單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液可穩定細胞膜的結構和功能、恢復細胞Na-K+-ATP酶活性，促進缺血性腦卒中時受損中樞神經系統神經細胞代謝，抑制損傷神經細胞異常放電，降低EEG病理性棘波波幅，增加幸存神經元密度值［13］。大量臨床及實驗研究證實單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液作為神經營養因子的增強劑，具有增加RCBF，促進受損神經軸突生長與重構，提高缺血缺氧神經細胞存活率、調節突觸的信號傳導與腦電活動，對神經中樞系統起到良好的保護作用［14-15］。

綜上所述，電針聯合穴位注射單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液對大鼠腦缺血/再灌注損傷具有明確的保護作用。這與單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液改善腦組織的能量代謝，促進腦神經細胞功能恢復，減輕缺血再灌注后腦組織損傷，電針疏通經絡，增加RCBF，改善病灶缺血、水腫，減少腦梗死面積而對腦組織起到保護作用相關。

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Protective Effect of Electroacupuncture Combined w ith Acupoint Injection of Sodium M onosialotetrahex-osylganglioside on Cerebral Ischem ia/Reperfusion in Rats

HUANG Ping，GUO Lihong，CHEN Shaoxiu.Department of Dermatology，Taihe Hospital Affiliated Hospital of Hubei Medical College，Hubei，Shiyan 442000，China.

R245．9文獻標志碼：A

1004-745X（2016）07-1335-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.022

湖北省衛生廳重點項目（2012Z-B06）
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（電子郵箱：chends1226@163.com）

2015-11-18）