昆蟲蛋白提取物對泥鰍免疫增強效果的初步研究

■ 程逍妹 胡明 陳昌福

（1 武漢興物源生物科技有限公司，武漢 430040；2 華中農業大學，武漢 430070）

昆蟲蛋白提取物對泥鰍免疫增強效果的初步研究

■ 程逍妹1胡明2陳昌福2

（1 武漢興物源生物科技有限公司，武漢 430040；2 華中農業大學，武漢 430070）

為了證明昆蟲蛋白提取物對水產養殖動物是否具有免疫增強效果，本研究對泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）采用在飼料中定量添加昆蟲蛋白提取物的方法，研究了對泥鰍的免疫增強效果。旨在通過系統地研究昆蟲蛋白提取物對養殖泥鰍的免疫增強作用，獲得昆蟲蛋白提取物在泥鰍飼料中的適宜的添加量及應用程序等參數，為該產品科學應用奠定科學基礎。

表1 對照和試驗泥鰍的增重量1）

表2 對照和試驗泥鰍的餌料系數1）

表3 對照和試驗組泥鰍血清中溶菌酶活性和白細胞吞活性

表4 對照與試驗組泥鰍血清總蛋白和谷丙轉氨酶活性1）

1 實驗方法

1.1 試驗地點及泥鰍的飼養條件

本試驗在江蘇省射陽縣黃沙港鎮鹽城裕達水產養殖公司進行。將供試泥鰍放置于室內圓形玻璃鋼水族箱中進行飼養。用于本試驗的泥鰍全部來自裕達水產養殖公司的養殖池塘。在設置于室內的每個盛水500.0L的水族箱中，飼養平均體長10.4cm的400尾以上的泥鰍。試驗期間水溫變化在（25±4）℃，光照為人工光照和自然光照。每天上午9∶00和下午18∶00各投1次鹽城裕達飼料有限公司生產的泥鰍專用飼料，供試泥鰍被預備試驗飼養7d，待供試泥鰍完全適應室內飼養環境后，選擇身體無外傷、健康活潑的泥鰍進行如下飼養效果的試驗。

1.2 供試昆蟲蛋白提取物

用于本研究的昆蟲蛋白提取物，由武漢興物源生物科技有限公司提供。

1.3 試驗設計

表5 活菌攻毒后泥鰍的死亡率和免疫保護率

選擇沒有外傷而游動正常的泥鰍，隨機分別投放于水族箱中，每個水族箱內放養400尾泥鰍。每組免疫增強劑采用6個水族箱，每個劑量設定2個重復，在共18個水族箱內完成3組泥鰍的飼養試驗。在泥鰍的飼料中添加昆蟲蛋白提取物的劑量設定為0 kg/t（昆蟲對照組，“t”表示噸，下同）、50 kg/t（昆蟲I組）和100kg/t（昆蟲Ⅱ組）。

飼料中昆蟲蛋白提取物的添加方法是，將鹽城裕達飼料有限公司生產的泥鰍專用飼料與一定比例的昆蟲蛋白提取物均勻混合后，置于陰涼通風處晾干。

按照預備飼料飼養時的飼料投喂程序，投餌量以使供試泥鰍達到飽足并有少量剩余為準。對照組所用飼料中除沒有添加昆蟲蛋白提取物等物質之外，飼料中其它營養成分均沒有改變。試驗程序是連續投喂40d。由于泥鰍外觀上難以區分雌雄。因此，在本研究中不區分試驗動物的性別。

1.4 吞噬原的制備

將金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）接種在液體肉湯培養基中，37℃下培養48h后，離心集菌，在菌液中加入濃度為0.5%的福爾馬林，37℃下滅活24h，用滅菌生理鹽水清洗3次，并將其濃度調整至1.0×108cells/mL，即為福爾馬林滅活的S.aureus菌體（formalin killed S.aureus，F-SA），用作檢測白細胞吞噬活性的吞噬菌體。

1.5 采血

于投喂添加昆蟲蛋白提取物飼料結束后的第2d，從各試驗個對照組中分別隨機撈取30尾泥鰍（每個平行試驗水簇箱中各撈取15尾，以下采用相同的平均獲取樣品的方法），從泥鰍的尾主動脈采血。將每5尾泥鰍的血液混合為一個樣品后，將血液分為2份，其中1份以肝素抗凝，制備成抗凝血，供檢測白細胞吞噬活性；將另一份血液首先在室溫下靜置1h待其凝固，再置于4℃的冰箱保持4h后，于4℃條件下以4,000 r/min離心10min，收集上層血清，保存在4℃冰箱中，備用。

對采血后的泥鰍進行解剖，觀察試驗與對照組泥鰍臟器形態與顏色等方面的異同。判斷不多試驗組與對照組是否對魚體臟器產生影響。

1.6 溶菌酶活性的測定

用0.067mol/L的磷酸緩沖液 （PBS,pH6.4）將溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）配制成0.2mg/mL 的菌懸液。每個樣品取3.0 mL菌懸液，吸取血清40.0μL加入到菌懸液中，混勻后，立刻在540nm下測定A。值。然后在28℃水浴中溫育30min，取出后置于4℃冰浴中終止反應，再測定A值。按公式計算溶菌酶的活性：U=（A。- A）/ A。

1.7 白細胞吞噬活性的測定

在0.2mL抗凝血中加入0.1mL F-SA，搖勻，在28℃的恒溫水浴鍋中孵育45min，每隔10min搖動1次。用吸管吸取血細胞涂片，每個樣品涂5張，用甲醇固定10min，Giemsa染色液染1h，水洗風干后，鏡檢，并依下式計算白細胞吞噬百分比（phagocytic percentage，PP）和吞噬指數（phagocytic index，PI）。

1.8 血清中補體C3、C4含量的測定

根據待測樣品（含校準液）將反應劑與抗體液按每1.0mL反應劑加入50.0μL抗體液的比例配制，配好的工作液當日用完。于干凈離心管中按照試劑與樣品比例為200∶1量加入5.0μL蒸餾水和1,000.0μL試劑，作為空白管，同時按照同樣比例加入5.0μL的校準液或樣品，混勻，37℃水浴10 min，用透射比濁法在752型紫外分光光度計340 nm波長處讀取測定管和標準管的光密度值（A），空白管進行儀器調零，標準管繪制標準曲線，以計算補體 C3 和 C4 的含量。

1.9 血清中谷丙轉氨酶活性的測定

采用谷丙轉氨酶試劑盒（上?？菩郎锛夹g研究所產品）測定。

1.10 血清中總蛋白含量的測定

采用血清總蛋白試劑盒（上?？菩郎锛夹g研究所產品）測定。

1.11 攻毒試驗

對于供試和對照泥鰍的攻毒方式采取注射的方式進行，取人工培養的嗜水氣單胞菌，制備成107cfu/mL的菌液濃度后，對每尾供試泥鰍的腹腔注射0.2mL后，各實驗組均注射300尾，3個對照組各注射100尾，合計300尾。放回水族箱繼續飼養觀察患病與死亡狀況。

將供試泥鰍放回水族箱中繼續飼養時，采取充氣維持水體中有足夠的氧氣。每天投喂2次未添加任何免疫增強劑的顆粒飼料，并記錄魚體活動狀態和死亡情況。最后按照如下公式計算試驗魚的相對免疫保護率（RPS）。相對免疫保護率=[1－（免疫組死亡率/對照組死亡率）]×100%

1.12 解剖觀察及臟器測量

通過對每組采血后的各20尾泥鰍進行解剖，肉眼觀察試驗與對照組泥鰍臟器的異同，并對分離的器官和組織分別稱重，用以比較試驗與對照組泥鰍的機體指標異同。

1.13 誘食效果的判定

在預定連續投喂的40d中，每天統計供試泥鰍的攝食量，將對照組泥鰍的餌料系數作為1。評價昆蟲蛋白提取物在飼料中的不同添加量對泥鰍攝食量的影響，判斷昆蟲蛋白提取物是否具有誘導泥鰍攝食的效果。

1.14 促生長效果的判定

在預定連續投喂40d結束后，將尚沒有用于采樣和攻毒的全部的泥鰍撈起來稱重，根據統計泥鰍的攝食量，計算餌料系數，將對照水族箱中飼養的泥鰍的餌料系數作為1。評價昆蟲蛋白提取物在飼料中的不同添加量促進泥鰍的攝食效果，判斷昆蟲蛋白提取物是否具有促進攝食的效果。

2 結果

2.1 昆蟲蛋白提取物等對泥鰍生長速度的影響

試驗期間對照和各試驗組泥鰍的增重量測定結果如表1所示。首先，投喂昆蟲蛋白提取物的試驗組泥鰍的增重量均顯著地高于對照組的增重量（t測驗，P＜0.05），而昆蟲蛋白提取物的不同添加劑量組之間增重量并沒有出現顯著的差異（t測驗，P＞0.05）。

2.2 昆蟲蛋白提取物等對泥鰍的誘食與促生長效果

根據在試驗期間（只計算40d內的投喂時間）對各對照和試驗組泥鰍的增重量，以及40d的總投喂飼料數量，計算出來的餌料系數結果如表2所示。首先，投喂昆蟲蛋白提取物試驗組泥鰍的餌料系數均顯著地低于對照組的餌料系數（t測驗，P＜0.05），而昆蟲蛋白提取物的不同添加劑量組之間雖然餌料系數有一點差異，但是并沒有出現顯著的差異（t測驗，P＞0.05）。

將對照組餌料系數作為1進行比較，所有試驗組的餌料系數均低于1，說明昆蟲蛋白提取物等對泥鰍的誘食和促進生長的作用是比較明顯的。

2.3 溶菌酶活性和白細胞吞噬活性的變化

投喂添加昆蟲蛋白提取物的飼料后，對照和試驗組泥鰍的血清溶菌酶活性和白細胞吞噬活性的測定結果如表3所示。如表3所示，投喂昆蟲蛋白提取物試驗組泥鰍血清中的溶菌酶活性顯著高于未添加任何物質的對照組（t測驗，P＜0.05）。白細胞吞噬活性的測定結果表明，投喂昆蟲蛋白提取物的試驗組血液中白細胞的PP和PI均極顯著地高于對照組（t測驗，P＜0.01），而投喂昆蟲蛋白提取物的試驗組之間，泥鰍血液中白細胞的吞噬活性未出現顯著性差異（t測驗，P＞0.05）。

2.4 泥鰍血清中補體C3、C4、總蛋白和谷丙轉氨酶活性的變化

供試泥鰍的血清中補體C3、C4、總蛋白含量和谷丙轉氨酶活性測定結果如表4 所示。

從表4所示結果可以看出，投喂昆蟲蛋白提取物的試驗組泥鰍血清中補體C3、C4的活性均顯著高于未添加任何物質的對照組（t測驗，P＜0.05）。但是，試驗組魚體的血清中總蛋白含量和谷丙轉氨酶活性含量有所提高，而對照與試驗組泥鰍血清中總蛋白含量和谷丙轉氨酶活性并未出現顯著性差別（t測驗，P＞0.05）。值得注意的是，對谷丙轉氨酶活性的測定結果表明，在飼料中添加昆蟲蛋白提取物等可以降低魚體血清中谷丙轉氨酶的活性，但是，試驗與對照組泥鰍之間未出現顯著性差異（t測驗，P＞0.05）。

此外，對于采血后泥鰍解剖觀察的結果證明，試驗組與對照組泥鰍的臟器均未出現明顯的區別。

2.5 攻毒后的存活率

采用注射嗜水氣單胞菌的方法，對試驗和對照泥鰍經活菌攻毒后，各組的死亡情況如表5所示。從表5可以看出，投喂蟲蛋白提取物的試驗組泥鰍對接種的嗜水氣單胞菌具有一定的免疫保護力（RPS），而在飼料中添加昆蟲蛋白提取物的試驗組泥鰍死亡率明顯的低于對照組。但是，各個添加昆蟲蛋白提取物的試驗組泥鰍之間的RPS，則未出現明顯的不同，而是具有大致相同的RPS。

3 討論

在本研究中，添加昆蟲蛋白提取物的試驗組泥鰍的生長狀況顯著的優于對照組，但是不同添加量的試驗組之間卻沒有出現顯著差別，這種結果表明在飼料中添加昆蟲蛋白提取物有一定的促進泥鰍生長的作用，而且當其添加量在500～100kg/t之間，其飼養效果沒有出現顯著性差異。

對泥鰍投喂昆蟲蛋白提取物后，供試泥鰍的白細胞吞噬活性增強、血清中溶菌酶活性和補體C3、C4成分活性上升和經活菌攻毒后的死亡率下降，說明投喂昆蟲蛋白提取物能提高泥鰍的非特異性和特異性免疫應答水平。即昆蟲蛋白提取物對于泥鰍的免疫系統具有一定的激活作用。

通過計算試驗組與對照組的餌料系數，認為昆蟲蛋白提取物對泥鰍具有一定的誘食和促進生長的效果。但是，根據江蘇省鹽城裕達水產養殖公司2015年在池塘中養殖的泥鰍計算的餌料系數僅為1.53左右，說明我們在實驗室飼養泥鰍，無論試驗魚對照組，餌料系數均是偏高的。其原因尚值得分析。(參考文獻略)