先天性膈疝相關基因的篩選

熊瑛，董煜，楊祖菁，古航

(1上海交通大學醫學院附屬新華醫院，上海200092；2上海第二軍醫大學附屬長海醫院)

?

先天性膈疝相關基因的篩選

熊瑛1，董煜1，楊祖菁1，古航2

(1上海交通大學醫學院附屬新華醫院，上海200092；2上海第二軍醫大學附屬長海醫院)

目的篩選先天性膈疝的相關基因。方法確診為先天性膈疝的11例胎兒，出生后使用Affymetrix Cytoscan 750K平臺微陣列進行分析。結果僅1例患兒檢出基因序列異常，包括268-kb的重復2q33.1、ARR [hg19] 2q33.1(201,303,201-201,571,143)，一個純合性缺失的8p11.22、ARR [hg19] 8p11.22(39,226,335-39,388,919)，以及12p13.33的部分損失、ARR [hg19] 12p13.33(1,262,947-1,375,084)。檢出5個基因發生序列重復，包括SPATS2L、KCTD18、Shugoshin樣蛋白2(SGOL2)、醛氧化酶1(AOX1)、AOX2P；2個基因發生純合缺失，為ADAM5、ADAM3A；1個基因為ERC1發生了雜合性的部分損失。該患兒母親為初產婦，合并妊娠期糖尿病，進行微陣列分析未檢出基因序列異常。結論篩選出先天性膈疝患兒8個基因發生序列異常，包括SPATS2L、KCTD18、Shugoshin樣蛋白2、醛氧化酶1、醛氧化酶2P、ADAM5、ADAM3A和ERC1。這些基因序列異?？赡苁窍忍煨噪躔薜臐撛诟蛩?。

膈疝；先天性膈疝；全基因組芯片技術；SPATS2L；KCTD18；Shugoshin樣蛋白2；醛氧化酶1；醛氧化酶2P；ADAM；ERC1

先天性膈疝(CDH)是一種可危及新生兒生命的先天性畸形，病死率高[1]。美國學者[2]報道CDH的發病率為1.93/10 000胎。CDH可分為三種類型：后外側膈疝(最常見)、前部型膈疝和中央橫膈疝(最少見)[3]?；純旱脑心冈趹言衅陂g大多已經明確診斷，并存在分離型的缺陷或非分離型的缺陷，也可能同時有其他類型的胎兒異常。CDH的病因仍然不明。遺傳因素在CDH發病中的作用漸漸得到明確[4]。Lan等[5]研究認為新發的拷貝數變異與CDH相關，并證實KCNA2、LMNA、CACNA1S、MYOG、HLX、LBR、AGT、GATA4、SOX7、HYLS1、FOXC1、FOXF2、PDGFA、FGF6、COL4A1、COL4A2、HOMER2、BNC1、BID和TBX1等基因可能參與膈膜的發育過程。Lan等[6]報道稱全基因組測序標識GATA6新發突變與CDH有關。Wat等[7]研究證實ZFPM2缺失可引起與不完全外顯性遺傳孤立膈肌缺損。至今國內尚無CDH相關遺傳基因的報道。為此，我們收集了CDH患兒的資料，嘗試篩選CDH的參與基因，現報告如下。

1　研究對象與方法

1.1研究對象2014年2月～2015年5月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院確診的CDH患兒11例。孕婦孕18～30周時通過超聲確診，新生兒出生后當天通過超聲檢查再次明確診斷。11例患兒中，1例(患兒1)實驗結果呈陽性，有異卵雙胞胎兄弟(患兒12)，另一胎出生時被確診為胎兒腸管擴張。納入患兒基本情況見表1。

表1　納入患兒基本情況

1.2CDH相關基因篩選方法孕母分娩后取臍血5 mL，使用Affymetrix Cytoscan 750K陣列平臺進行微陣列分析，陣列平臺包括多于550 000標記拷貝數和200 000基因型。

2　結果

僅患兒1被檢出基因序列異常，包括用268-kb的重復2q33.1、ARR[hg19]2q33.1(201,303,201-201,571,143)，一個純合性缺失的8p11.22、ARR[hg19]8p11.22(39,226,335-39,388,919)，以及12p13.33雜合性的一部分損失、ARR[hg19]12p13.33(1,262,947-1,375,084)。檢出5個基因發生序列重復，包括SPATS2L、KCTD18、Shugoshin樣蛋白2(SGOL2)、醛氧化酶1(AOX1)、醛氧化酶2P(AOX2P)；2個基因發生純合缺失，為ADAM5、ADAM3A；1個基因發生雜合性的部分損失，為ERC1。該患兒母親為初產婦，合并妊娠期糖尿病(GDM)，進行微陣列分析未檢出基因序列異常。

3　討論

CDH屬于非外傷性膈疝的一種，發病率為1/4 000～1/2 500，病死率高(約為35%)，最常見者為食管裂孔疝、胸腹裂孔疝、胸骨旁疝和膈缺如等。膈疝癥狀輕重不一，主要決定于疝入胸內的腹腔臟器容量、臟器功能障礙的程度和胸內壓力增加對呼吸循環機能障礙的程度。孕期可通過B超和MRI檢查幫助診斷，新生兒出生后可借助超聲檢查進一步明確診斷。目前國外已篩查出CDH部分相關基因，國內無報道。

染色體基因芯片分析(CMA)能在全基因組范圍內同時檢測很多種因染色體拷貝數變異而導致的疾病，已經逐步應用于多種疾病的臨床診斷和研究。目前，全基因組芯片技術漸漸用于兒科遺傳疾病篩查[8]，常見應用指征包括以下幾個方面：①不明原因的智力落后或發育遲緩；②非已知綜合征的多發畸形；③自閉癥譜系障礙及其他精神神經發育障礙。全基因組芯片技術在產前診斷中的應用包括：①產前超聲檢查發現胎兒結構異常者，如核型分析正常，則建議進一步行CMA檢查；②胎死宮內或死產需行遺傳學分析者；③胎兒核型分析結果無法確定染色體畸變情況者。本研究中應用的Affymetrix Cytoscan 750k芯片探針涵蓋復發性基因組病及常見微缺失/微重復綜合征區域，并覆蓋亞端粒區域；在探針覆蓋區域可檢測出小至幾十kb的拷貝數變異；能檢測出已知印記區域的純合區。

本研究納入了11例確診先天性膈疝的患兒，并通過全基因組芯片技術篩選出8個序列異常的基因，但這8個基因均無相關報道證實與膈疝發病有關。SPATS2L在體內的功能仍未明確，有學者[9]研究發現SPATS2L可能通過下調β2腎上腺素能受體水平而介導支氣管擴張劑反應。KCTD18被認為與不安腿綜合征(RLS，一種病因不明的綜合征，系指小腿深部于休息時出現難以忍受的不適，運動、按摩可暫時緩解的一種綜合征)有關[10]。SGOL2在哺乳動物卵母細胞的分離中有重要作用[11]。TRIPIN是著絲粒凝聚力的必要基因，是著絲粒錯誤檢查機制中的關鍵部分[12]。AOX1在健康的肝臟及肝硬化組織中表達，但較少在肝癌組織中表達，AOX1表達抑制被認為與腫瘤的發病有關。AOX2P未被證實與人類的疾病相關。ADAM基因可能與細胞間通信和附著力的調控有關。ADAM3A純合性缺失被認為在兒科高級別膠質瘤中發揮作用[13]，ADAM3A的過度表達可能還與結膜鱗狀細胞癌(CSCC)有關[14]。ADAM5已被證實在獼猴精卵結合中起引導作用，但未被證實與人類有關。ERC1為IκB激酶(IKK)復合體的一個必不可少的調節亞基，在炎癥反應、細胞凋亡、腫瘤發病和發展中起重要作用，ERC1還是蘭伯特-伊頓肌無力綜合征一個罕見的抗原[15]。

綜上所述，雖然本研究僅納入11例患兒，樣本量較小，但有1例患兒檢測出8個基因序列異常，包括SPATS2L、KCTD18、SGOL2、AOX1、AOX2P、ADAM5、ADAM3A和ERC1。鑒于上述基因與CDH發病的關系尚未得到證實，本研究結果有望為CDH發病原因的后續研究提供參考方向。

[1] Arrington CB,Bleyl SB,Nori M,et al.A family-based paradigm to identify candidate chromosomal regions for isolated congenital diaphragmatic hernia[J].Am J Med Genet A,2012,158A(12):3137-3147.

[2] Balayla J,Abenhaim HA.Incidence,predictors and outcomes of congenital diaphragmatic hernia: a population-based study of 32 million births in the United States.[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2014,27(14):1438-1444.

[3] Brady PD,Srisupundit K,Devriendt K,et al.Recent Developments in the Genetic Factors Underlying Congenital Diaphragmatic Hernia[J].Fetal Diagn Ther,2011,29(1):25-39.

[4] Wynn J,Yu L,Chung WK.Genetic causes of congenital diaphragmatic hernia[J].Semin Fetal Neonatal Med,2014,19(6):324-330.

[5] Lan Y,Julia W,Lijiang M,et al.De novo copy number variants are associated with congenital diaphragmatic hernia[J].J Med Genet,2012,49(10):650-659.

[6] Lan Y,Bennett JT,Julia W,et al.Whole exome sequencing identifies de novo mutations in GATA6 associated with congenital diaphragmatic hernia[J].J Med Genet,2014,51(3):197-202.

[7] Wat MJ,Danielle V,Jacob H,et al.Genomic alterations that contribute to the development of isolated and non-isolated congenital diaphragmatic hernia[J].J Med Genet,2011,48(5):299-307.

[8] Miller DT,Adam MP,Aradhya S,et al.Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies[J].Am J Hum Genet,2010,86(5):749-764.

[9] Himes BE,Jiang X,Hu R,et al.Genome-Wide Association Analysis in Asthma Subjects Identifies SPATS2L as a Novel Bronchodilator Response Gene[J].PLoS Genet,2012,8(7):656-662.

[10] Pichler I,Schwienbacher C,Zanon A,et al.Fine-mapping of restless legs locus 4 (RLS4) identifies a haplotype over the SPATS2L and KCTD18 genes[J].J Mol Neurosci,2013,49(3):600-605.

[11] Ahmed R,Magda W,Mickael P,et al.Sgol2 provides a regulatory platform that coordinates essential cell cycle processes during meiosis I in oocytes[J].Elife,2013,2(1629):e01133-e01133.

[12] Tanno Y,Kitajima TS,Honda T,et al.Phosphorylation of mammalian Sgo2 by Aurora B recruits PP2A and MCAK to centromeres[J].Genes Dev,2010,24(19):2169-2179.

[13] Barrow J,Adamowicz-Brice M,Cartmill M,et al.Homozygous loss of ADAM3A revealed by genome-wide analysis of pediatric high-grade glioma and diffuse intrinsic pontine gliomas[J].Neuro Oncol,2011,13(2):212-222.

[14] Laura A,Hind A,Alka M,et al.Identification of multiple DNA copy number alterations including frequent 8p11.22 amplification in conjunctival squamous cell carcinoma.[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2014,55(Suppl 252):1694-1706.

[15] Huijbers MG,Lipka AF,Potman M,et al.Antibodies to active zone protein ERC1 in Lambert-Eaton myasthenic syndrome[J].Hum Immunol,2013,74(7):849-851.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.031

R726.5

B

1002-266X(2016)19-0084-03

2015-12-01)