黃連解毒湯等對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤酸性微環境p H值的影響*

張翔云 周華妙郭 勇

（浙江中醫藥大學第一臨床醫學院·杭州 310053）

黃連解毒湯等對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤酸性微環境p H值的影響*

張翔云 周華妙??郭 勇

（浙江中醫藥大學第一臨床醫學院·杭州 310053）

目的：研究中醫藥對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤微環境pH值的影響。方法：測量并比較乳腺癌荷瘤小鼠單純荷瘤組與中藥干預組的腫瘤上清液pH值，分析結果并探討中醫藥對于乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤酸性微環境pH值的影響。結果：黃連解毒湯組乳腺癌腫瘤組織pH值（7.0400±0.8732）與單純荷瘤組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.8625±0.5620）相比上升，統計學差異顯著（p＜0.05）；四君子湯組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.9525±0.2217）與單純荷瘤組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.8625±0.5620）相比上升，統計學差異顯著（p＜0.05）；其中黃連解毒湯組與單純荷瘤組之間統計學差異非常顯著（p＜0.01）。結論：黃連解毒湯、四君子湯加減可以明顯增高乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤組織的pH值，而這種調節作用的產生機制及對于腫瘤侵襲轉移能力的具體影響仍需要對后續試驗結果進行分析以補充。

乳腺癌 中醫藥 小鼠 腫瘤酸性微環境 pH值

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率呈現上升趨勢，已成為女性惡性腫瘤發病率之首，究其最常見的死亡原因，并非原發腫瘤，而是轉移性疾病。已有大量研究發現，乳腺癌腫瘤微環境和腫瘤血管生成與乳腺癌的侵襲和轉移關系密切。

轉移被認為是腫瘤與細胞基質相互作用的多階段過程，這些過程使得腫瘤具有新生血管的能力，使腫瘤細胞更容易遷移和侵襲到轉移部位。一旦腫瘤新生物表現出侵襲性，就能夠通過淋巴管和(或)血管播散，包括借助于腫瘤刺激淋巴管生成和血管生產，或者改變局部的微環境而播散[1]。

腫瘤微環境(tumor microenvironment)的思想最早可見于100多年前Paget提出的“種子-土壤”學說。狹義的腫瘤微環境的定義是腫瘤組織中的各種細胞和結構構成腫瘤微環境。但廣義來說，腫瘤細胞所處的外部環境，或腫瘤組織所處的外部環境也可理解為腫瘤微環境[2]。具體是指腫瘤在生長過程中，與腫瘤的發生、發展和轉移密不可分的局部穩態環境[3]。

研究證實，惡性腫瘤組織周圍的pH值在6.8～6.0之間，更有低至5.8。而正常組織周圍的pH值一般保持在7.35～7.45之間［4-6］。腫瘤微環境酸性的形成，一方面是由于其高效率的糖酵解生成的乳酸所致[7-12]，即主要是無氧代謝決定了腫瘤的酸度。另一方面，胞內產生的CO2通過彌散作用排到胞外，由于腫瘤組織細胞缺氧，激活缺氧誘導因子1(hypoxiainducible factor1，HIF-1)誘導腫瘤細胞高表達CA-Ⅸ，催化CO2和H2O反應生成碳酸[13]。這就提示，乳酸和碳酸是腫瘤細胞外酸性微環境的主要來源，以及腫瘤酸性微環境的形成原因主要與腫瘤細胞的糖酵解代謝和缺氧有關[14]。腫瘤酸性微環境對腫瘤細胞生長轉移的影響主要是：①改變腫瘤細胞的生物學活性[15]，從腫瘤發病機制到治療各個環節的研究領域都與腫瘤酸性微環境有關；②通過上調VEGF等基因表達，促進腫瘤新生血管生成[16]?？梢?，腫瘤細胞的生長轉移與腫瘤酸性微環境密切相關。

已有許多實驗證明酸性微環境對腫瘤的生長和轉移有很大影響[17-20]，本次研究意在從中醫藥調整乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤微環境pH值的角度出發，觀察黃連解毒湯、四君子湯加減等中醫方藥對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤微環境pH值的調整作用，進而為中醫藥對腫瘤轉移侵襲能力等影響做好研究準備。

1 材料與方法

1.1 材料

Hanks緩沖液（吉諾），精細眼科剪、精細組織鑷（美國瑞德）、delta320ph計（梅特勒-托利多儀器有限公司）等。

1.2 活體腫瘤制備腫瘤上清液

6～8周齡Balb/c小鼠按區組隨機分為空白對照組、單純荷瘤組、黃連解毒湯組、四君子湯組四組，并于單純荷瘤組、黃連解毒湯組、四君子湯組小鼠乳腺脂肪墊接種乳腺癌4T1高轉移細胞，接種后24h給藥：單純荷瘤組：以飲用水灌胃，每日0.4ml/只；黃連解毒湯組：以黃連解毒湯灌胃，每日0.4ml/只；四君子湯組：以四君子湯加味灌胃，每組0.4ml/只。35天后處死取出瘤體。

每組處死4只小鼠，空白對照組取乳腺脂肪墊組織，單純荷瘤組、黃連解毒湯組、四君子湯組取出瘤體，以眼科剪充分剪碎，分別放入Hanks緩沖液中（300mg/ml）,混勻后以300G室溫離心10min。吸取上清液，過濾后得到腫瘤組織上清。

1.3 檢測腫瘤組織上清pH值

檢測方法：

以旋轉的方式把PH電極從保存液中拔出，使用蒸餾水清洗并拭干-校正-清洗并拭干，后分別浸入空白對照組、單純荷瘤組、黃連解毒湯組、四君子湯組四組樣本中進行測量、讀數（每次測量后需重新校正清洗）。

每支樣本重復測量三次，取三次結果的平均值。

1.4 統計方法

結果采用SPSS17.0軟件包統計。計量資料數據用均數±標準差（）表示。采用方差分析，以P＜0.05為差異顯著、P＜0.01為差異非常顯著的檢驗標準。

2 結果

pH值 均值標準差1#2#3#4#空白對照組7.347.377.367.417.37000.2944單純荷瘤組6.916.916.806.836.86250.5620黃連解毒湯組6.987.106.927.097.04000.8732四君子湯組6.966.966.976.926.95250.2217

各組間組織pH值比較結果如下：（Hanks緩沖液pH值測出為7.246）

如圖，空白對照組乳腺脂肪墊組織pH值為7.3700±0.2944，與相關文獻所載正常組織周圍pH值（7.35～7.45）基本相符。黃連解毒湯組乳腺癌腫瘤組織pH值（7.0400±0.8732）與單純荷瘤組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.8625±0.5620）相比上升，統計學差異顯著（p＜0.05）；四君子湯組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.9525±0.2217）與單純荷瘤組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.8625±0.5620）相比上升，統計學差異顯著（p＜0.05）；其中黃連解毒湯組與單純荷瘤組之間統計學差異非常顯著（p＜0.01）。

3 小結

腫瘤酸性微環境是腫瘤細胞進行缺氧和有氧糖酵解代謝產生的乳酸和缺氧所致的HIF-1激活相關酶催化CO2變成碳酸在胞內聚集，迫使腫瘤細胞上調膜離子交換體以調節形成適應腫瘤生長轉移的胞內呈堿性和胞外呈酸性的微環境,抗腫瘤細胞生長轉移的關鍵則在于調節膜離子交換體、調整酸性微環境和調控營養物質[21]。通過分析本次研究結果，我們發現黃連解毒湯、四君子湯可以明顯升高乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤組織的pH值，而這種調節作用的發生機制及對于腫瘤侵襲轉移能力的具體影響仍需要對后續試驗結果進行分析以補充。

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（2016-08-10 收稿）

* 課題：基于TAMS與酸性微環境觀察梳肝健脾法治療小鼠乳腺癌腫瘤轉移的實驗研究

** 通訊作者