內蒙古烏蘭察布布氏菌分離株種型鑒定及流行病學特征分析

劉志國，王　妙，劉日宏，趙鴻雁，樸冬日，崔步云，夏咸柱

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內蒙古烏蘭察布布氏菌分離株種型鑒定及流行病學特征分析

劉志國1,2,3，王妙3，劉日宏3，趙鴻雁4，樸冬日4，崔步云4，夏咸柱5

目的鑒定臨床分離布氏菌種型，并分析患者的流行病學特征。方法以牛種、羊種、豬種標準參考菌株為試驗對照，采用經典方法和VITEK2.0進行初步鑒定，用AMOS-PCR進行確證，并分析患者的流行病學特征。結果經典鑒定115株均為羊種菌，羊3型93株，羊1型22株；115株菌ProA、TyrA、URE和GlyA全部陽性；91株ELLM陽性、14株APPA陽性，提示均為布氏菌，其中羊種菌91株，豬種菌14株。與經典實驗的鑒定符合率比較鑒定布氏菌屬100%，鑒定布氏菌種為79%(91/115)；AMOS-PCR均獲得了約731 bp的特異性擴增條帶，證實全部為羊種菌。初診患者84例，構成比為73%；臨床表現以疼痛、發熱、乏力、多汗居多；88例患者就診前無用藥史，2例有布病治療史。結論VITEK2.0是一種高效的布氏菌鑒定方法，但不能替代經典方法；羊種3型菌為該地區的主要流行菌種，再感染可能是慢性患者或有布病治療史患者分離到布氏菌的主要因素，初診、未用抗生素且癥狀典型是分離布氏菌的重要指標。

布氏菌；種型鑒定；流行病學

Funded by the Medical and Hygiene Research Projects of Inner Mongolia Health and Family Planning Commission (No. 201301094)

布氏菌病(布病)是由布氏菌屬細菌侵入機體引起的人獸共患傳染-變態反應性疾病，是《中華人民共和國傳染病防治法》中規定報告的乙類傳染病。世界動物衛生組織(OIE)將其列為B類動物疫病。布病在世界范圍內廣泛流行，是全球特別是發展中國家面臨的主要公共衛生問題[1-2]。中國是布病的歷史疫區，特別是在西北和東西地區，布病流行較為嚴重。進入新世紀后，全國布病發病呈逐年上升趨勢，發病范圍不斷擴大，疫點不斷增加[3]。在內蒙古101個旗縣市區中有94個是人間布病歷史疫區。中國的布病病例約1/4來自內蒙古，而2011年烏蘭察布市的布病病例數占內蒙古的39.6%[4]。近年，在采取一系列重要舉措后，該地區布病的高發態勢得到了有效遏制，但人畜間布病防控形勢依然嚴峻[5]。為了系統的了解烏蘭察布地區布病流行規律和病原特點，對分離的布氏菌菌株進行多種方法的鑒定，對相應患者的流行病學特征進行分析，以期為該地區布病防控提供參考。

1　材料和方法

1.1菌株來源115株布氏菌分離自烏蘭察布市地方病防治中心就診的患者血液樣本，牛種(544A)、羊種(16M)、豬種(1330S)標準參考菌株來自于中國疾控中心傳染病所(傳染病所)布病室。布病實驗室檢查、臨床癥狀記錄以及病例確認判定均按照國家人間布病判定標準和內蒙古人間布病診療方案(試行)執行；活菌試驗操作在傳染病所生物安全3級實驗室完成。在烏蘭察布的地區劃分中，習慣上以大青山以南部分稱為前山地區，以北部分稱為后山地區，具體地區名稱用WS1-11表示，周邊地區用ZB1-3表示，WS-12即地址未知。

1.2流行病學資料收集整理2011-2015年間在烏蘭察布市地方病防治中心分離的115株布氏菌的相關資料和病歷，包括性別、年齡、民族、職業、接觸史以及病原種型、病原分布、菌種地區分布、樣本及患者實驗室檢查結果、臨床癥狀表現等有關情況進行匯總分析。

1.3主要儀器與試劑全自動細菌鑒定及藥敏分析系統VITEK 2 .0 Compact 、GN卡(革蘭陰性桿菌鑒定卡)(梅里埃)，麥氏細菌濁度儀(DENSIMAT型)、Class 11 A2型生物安全柜(美國Forma公司)，生化培養箱(上海一恒儀器公司)，24孔高速離心機、PCR儀(sigma 德國)，水平電泳槽、電泳儀(北京君意東方電泳設備公司)，凝膠成像系統GelDoc-It310(北京天美儀器公司)，全自動核酸提取儀及試劑TACO-3(臺灣瑞基海洋生物技術公司)。

1.4基因組DNA提取嚴格按照全自動核酸提取儀TACO-3操作步驟和使用說明進行試驗菌株和標準參考菌株的基因組DNA提取，測定核酸濃度(260/280)，標記后-20 ℃保存備用。

1.5經典鑒定經典鑒定方法包括標準陽性血清凝集試驗；A、M單因子血清凝集試驗、硫化氫產生試驗、CO2需要、染料抑菌試驗及噬菌體裂解試驗，具體操作步驟遵照衛生部疾病預防控制局《布魯氏菌病防治手冊》[6]。

1.6全自動細菌鑒定分析取生長48 h待檢布氏菌溶解于3 mL滅菌生理鹽水中，并稀釋為麥氏濁度0.5，用封口膜封口，在封口膜中央靠近VITEK卡槽的一端用無菌銳器扎一小口，將GN鑒定卡導管插入菌懸液中，上機鑒定，鑒定完畢后及時將廢棄物高壓滅菌處理，并做好廢物倉消毒滅菌。鑒定結果分析參照梅里埃(GN卡)布氏菌屬和種的生化陽性鑒定標準和參考菌株結果。

1.7AMOS-PCR采用25 μL擴增體系。2×Premix Taq 10 μL，primer IS711(10 pmol/μL)1 μL；primer A、M、O、S(10 pmol/μL)各0.4 μL；DNA 1 μL，高壓雙蒸水補足體積。擴增參數:95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；終末延伸72 ℃ 5 min，35個循環。經2%凝膠電泳，120 V，1 h檢測擴增產物，凝膠成像系統成像。

2　結　果

2.1經典鑒定結果115例患者血清琥紅平板凝集試驗全部陽性，其中114例的試管凝集效價1∶100(++)，1例為1∶100(+)。22株為羊種1型菌，93株為羊種3型菌。見表1。

表1115株臨床分離布氏菌經典鑒定結果表

Tab.1Classical methods identified result of 115 clinical isolated Brucella

IDSerologicaltestPositiveserumAseraMseraCO2requirementH2SproductionDyeinhibitiontestsPhagelysistestthioninefuchsineBK2104TbWBNo.ofstrainsSpecies/Biovar16M+-+--+++--1羊1544A++-±--+++-1牛11330S++---+-+++1豬122株+-+--+++--22羊193株+++--+++--93羊3

2.2VITEK 2.0實驗結果3株參考菌株ProA、TyrA、URE和GlyA全部陽性；牛種參考菌株乳酸鹽產堿(1IATK)、ELLMAN(ELLM)陽性；羊種參考菌株ELLMAN(ELLM)、dGLU(D-葡萄糖)陽性；豬種參考菌株APPA陽性； 115株試驗菌株的ProA、TyrA、URE和GlyA全部陽性；91株ELLM陽性、14株APPA陽性、11株dGLU陽性，PyrA、H2S和GGAA陽性各1株，提示菌株全部為布氏菌。91株為羊種菌，14株為豬種菌，與經典實驗的鑒定符合率為79%(91/115)。生化實驗了共檢測64項生化指標，本試驗中11個生化指標對布氏菌鑒別分析有意義，其余均為陰性，為非布氏菌鑒別指標。該實驗每次8 h內完成。見表2。試驗菌株的耗時數和可信度均為平均值，耗時范圍為6.25～8，可信度范圍為97%～99%；ProA為L脯氨酸芳胺酶；TyrA為酪氨酸芳胺酶；URE為尿素酶；GIyA為氨基乙酸芳胺酶；1LATK為乳酸鹽產堿；ELLM為ELLMAN；APPA為丙氨酸-苯丙氨酸一脯氨酸芳胺酶；dGLU為D-葡萄糖；PyrA為吡咯烷基芳胺酶；H2S為硫化氫產生；GGAA為谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶。

2.3AMOS-PCR鑒定結果經擴增和電泳檢測，陽性對照擴增獲得了預期片段，分別為牛種498 bp、羊種731 bp、豬種275 bp；陰性對照未見擴增。試驗菌株均獲得了單一、特異的約731 pb擴增條帶，條帶與對照羊種菌產生的條帶一致，判定為羊種布氏菌。詳見圖1。

表2115株布氏菌全自動生化鑒定結果

Tab.2Automatic biochemical identification results of 115 Brucella strains

菌株Strains牛種B.abortus羊種B.melitensis豬種B.suis試驗菌株TeststrainsNo.ofstrains111115Time-consuming86.7587.7probability(%)98999898.8proA111115TyrA111115URE111115GlyA111115Test1LATK1---resultELLM11191APPA--114dGLU-1-11PyrA---1H2S---1GGAA---1

1-3 as positive control, B. abortus 544A, B. melitensis 16M, B. suis 1330S, respectively; 4-47, test strains; lane, 48 negative control圖1　布氏菌AMOS-PCR鑒定結果Fig.1　Identification result of Brucella by AMOS-PCR

2.4病例特征分析

2.4.1性別、民族和職業分布在115例患者中，84(73%)例為男性，31(29.6%)例為女性，男女比例約為2.7∶1；112為漢族，2名為蒙族，1名不詳，漢族的構成比為97.4%；農民99名，構成比為86%(99/115)、牧民 2名，學生9名，司機 2名，市民 2名，個體1名(經營超市)；布病對性別、民族無選擇性，僅與接觸有關。

2.4.2年齡分布患者主要集中在40～69歲年齡范圍，共計83例，構成比約為72.2%(83/115)，最小為7歲，最大為71，平均年齡46歲。

2.4.3接觸史和發病時間115名患者均直接或間接與羊及其產品有接觸史，其中初診84(73%)名，復診27名，不詳3名。從發病后就診時間來看，發病后30 d之內前來就診人數最多，為34(29.5%)例；10 d之內為14例，60 d之內11例，半年之內14例，1年之內前來就診人數23例；1年以上為5例，不詳14例。

2.5臨床表現布病患者大多數以疼痛、發熱、乏力、多汗為主。88例表現疼痛、54例發熱、34例乏力、14例多汗。疼痛以腿疼居多，主要包括膝關節和大、小腿肌肉困疼，活動受限；全身疼表現為全身游走性的關節和肌肉酸疼；腰疼多為腰部僵直或單側腰部疼痛；關節疼以骶髂、胯和肩關節等大關節疼痛為主。綜合癥狀以疼痛和發熱最多，其次伴有乏力、多汗、頭疼、頭暈、胃部不適等多種癥狀。提示癥狀典型可作為分離布氏菌的篩選指標，疼痛、發熱為必要指標。

表3疼痛癥狀分布

Tab.3Distribution of pain symptom

疼痛Pain腿疼Legpains全身疼Bodyaches腰疼Lumbago關節疼Jointpain頭疼Headache胯疼Hippain腳疼Footpain總計TotalNo.ofcases2717171593288Proportion(%)301919171032100

2.6種型及地理分布93株羊種3型菌和22株羊種1型布氏菌分布于烏蘭察布市的11個旗縣市區以及周邊鄰近的錫盟朱日和、張家口尚義和大同市郊區等地；涉及56個鄉鎮(蘇木)，88個自然村(嘎查)；提示羊種3型和1型布氏菌是該地區布病的主要致病菌和流行菌種，混合共存，未分離到其它種型的布氏菌。分布見表4。

表4布氏菌地區及種型分布

Tab.4Region and type distribution of Brucella

旗縣市區Districts分區regions菌株數No.ofstrains旗縣Districts分區Regions鄉鎮數No.oftowns村數No.ofvillages種型及數量Speciesandnumber羊3型B.melitensisbv.3羊1型B.melitensisbv.1WS-14762340WS-220718182WS-3前山地區22613175WS-4Qianshanregion18713144WS-555541WS-674661WS-79294663WS-8后山地區63651WS-9Houshanregion98972WS-1044440WS-1111101ZB-1151110ZB-2周邊地區32230ZB-3Neighbouringregions11110WS-12Unknown55--32Total4115≥56≥889322

2.7就診前是否用藥及用藥情況就診采樣前未服用藥物88例；25例曾服用抗生素、感冒藥、中藥和腰疼藥，未服用治療布病藥物；有2例服用布病治療藥物。但使用抗生素后患者仍有布病典型癥狀，仍可進行布氏菌分離培養。

3　討　論

目前，布氏菌種型鑒定方法較多，但從實用性和可操作性方面考慮來講，以經典鑒定和分子鑒定最為常用。全自動細菌生化鑒定系統vitek 2.0基于細菌生化代謝反應在屬的水平上鑒別布氏菌，自動化程度高，可同時大批量(60株)的鑒定，結果以PDF形式輸出，保存方便，易于解讀。但vitek 2.0鑒定需操作活菌，涉及生物安全，需要注意。此次試驗共對 118株對照和分離菌株進行了生化鑒定。118株試驗菌株的ProA、TyrA、URE和GIyA 均為陽性，結果表明為布氏菌，與經典實驗結果基本吻合；其中91株鑒定為羊種菌，14株鑒定為豬種菌，與經典鑒定符合率為79%(91/115)。標準菌株與試驗菌株的鑒定可信度與先期實驗結果相吻合，試驗菌株的可信度>標準菌株的鑒定可信度；鑒定耗時本研究的試驗菌株平均耗時7.7 h，略高于先前的研究[7]。試驗表明在屬的水平上的鑒別結果較為一致。全自動細菌生化鑒定系統鑒定的14株豬種菌和其余試驗菌株經AMOS-PCR鑒定確證均為羊種布氏菌，AMOS-PCR與經典方法的鑒定結果具有很高的一致性[8-9]。66%(76/115)的布氏菌分布前山地區，而后山地區的發病率明顯高于前山，未知具體地點的菌株均來自于烏蘭察布境內。布氏菌的分布與布病發病率的差異可能是由于該試驗為被動監測，樣品均來自固定地點、臨床醫師的首診偏差和漏報等多種因素造成，并未全面反映該地區的布氏菌的地理分布特征，但證實了羊種布氏菌在該地區分布較廣，并在周邊地區均有分布。提示控制人的疫情首先從控制羊的疫情入手，其它種型布氏菌在該地區的人間布病疫情中發揮較次要的作用。

布病的感染與性別、職業、年齡等因素無統計學意義，主要與接觸患病動物相關[10]。25例患者就診前有非布病藥物治療史，表明其它藥物對布氏菌影響較小。用非布病治療藥物史的患者大多屬誤診。因布病的臨床表現不典型，在首診時應結合癥狀仔細詢問病史、接觸史，在鑒別診斷中應進行血清學試驗，以減少誤診[11]。2例患者經口服利福噴丁和四環素治療40 d后，且仍有布病癥狀也分離到了布氏菌，需要進行體外藥敏試驗和耐藥相關基因檢測以及從分子生物學方法入手，以期獲得再感染和確證是否為耐藥菌株[12]。

布病患者的臨床表現呈現全身性、多器官受損癥候[13]。本研究中大多數患者仍表現為典型的布病癥狀，以腿疼居多，大、小腿的肌肉和膝、髖關節均有疼痛。全身疼的患者主訴為全身疲乏無力、喜臥，并以全身大關節和肌肉游走性酸痛為主；關節疼以骶髂、髖、肩、膝等為主。腰疼多表現為左側或兩側腰部酸疼或困疼，從而引發胯部、下肢等不適癥狀，提示布病主要侵害較大的負重關節[14]。急、慢性期患者均可表現為骨關節和肌肉疼痛。急性期患者疼痛多呈大關節游走性疼痛且較劇烈。慢性期以運動系統的損傷最為明顯，多為鈍痛持續性疼痛?？傊?，布病的臨床表現復雜多變,癥狀各異。本實驗通過對臨床分離株種型的鑒定和患者流行病學特點的分析，掌握了該地區布病流行規律和特點，闡明了布病種型和地理分布特征，明確了篩選患者開展血樣布氏菌分離培養的主要指標，對今后的深入研究和本地區布病防控具有重要意義。

[1] Mousa AR, Elhag KM, Khogali M, et al. The nature of human brucellosis in Kuwait: study of 379 cases[J]. Rev Infect Dis, 1988, 10(1): 211-217.

[2] Brambila-Tapia AJ,Armenta-Medina D,Rivera-Gomez N, et al. Main functions and taxonomic distribution of virulence genes inBrucellamelitensis16 M[J]. PLoS One, 2014, 25, 9(6): e100349. DOI: 10.1371/journal.pone.0100349

[3] Jiang H,Fan M,Chen J, et al. MLVA genotyping of Chinese humanBrucellamelitensisbiovar 1,2 and 3 isolates[J]. BMC Microbiol,2011, 22, 11: 256. DOI: 10.1186/1471-2180-11-256

[4] Yu JD, Liu ZG, WM, et al. An epidemiological investigation of human brucellosis in Ulanqab, Inner Monglia 2011[J]. Chin J Endemiol, 2013, 32(6):656-658. (in Chinese)

于敬達,劉志國,王妙,等.2011年內蒙古烏蘭察布市人間布魯桿菌病流行病學分析[J].中華地方病學雜志,2013,32(6):656-658.

[5] Wang GM, Xu KF, Li YY, et al. Ten years analysis of brucellosis in Hohhot[J]. Chin J Pest Ctrl, 2010, 10: 892-894. (in Chinese)

王光明,許凱峰,李元元,等.呼和浩特市布魯氏菌病10年疫情分析[J].醫學動物防制, 2010, 10, 892-894.

[6] Bureau of Disease Prevention and Control. The Ministry of Health. Brucellosis control handbook[M]. Beijing: People’s Health Publishing House, 2008: 17-29. (in Chinese)

衛生部疾病預防控制局.布魯氏菌病防治手冊[M].北京:人民衛生出版社,2008:19-29.

[7] Xiao CX, Zhao HY, Hou LP, et al. Identification effects of automatic microbial analysis system onBrucellagenus and species[J]. Chin J Endemiol, 2015, 34(6): 416-420. (in Chinese)

肖春霞,趙鴻雁,侯臨平,等.全自動微生物分析系統對布魯桿菌屬和種鑒定效果的研究[J].中華地方病學雜志,2015,34(6) :416-420

[8] Matope G,Bhebhe E,Muma JB, et al. Characterization of someBrucellaspecies from Zimbabwe by biochemical profiling and AMOS-PCR[J]. BMC Res Notes,2009, 22(2): 261. DOI: 10.1186/1756-0500-2-261

[9] Jiang H, Cui BY, Zhao HY, et al. Use of AMOS-PCR assay for the species identification ofBrucella[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(02): 107-109. (in Chinese)

姜海,崔步云,趙鴻雁,等.AMOS-PCR對布魯氏菌種型鑒定的應用[J].中國人獸共患病學報, 2009,25(02): 107-109.

[10] Hu GY, Ma L, Xu LQ, et al. The serological epidemiology of brucellosis in Sanjiangyuan Region[J]. Mod Prevent Med, 2015, 42(5): 769-771. (in Chinese)

胡桂英,馬麗,徐立青,等.三江源地區布病血清流行病學調查研究[J].現代預防醫學,2015, 42(5):769-771.

[11] An N, Bai YJ, Li R, et al. Analysis of 5 misdiagnosed patients with brucellosis infection[J]. Clin Misdiagnosis Misther, 2013, 26(4): 18-20. (in Chinese)

安娜,白云靜,李蓉,等.布魯菌病五例誤診分析[J].臨床誤診誤治,2013,26(4):18-20.

[12] Kilic S. Ivanov IN, Durmaz R, et al. Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis genotyping of human Brucella isolates from Turkey[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(9): 3276-3283. DOI: 10.1128/JCM.02538-10

[13] Baldi PC,Giambartolomei GH. Pathogenesis and pathobiology of zoonotic brucellosis in humans[J]. Rev Sci Tech, 2013, 32(1): 117-125.

[14] Hasanoglu I, Guven T, Maras Y, et al. Brucellosis as an aetiology of septic arthritis[J]. Trop Doct, 2014, 44(1): 48-49. DOI: 10.1177/0049475513512645

Species identification and epidemiological characteristics analysis ofBrucellain Ulanqab, Inner Mongolia, China

LIU ZHi-guo1,2,3, WANG Miao3, LIU Ri-hong3, ZHAO Hong-yan4,PIAO Dong-ri4, CUI Bu-yun4, XIA Xian-zhu5

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot010018,China;2.HealthandFamilyPlanningCommissionofUlanqab,Ulanqab012000,China;3.UlanqabCenterforEndemicDiseaseControlandProvention,Ulanqab012000,China;4.NationalInstituteofInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention/CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDisease,Beijing102206,China;5.InstituteofMilitaryVeterinaryAMMS,Changchun130062,China)

The aim of present study is to identify species/biovar ofBrucellaclinical isolates and to analyze epidemiological characteristics of brucellosis patients. StandardBrucellastrains includingB.abortus,B.melitensis, andB.suiswere used as positive controls. Automatic microbial identification system vitek 2.0 and classical biotyping methods were used for preliminary identification, and then further examined by AMOS-PCR. Epidemiological features of 115 patients were analyzed. Classical identification showed that 115 strains ofBrucellawere allB.melitensis, including 93B.melitensisbiovar 3 strains and 22B.melitensisbiovar 1 strains. All these strains exhibited positive results with ProA, TyrA, URE and GIyA, implying that all strains wereB.melitensis. While there were 91 strains with ELLM positive reaction and 14 strains with APPA positive reaction, indicating that there might be 91B.melitensisstrains and 14B.suisstrains. Compared with classical methods, the Vitek showed a coincidence rate of 100% and 79% on genus and species identification, respectively. A specific 731 bp amplified products were detected for every strain in AMOS-PCR, confirmed that all tested strains wereB.melitensis. There were 84 newly diagnosed patients, covering 73%, with the major clinical symptoms of pain, fever, weakness and sweating. The 88 patients hadn’t taken any medication before diagnosis, while two had a treatment history for brucellosis. Vitlk 2.0 system is an efficient method forBrucellaidentification, but it can not replace classical identification methods yet.B.melitensisbiovar 3 is the major epidemic strains in this region.Brucellaisolated from patients with chronic brucellosis or with treatment history for brucellosis might be because of reinfection. Newly diagnosed patients, no antibiotic treatments and obvious symptoms were important index for obtainingBrucella.

Brucella; species identification; epidemiology

Xia Xian-zhu, Email: xiaxzh@cae.cn

夏咸柱，Email: xiaxzh@cae.cn

1.內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特010018；2.烏蘭察布市衛計委，集寧012000；3.烏蘭察布市地方病防治中心，集寧012000；4.中國疾控中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京102206；5.解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，長春130122

R378.5

A

1002-2694(2016)07-0618-05

2016-01-13；

2016-06-20

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.006

內蒙古衛計委醫療衛生科研項目(No.201301094)資助