貴州省兩株山羊源羊種布魯菌MLST分析

李沛麗，李世軍，劉　英，王　月，周敬祝，唐光鵬，王定明，周碧君

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貴州省兩株山羊源羊種布魯菌MLST分析

李沛麗1，李世軍2，劉英2，王月2，周敬祝2，唐光鵬2，王定明2，周碧君1

目的了解貴州省2010年分離自山羊的兩株羊種布魯菌的等位基因序列型(Sequence type, ST)及遺傳學特征，為動物間和人間布病疫情的預防和控制提供科學依據。方法應用布魯菌屬特異性PCR(BCSP31-PCR)和種/型特異性PCR(AMOS-PCR)對2010年分離自山羊的兩株布魯菌進行鑒定，采用多位點序列分型(Multiple locus sequence typing, MLST)技術對兩株布魯菌菌株的7個管家基因、1個外膜蛋白基因及1個基因間區的序列進行測定，將各個基因的序列與參考菌株的等位基因型進行比對，確定其等位基因譜及序列型(STs)，分析與兩株菌ST型與各種型布魯菌代表菌株的遺傳進化關系。結果來自貴州省山羊的兩株布魯菌株經BCSP31-PCR鑒定為布魯菌屬細菌，AMOS-PCR將其鑒定為羊種布魯菌。MLST分析顯示，兩株菌的9個等位基因序列型為ST8型，與同屬羊種布魯菌的ST7、ST9～ST12、ST34和ST35遺傳關系最近。結論貴州省2010年分離的2株布魯菌分離株均為ST8型布魯菌，與同屬羊種布魯菌的ST型遺傳關系最近，結果為貴州省人間和動物間布病疫情的預防和控制提供了科學依據。

山羊；布魯菌； PCR；MLST；遺傳特征

Supported by the grant from the Science and Technology Projects for Social Development in Guizhou Province (No. Guizhou science co-word SY[2013]3049), the Project of Special Fund for the Cultivation of Outstanding Youth Talents of Science and Technology in Guizhou Province (No. Guizhou Science Renhezi[2015]09), and the Found for the Research Team of Natural Foci and Vector-borne Infectious Disease Control and Prevention (No. RCJD1401)

布魯菌病(Brucellosis)(以下簡稱布病)是由布魯菌屬(Brucella)的細菌侵入機體引起世界性、多宿主感染的人獸共患病。本病歷史悠久，分布廣泛，于1860年發現于地中海的馬耳他島，故又稱為馬耳他熱、地中海熱[1]。早在20世紀50年代，布魯菌即為美軍成功研發的第一個細菌戰武器，因此也是生物反恐的一個重要潛在對象[2]。布病危害嚴重，家畜罹患布病，懷孕母畜常流產，公畜發生睪丸炎和附睪炎引起不育，病畜分泌物(如乳汁等)及臟器帶菌，并發生關節炎、淋巴結炎和滑液囊炎等引起痛疼，嚴重影響家畜的生產力和動物性產品的生物安全，給畜牧業生產帶來巨大損失[3]。對人而言，布病并不同于一般的疾病，布魯菌侵入機體引起變態反應性全身病變，急性期可以治愈，但不易被確診，常被拖延為慢性期，慢性期布病患者可有肝、脾及睪丸腫大，關節和脊柱強直，肌腱攣縮變硬等，很難治愈，患腦炎和心肌炎可致命，嚴重影響人類健康[4]。

貴州省于2010年首次從患病動物(山羊)分離出羊種布魯菌，從病原學角度證實了布病在貴州省動物的存在[5]，隨后人間布病疫情在貴州省迅速擴散，散發和暴發疫情時有發生，防控形勢非常嚴峻[6-8]。了解動物布病病原特點和流行特征是動物間和人間布病防控的基礎，本項研究采用基于布魯菌屬外膜蛋白31基因的PCR(BCSP31-PCR)和基于插入序列IS711的牛、羊、綿羊附睪和豬種布魯菌特異的PCR(AMOS-PCR)技術對2010年分離自山羊的兩株布魯菌進行屬和種(型)鑒定，采用多位點序列分型(Multiple locus sequence typing, MLST)技術對2株布魯菌菌株的7個管家基因、1個外膜蛋白基因及1個基因間區的序列進行測定[9-11]，將各個等位基因的序列與參考菌株的等位基因型進行比對，確定其等位基因譜型及菌株序列型(STs)，分析其與布魯菌不同ST型的遺傳進化關系，為貴州省動物間和人間布病的防控提供科學依據。

1　材料與方法

1.1實驗試劑布魯菌培養基采用進口布魯菌肉湯(BD公司，貨號為211088)和布魯菌瓊脂(BD公司，貨號為211086)成品培養基按照說明書配制。PCR引物由大連寶生物科技有限公司合成。PCR相關試劑購買于大連寶生物公司。

1.2實驗菌株實驗菌株為分離自貴州省2010年黔南市龍里縣動物(山羊)血液并經傳統方法鑒定為羊種生物3型布魯菌菌株(命名為LL3和LL4)。陽性對照菌株為布魯菌疫苗株A19(牛種)、M5(羊種)和S2(豬種)(購自蘭州生物制品研究所)。

1.3DNA提取挑取布魯菌可疑菌落接種于布魯菌瓊脂平板，培養48 h后采用水煮法提取細菌核酸。

1.4BCSP31-PCR法鑒定布魯菌屬采用布魯菌屬特異性基因BCSP31作為定屬基因，按照參考文獻[12-13]提供的B4和B5引物序列和參數進行布魯菌屬的鑒定。

1.5AMOS-PCR法鑒定布魯菌種/型采用參考文獻[12-13]提供的以布魯菌屬IS711插入序列為基礎建立的AMOS-PCR引物及參數進行布魯菌種/型的鑒定。

1.6MLST分析采用參考文獻[9-11]提供的布魯菌7個管家基因(dnaK、gyrB、trpE、aroA、cobQ、gap、glk)、1個外膜蛋白基因(omp25)和1個基因間區int-hyp作為MLST的靶標基因，選取的靶標基因、引物、序列及擴增長度見表1。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸l min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物委托北京天一輝生物科技公司進行雙向測序。采用DNAStar軟件包分析整理和編輯序列，使序列長度范圍與文獻中給出的序列一致。將測定序列分別與相應基因的等位基因型的序列進行比較，明確序列是否與某個等位基因型的序列一致，如果一致，則定義為某個等位基因型，否則定義為一個新的等位基因型。利用MLST在線工具對序列的等位基因型、進化關系等進行分析，確定分離菌株的ST型及與文獻[8-10]報道的36個ST型菌株(見表2)間的進化關系。

2　結　果

2.1BCSP31-PCR鑒定BCSP31-PCR方法對分離株和對照菌株核酸進行擴增，產物采用1.5%瓊脂糖電泳進行檢測，結果顯示兩株分離菌株及陽性對照菌株核酸均擴增出布魯菌屬特異的223 bp的條帶，而陰性對照無條帶出現。

2.2AMSO-PCR檢測結果AMOS-PCR方法對分離株和對照菌株核酸進行擴增，產物采用1.5%瓊脂糖電泳進行檢測，結果顯示兩株分離菌株及陽性對照菌株核酸均擴增出羊種布魯菌特異的731 bp的條帶，而陰性對照無條帶出現。

表1用于擴增和測序分析的9對引物序列Tab.1Primer sequences used for the amplification and sequencing of nine genetic loci

LocusPutativefunctionPrimersequences5'-3'Length/bpLocationgapglyceraldehydes3-phosphatedehydrogenaseYGCCAAGCGCGTCATCGT589AE0172231685083-1685671GCGGYTGGAGAAGCCCCA3'aroA3-phosphoshikimate1-carboxyvinyltransferaseGACCATCGACGTGCCGGG565AE01722329974-30538YCATCAKGCCCATGAATTCglkglucokinaseTATGGAAMAGATCGGCGG475AE017224988660-989134GGGCCTTGTCCTCGAAGGdnaKchaperoneproteinCGTCTGGTCGAATATCTGG470AE0172232066742-2067211GCGTTTCAATGCCGAGCGAgyrBDNAgyraseBsubunitATGATTTCATCCGATCAGGT469AE017223142378-141910CTGTGCCGTTGCATTGTCtrpEanthranilatesynthaseGCGCGCMTGGTATGGCG486AE0172231538194-1537709CKCSCCGCCATAGGCTTCcobQcobyricacidsynthaseGCGGGTTTCAAATGCTTGGA422AE0172231289341-1288920GGCGTCAATCATGCCAGComp2525kDaouter-membraneproteinATGCGCACTCTTAAGTCTC490AE017223710041-710530GCCSAGGATGTTGTCCGTint-hypupstreamandextreme5'ofhypotheticalprotein(BruAb1_1395)CAACTACTCTGTTGACCCGA430AE0172231372708-1372279GCAGCATCATAGCGACGGA

2.3MLST分析結果MLST分析顯示，兩株布魯菌dnaK、gyrB、trpE、aroA、cobQ、gap、glk、omp25和int-hyp位點的等位基因序列號分別為3、2、3、2、1、5、3、8和2，聚類分析顯示，兩株菌株等位基因位點序列型別與ST8型相同(表2和圖1)。Split tree分析顯示，至今已發現的36個ST型所涵蓋的布魯菌6個種呈現出相同種的ST型菌株聚類相對較近，本研究株的兩株分離株與羊種布魯菌ST7、ST9、ST10、ST11、ST12、ST34和ST35遺傳關系最近，見圖2。

圖1　貴州省兩株山羊來源羊種布魯菌與不同種型布魯菌ST型聚類分析圖Fig.1　Clustering tree of ST of two strains of B. melitensis isolated from goats and different species of Brucella

圖2　貴州省兩株山羊來源羊種布魯菌與不同種型布魯菌ST型Spilt TreeFig.2　Split tree of ST of two strains of B. melitensis isolated from goats and different species of Brucella

表2布魯菌各等位基因譜

Tab.2Allele profiles of Brucella

STgaparoAglkdnaKgyrBtrpEcobQomp25int-hypST1211213111ST2212213111ST3612213111ST4212223111ST5211214111ST65710763711ST73532152102ST8323215382ST9323215392ST103235152102ST113232153102ST123232152102ST13139213431ST14164143521ST15127133523ST16427133523ST17164153524ST18164153525ST19124613521ST20164153564ST21164153554ST22125216541ST23148412521ST24126212521ST25124212521ST26124212671ST27124311521ST282112141111ST292122131111ST30213213111ST31211213812ST32282213111ST332104273911ST343232153122ST353232853122ST36194143521

3　討　論

傳統的分類方法將布魯菌分為羊、牛、豬、犬、綿羊附睪和沙林鼠6個生物種19個生物型，即牛種布魯菌B.abortus8個型；豬種布魯菌B.suis5個型；羊種布魯菌B.melitensis3個型；犬種布魯菌B.canis、綿羊附睪種布魯菌B.ovis和沙林鼠種布魯菌B.neotomae各1型。因其生物種、型和菌株的不同，致病力各異，對人致病力最強的為羊種菌，其次為豬種菌，牛種菌對人致病力弱。動物布病主要由羊種、牛種和豬種菌感染羊、牛和豬等動物呈急性或慢性經過[4]。因此，了解布病病原學特征對布病的有效預防和控制至關重要。貴州省分別于2010年首次從患病動物(羊)和病人分離出羊種布魯菌[5-6]，此后，布病疫情在貴州省迅速擴散，散發和暴發疫情時有發生[7-8]。本研究將來源于貴州省山羊的兩株菌株采用屬特異性BCSP31-PCR和AMOS-PCR進行鑒定，結果顯示本次分離的可疑細菌為羊種布魯菌。

傳統血清學方法鑒定只能將布魯菌鑒定到種(型)，無法對菌株進行溯源分析，一些低分辨率的分子分型方法如PCR產物限制性片段長度低多態性(PCR-RFIP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD-PCR)和擴增片斷長度多態性分析(AFLP)等在分子流行病學中應用價值十分局限。由于布魯菌屬種間DNA同源性高達90%，需要高分辨力的分型方法用來提供疾病傳播模式和分子流行病學信息，隨著分子生物學的發展，分子分型技術被廣泛應用于傳染病病原菌的溯源。布魯菌分子分型方法如脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)[13]、多位點可變數目串聯重復序列分析(multilocus variable-Humber tandem repeat analysis, MLVA-16)技術[14]應運而生和MLST技術[10]在細菌性傳染病的病原鑒定、傳染源追蹤與病原體的溯源等方面發揮了重要作用。然而，PFGE實驗過程中活菌操作繁多，實驗室感染風險較大，與MLVA-16技術相比，MLST方法更能反映菌株的遺傳特征，在實驗過程的可操作性及實驗結果的可靠性之間取得了平衡，在不同的實驗室之間具有良好的可比性[10]。Adrian等[9]2006年采用MLST技術對來自不同國家的160株不同種型布魯菌分為27個ST型，Chen YF等[11]對來自中國的60株布魯菌進行了MLST分析，結果在Adrian等發現的27個ST型的基礎上增加了9個新的ST型，分別命名為ST28～ST36。因此，本研究中我們采用布魯菌MLST分子分型方法對2010年分離自貴州省山羊的菌株進行分子分型分析并與已發現的ST型進行比對，結果兩株菌株均為ST8型，聚類分析結果顯示(圖1)，本次分離菌株與同屬羊種布魯菌幾個ST型聚類處于同一分支，其中與ST8型聚類最近，從遺傳學水平證實了兩株布魯菌為羊種布魯菌，這與全國布魯菌病原體種型分布一致[15-16]，同時與Chen YF以及周曉艷[10-11]等發現的中國菌株以ST8為優勢序列型的結果一致，提示ST8(表2)序列型可能為貴州省動物間和人間布病病原體的優勢序列型。流行病學調查資料顯示，本研究中的患者均為養羊戶，所飼養的羊多數為我省因畜牧業發展需求而從外地引進羊或是來歷不明的山羊，本研究分析證實兩株布魯菌序列型與我國其他地區的具有流行優勢的ST8型一致，提示我省動物間布魯菌感染為輸入性傳播。

為了進一步了解分離株的遺傳學特征，我們利用Splits tree工具，對ST型的數據進行分裂分解分析(Split decomposition analysis)，從圖2中可以看出，ST8與其它幾個同屬于羊種布魯菌的ST型(ST7～ST11、ST34和ST35)相距較近，它們均由ST12分離而來。與其它種的布魯菌相比，羊種菌的這幾個ST型是聚集較近，說明羊種布魯菌在基因水平上是高度保守的。

貴州省近年正值畜牧業大力發展時期，羊、牛等種畜大多從國內布病高發的區域引進，在引種的同時有可能導致布病傳染源輸入貴州省引發畜間或人間布病流行。2010年首次從山羊分離出羊種布魯菌，從病原學角度證實了布病在畜間存在[2]，隨后的2011年相繼在患者血液分離出羊種布魯菌[6]，人間布病疫情迅速擴散，疫情中多數患者均為養羊戶或與羊具有接觸史，且患者分離流行菌株均為羊種布魯菌，本研究結果顯示2株山羊來源菌株為羊種布魯菌的ST8型，提示ST8型菌株很有可能是引起人間布病疫情的病原菌，然而，人間布病流行菌株序列型是否同為ST8型尚需進一步研究。此外，本研究分析的動物來源菌株數量受限，結果是否具有代表性尚需進一步研究。本研究對貴州省2010年分離自山羊的的兩株布魯菌采用PCR方法和MLST技術進行分析，揭示了菌株序列型為ST8，結果為貴州省布病的防控提供了科學依據，在保護人群健康和保障畜牧業發展方面具有重要意義。

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Multiple locus sequence typing of two strains ofBrucellamelitensisisolated from goats in Guizhou Province

LI Pei-li1, LI Shi-jun2, LIU Ying2,WANG Yue2, ZHOU Jing-zhu2,TANG Guang-peng2,WANG Ding-ming2,ZHOU Bi-jun1

(1.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;2.GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,China)

In order to understand the allele locus gene sequence type (ST) and the genetic characteristic of twoBrucellamelitensisstrains isolated from goats in Guizhou Province in 2010 and provide scientific basis for the control and prevention of animal and human brucellosis, the two isolates were identified by usingBrucellagenus specific BCSP31-PCR and species-specific AMOS-PCR, and the seven house-keeping genes and one out membrane protein gene and one gene -inter- region sequence of the strains were further analyzed using multiple locus sequence typing (MLST). Each gene sequence was compared with the reference strains to determine the allelic profile and sequence type, and the ST data-based genetic relationship of the two isolates andBrucellastrains representing different species were analyzed. The results showed that the twoBrucellastrains were identified asB.melitensiswith BCSP31-PCR and AMOS-PCR. MLST analysis revealed that the 9 alleles based sequence type of the two strains was ST8, which was genetically closed to the STs (ST7, ST8-ST12, ST34 and ST35) belonging toB.melitensis. The results indicate that the sequence type of the two strains ofB.melitensisisolated from goats in Guizhou Province in 2010 is ST8, close to the STs belonging toB.melitensis.

goats;Brucellamelitensis; PCR; MLST; genetic characteristic

Zhou Bi-jun, Email: as.bjzhou@gzu.edu.cn；Li Shi-jun,Email:zjumedjum@163.com

周碧君，Email：as.bjzhou@gzu.edu.cn；李世軍，Email：zjumedjun@163.com

1.貴州大學動物科學院，貴陽550025；2.貴州省疾病預防控制中心，貴陽550004

R378.5

A

1002-2694(2016)06-0547-06

2015-07-28；

2015-11-19

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.008

貴州省科技公關計劃社會發展項目(No.黔科合SY[2013]3049)、貴州省優秀青年科技人才培養對象專項資金項目(黔科合人字[2015]09號)和貴州省傳染病人才培養基地項目(黔人領發[2013]15)“自然疫源性和蟲媒傳染病”研究團隊(RCJD1401)經費聯合資助