采油廢水ABR厭氧處理系統中微生物的群落特征*

劉宇輝　劉利　王帥　章春芳　譚自航　解慶林

(1.桂林理工大學環境科學與工程學院　廣西桂林 541006；　2.賀州學院　廣西賀州 542800；3.浙江大學海洋學院　浙江舟山 316021)

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水污染治理

采油廢水ABR厭氧處理系統中微生物的群落特征*

劉宇輝1劉利2王帥1章春芳3譚自航1解慶林2

(1.桂林理工大學環境科學與工程學院廣西桂林 541006；2.賀州學院廣西賀州 542800；3.浙江大學海洋學院浙江舟山 316021)

為了了解采油廢水ABR厭氧處理系統中起主要作用的微生物種群，利用高通量測序手段分析了北海潿洲島采油廢水處理終端ABR厭氧反應池內的微生物群落特征。結果表明，ABR反應池內活性污泥中的細菌主要是產甲烷菌，主要來源于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和熱袍菌門。目前已經形成了以產甲烷菌介導的穩定的功能降解菌群。真菌主要來源于三個門類：Ascomycota、Basidiomycota和Zygomycota，對于采油廢水中的組分均有一定的降解作用。

采油廢水折流式厭氧反應器微生物群落高通量測序

0　引言

采油廢水產生于石油生產中的多個環節，包括石油純化過程中原油脫水產生的廢水，海底管線油水置換水以及船舶工作過程中的壓載水[1]。采油廢水所含成分復雜，不僅含有大量的石油類物質，而且還含有溶解性無機鹽、懸浮性固體、硫酸鹽、氨以及重金屬類物質，屬于難處理廢水，如果處理不當，就會對周邊環境和人體產生危害。

生物法處理采油廢水具有經濟方便、環境友好等特點，是處理采油廢水的關鍵步驟，其中微生物代謝在處理廢水中起了重要作用。北海潿洲終端處理廠廢水處理站采用厭氧-好氧串聯活性污泥法處理采油廢水，已穩定運行10年，處理水量可達1 000 m3/d，出水水質達到國家污水綜合排放標準(GB 8978—1996)的一級標準[2]。該處理系統中的ABR反應器采用格室串聯結構，可以形成良好的微生物功能分區[3]，同時在折流運動過程中，廢水中的有機物和厭氧活性污泥充分接觸，使部分有機物得以去除[4]。同時，厭氧過程使廢水可生化性提高，為進一步的好氧處理提供了保障。為了深入了解厭氧微生物降解廢水中污染物的過程，本研究利用高通量測序技術，以采油廢水ABR反應池中的活性污泥為研究對象，分析其中細菌、真菌的群落特征，以期了解功能菌群的多樣性和分布情況。

1　材料與方法

1.1樣品的采集

ABR反應池1個，分7格，水力停留時間36 h，反應池尺寸為21 m×16.6 m×6.5 m，有效容積1 500 m3，設計流量1 000 m3/d，折流區上升區水力負荷1.44 m3/(m2·h)，折流口沖擊流速1.45 mm/s。采集的樣品包括采油廢水原水、ABR反應池中的厭氧活性污泥、以及厭氧池出水，來源于廣西北海潿洲島廢水處理終端?；钚晕勰嗖蓸狱c的位置從厭氧池第一格開始，每隔兩格采集污泥作為一個樣品，每一格的厭氧污泥樣品均為多位點多次混合樣，共得到3個樣品，分別編號A11，A12和A13。

1.2水樣檢測指標和分析方法

活性污泥基因組DNA的提取采用PowerSoilDNA Isolation Kit試劑盒，提取之前將活性污泥樣品進行離心分離，取0.25 g下層沉淀進行DNA的提取。DNA樣品的濃度通過Quawell Q5000超微量紫外分光光度計檢測[7]，同時用質量分數為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，并在Gel DocTMXR+成像儀上顯像。

1.3PCR擴增和產物純化

細菌采用25 μL的反應體系進行PCR擴增，包括Taq PCR Master Mix(2×)12.5 μL，上游引物515 F(帶Barcode)(10 μmol/L)1 μL，下游引物806R(帶Barcode)(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(10 μg/mL)1 μL，雙蒸水加至25 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環。最后72 ℃延伸5 min。

利用真菌引物ITS1(帶Barcode)和ITS2(帶Barcode)對基因組DNA進行擴增。PCR總反應體系為50 μL，包括 Taq PCR Master Mix(2×) 25 μL、DNA模板(10 μg/mL)1 μL、引物ITS1(10 μmol/L)2 μL、引物ITS2(10 μmol/L)2 μL，雙蒸水加至50 μL。反應條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環。最后72 ℃延伸10 min。

PCR產物使用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，根據PCR產物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。PCR產物純化后進行高通量測序。

2　結果與討論

2.1污水廠ABR工藝的處理效果

采油廢水原水和厭氧池出水的水質指標如表1所示。采油廢水原水經ABR厭氧池處理，COD的去除率達49.79%，可知ABR對于有機污染物有一定的處理效果。石油類質量濃度從91 mg/L下降到56 mg/L，表明將該工藝應用于石油開采行業具有良好前景。TOC和TN的值也明顯降低，下降率分別為74.12%和46.72%，說明ABR對于石油烴類和硝酸鹽的降解起作用。

表1　原水水質與厭氧池出水水質的比較　mg/L(pH除外)

2.2DNA提取、純化

DNA用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳后的電泳結果如圖1所示：基因組DNA大小整齊明亮，具有單一條帶，大小均大于1 kb，有稍許拖尾，說明可能含有少量蛋白質污染。DNA濃度檢測結果顯示OD 260/280的值在1.65～1.75之間，均小于1.8，說明確實存在蛋白質污染，經試劑盒純化后即可去除蛋白質污染。質量濃度在10 ng/μL左右，滿足后續PCR的要求。

2.3ABR活性污泥中細菌和真菌的PCR擴增

細菌的PCR擴增結果如圖2(a)所示：目的條帶大小291 bp，條帶單一明亮，無非特異性擴增和引物二聚體。真菌的PCR結果如圖2(b)所示：目的條帶大小250 bp，條帶單一且明亮，無明顯拖尾和非特異性擴增。

圖1　 ABR活性污泥中基因組DNA電泳圖

(a)

(b)

2.4采油廢水厭氧處理系統中細菌和真菌多樣性指數分析

通過高通量測序分析共獲得38118條高質量的16S rRNA基因有效序列和41147條真菌ITS序列?；钚晕勰嘀屑毦驼婢亩鄻有灾笖捣治鋈绫?所示。本文中OUT數目[8]是通過對微生物的標簽基因序列按照97%的相似度進行歸類，得出采油廢水ABR厭氧處理系統活性污泥中共有259個細菌OTU和268個真菌OTU。ACE和ChaoI分析表明，細菌的OTU豐度高于真菌。而Shannon指數分析[9]表明真菌群落多樣性高于細菌。

表2　ABR活性污泥中細菌和真菌的多樣性指數分析

2.5采油廢水ABR處理系統中細菌的群落結構

ABR活性污泥細菌序列分屬于28個門，在門水平上的分類如表3所示。其中變形菌門(Proteobacteria)數量最多，占總豐度的45.9%；其次是厚壁菌門(Firmicutes)占11.6%；另外還有擬桿菌門(Bacteroidetes)8.1%和熱袍菌門(Thermotogae)6.2%。從屬水平的群落組成上來看(表4)，分屬于180個屬，其中主要的是脫硫弧菌屬Desulfovibrio(2.3%)、Thermovirga(1.9%)、海桿菌屬Marinobacterium(1.8%)、硫微螺菌屬Thiomicrospira(0.7%)和噬甲基菌屬Methylophaga(0.7%)。其中海桿菌屬Marinobacterium參與多環芳烴降解過程，屬于石油烴協同降解細菌，可以有效降解石油烴類[10]。硫微螺菌屬Thiomicrospira中含有一些反硝化脫硫菌，是一種可以同步硝酸鹽還原和硫氧化能力的功能微生物菌群[11]，可應用于采油廢水的處理。噬甲基菌屬Methylophaga是以甲烷為底物的甲基氧化菌，主要利用核酮糖單磷酸途徑中的單碳糖作為碳源[12]。海桿菌屬Marinobacterium、噬甲基菌屬Methylophaga等大部分細菌屬于石油烴協同降解菌，因此ABR池內所發生的生化反應是產甲烷菌所介導的協同底物降解過程[13]。WANG Z L等人[14]發現油田中存在大量的Marinobacterium屬的細菌，這與本實驗結果中發現Marinobacterium屬的細菌吻合。脫硫弧菌屬中的硫酸鹽還原菌可以將硫酸根離子轉化為S2-，可以降解許多難降解的有機物質，在廢水處理中應用廣泛[15]。但同時，它會產生大量H2S氣體，使污水發黑發臭，活性污泥中大量含有硫酸鹽還原菌還會抑制產甲烷菌的活性[16]，腐蝕管道[17]，所以應該控制其在一個合理的水平，以保證厭氧活性污泥中的菌群平衡。DAHLE H等[18-19]從一個北海熱油井產出水中分離到1株Thermovirgalienii菌，可以降解蛋白質、單氨基酸和有機酸，說明Thermovirga菌屬對于采油廢水具有降解作用。

由于采油廢水水溫一般高于45 ℃，所以必然存在一些代謝速度快、處理效率高的嗜熱菌[20]。黎霞等[21]發現1株油藏嗜熱厭氧桿菌，可以發酵葡萄糖產生乙醇、乙酸等產物，經鑒定屬于Thermoanaerobacter屬，而本文研究結果表明Thermoanaerobacter屬占0.39%，在ABR池內穩定存在。此外，ABR厭氧池內還含有熱單孢菌屬(Thermomonas)[22]、Thermosipho、嗜熱互營菌屬Thermosyntropha、熱袍菌屬Thermotoga和Thermovirga等屬，這些菌的存在是厭氧池持續高溫卻能穩定運行的原因之一。

表3　細菌在門水平上的種群結構

表4　細菌在屬水平上的種群結構

2.6采油廢水ABR處理系統中真菌的群落結構

真菌的群落結構主要包括3個門類(表5)：Ascomycota、Basidiomycota和Zygomycota。其中Ascomycota門豐度最高，占總豐度的62.31%，其次是Basidiomycota為19.4%，豐度最少的是Zygomycota門，只占了3.73%。相比較進水、ABR和出水，發現微生物種類變化不大，只是數量上發生變化。Ascomycota菌隨著處理過程逐漸增多，Basidiomycota菌逐漸減少。這與之前王帥等[23]采用PCR-DGGE進行采油廢水真菌群落研究的結果一致，均得出Ascomycota門真菌的豐度最高，在整個污泥系統中起主要作用。JIANG S Y等[24]通過研究油頁巖礦中真菌的群落結構，發現Ascomycota和Basidiomycota在群落結構中豐度最高。Ascomycota之所以能在采油廢水處理中起主要作用，是因為它產生的胞外酶可以將纖維素轉化為纖維二糖，然后再分解為葡萄糖，最終將葡萄糖作為營養物質進行新陳代謝作用[25]。在Basidiomycota門中，一些屬的真菌不僅可以分解纖維素，還可以分解木質素[26]。這說明Ascomycota和Basidiomycota可以將石油中的某些組分作為營養物質進行新陳代謝，起到降解石油的作用，在含油環境中分布廣泛。

真菌在屬水平上的多樣性(表6)顯著高于細菌。除了unclassified外，主要有Aspergillus(曲霉屬)、Alternaria(鏈格孢屬)和Cryptococcus(隱球菌屬)這幾大類。相比較進水、ABR和出水，真菌的種類和數量分布均勻。CONTESINI F J等[27]認為Aspergillus可以作為生物催化劑應用于工業生產中；賈洪柏等[28]從大慶石油污染土壤中篩選到14株石油降解絲狀真菌，其中1株屬于曲霉屬Aspergillus，可以高效降解原油。Cryptococcus屬中的菌有一部分為產油脂微生物[29]，可以利用葡萄糖儲存油脂，目前作為一種新型能源被廣泛研究。

表5　真菌在門水平上的群落結構

表6　真菌在屬水平上的群落結構

3　結語

(1)基于進水和出水水質指標比較，發現COD，BOD5，TOC，TN等指標均有所降低，表明ABR厭氧處理系統對于采油廢水的生化處理具有很好的效果和穩定性。

(2)通過對ABR池內活性污泥的細菌和真菌的高通量測序，結果表明，ABR池內細菌主要來自于四個門類，分別是變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和熱袍菌門。這些菌大部分為石油烴協同降解細菌，因此ABR池內所發生的生化反應是產甲烷菌所介導的協同底物降解過程。其次還含有少量的硫酸鹽還原菌，導致硫化氫的產生。

(3)ABR池內真菌主要來自Ascomycota，Basidiomycota和Zygomycota門，在采油環境中均有發現。下一步研究希望通過了解ABR不同格室微生物的種群變化，得知ABR池內的微生物功能分區。

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Characteristics of Microbial Community in Anaerobic ABR System for Treating Oil-field Wastewater

LIU Yuhui1LIU Li2WANG Shuai1ZHANG Chunfang3TAN Zihang1XIE Qinglin2

(1.CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,GuilinUniversityofTechnologyGuilin,Guangxi541006)

Characteristics of microbial community in an anaerobic ABR system for treating oil-field wastewater are analyzed, in which polymerase chain reaction and high-throughput sequencing methods are used. The results show that the bacteria community in the ABR system is mainly composed of methanogens, including proteobacteria, firmicutes, bacteroidetes and thermotogae. These bacteria are commonly found in methanogenic hydrocarbon degrading environment, suggesting that they can be involved in the degradation of oil-field wastewater. In addition, fungal community including Ascomycota, Basidiomycota, and Zygomycota is abundant in the ABR system and bacteria and fungal in ABR tank can efficiently degradate components of oil-field wastewater.

oil-field wastewateranaerobic baffled reactormicrobial communityhigh-throughput sequencing methods

國家自然科學基金(51168012)，國家環境保護環境微生物利用與安全控制重點實驗室開放基金資助課題(SMARC2013D009)。

劉宇輝，女， 1992年生，碩士，研究方向水污染控制技術。

2016-03-21)