MAPKs阻滯劑U0126對創傷性腦損傷大鼠學習記憶功能的影響及機制探討

劉興宇，甄艷鳳，崔建忠，高俊玲

(1唐山市工人醫院，河北唐山063000；2華北理工大學基礎醫學院)

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MAPKs阻滯劑U0126對創傷性腦損傷大鼠學習記憶功能的影響及機制探討

劉興宇1，甄艷鳳1，崔建忠1，高俊玲2

(1唐山市工人醫院，河北唐山063000；2華北理工大學基礎醫學院)

目的觀察絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)阻滯劑U0126對創傷性腦損傷 (TBI)大鼠學習記憶功能的影響，并探討其機制。方法將313只成年雄性SD大鼠隨機分為假手術組52只、模型組87只、DMSO組87只、U0126組87只，除假手術組外其余各組制備大鼠彌漫性腦創傷模型。U0126組將0.1 mg/kg U0126以0.1 mmol/L的PBS稀釋至300 μL，于造模前30 min尾靜脈注射。DMSO組同時點尾靜脈注射相同含量DMSO稀釋溶液，假手術組和模型組同時點尾靜脈注射生理鹽水300 μL。造模30 min、3 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d取各組大鼠各5只(假手術組3只)，采用TUNEL法觀察各組海馬組織神經細胞凋亡情況。造模30 min、3 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d取各組大鼠各6只(假手術組3只)，采用Western blot法檢測各組海馬組織磷酸化細胞外信號調節激酶1/2(p-ERK1/2)蛋白表達。造模14、16、18、21 d取各組大鼠各10只，采用Morris水迷宮實驗觀察大鼠空間學習記憶能力。結果造模48、72 h時，U0126組海馬組織神經細胞凋亡數少于DMSO組、模型組，P均<0.05；造模24、48、72 h時，U0126組、DMSO組、模型組海馬組織神經細胞凋亡數均多于假手術組，P均<0.05；造模48、72 h時，U0126組海馬組織p-ERK1/2蛋白相對表達量低于模型組、DMSO組，P均<0.05；造模12、24、48、72 h時，U0126組、DMSO組、模型組海馬組織p-ERK1/2蛋白相對表達量均短于假手術組，P均<0.05；造模16、18、21 d時U0126組大鼠潛伏期均短于DMSO組、模型組，P均<0.05；造模14、16、18、21 d時U0126組、DMSO組、模型組大鼠潛伏期均長于假手術組，P均<0.05。相關性分析結果顯示，海馬區神經細胞凋亡數與p-ERK1/2表達呈正相關(r=0.468,P=0.002)。結論U0126可抑制TBI大鼠海馬神經細胞凋亡，提高大鼠的學習記憶能力，可能與降低海馬組織中p-ERK1/2表達有關。

創傷性腦損傷；學習記憶功能；絲裂原活化蛋白激酶阻滯劑；磷酸化細胞外信號調節激酶1/2

創傷性腦損傷 (TBI) 發生率高，后遺癥多，是創傷醫學、急救醫學的重要研究課題[1，2]。其中學習記憶能力的損害是 TBI最持久和最嚴重的癥狀之一，目前尚無有效治療方法。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞應激和損傷反應的主要信號通路,可將胞外刺激信號傳遞至胞核[3]。細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)是MAPKs的重要成員，磷酸化后可被激活。2014年1月～2015年11月，我們觀察了MAPKs阻滯劑U0126對TBI大鼠學習記憶功能的影響，并探討其可能的作用機制?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1模型制作及干預將313只健康成年清潔級雄性SD大鼠[體質量300～350 g，購自北京維通利華公司，許可證號：SCXK(京)2002-003]隨機分為假手術組52只、模型組87只、DMSO組87只、U0126組87只，除假手術組外其余各組參照[1]制備大鼠彌漫性腦創傷模型：乙醚麻醉大鼠，用450 g、直徑18 mm的銅錘自2 m高度垂直落下撞擊置于大鼠冠狀縫與矢狀縫正中的不銹鋼墊(直徑10 mm厚3 mm)，造成大鼠彌漫性腦創傷模型，假手術組僅麻醉大鼠，頭皮切開、縫合。U0126組將0.1 mg/kg U0126(美國，Promega公司，藥物批號：粵衛藥準字第616021號)溶解于PBS中，并以0.1 mmol/L的PBS稀釋為總量300 μL，于造模前 30 min自尾靜脈注射。DMSO組同時點尾靜脈注射相同含量DMSO稀釋溶液，假手術組和模型組同時點尾靜脈注射生理鹽水300 μL。

1.2大鼠海馬組織神經細胞凋亡情況觀察采用TUNEL法。造模30 min、3 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d取各組大鼠各5只(假手術組3只)，以35 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉;仰臥位固定后開胸暴露心臟，左心室穿刺入升主動脈，用室溫肝素生理鹽水沖洗內臟血液10 min;4%多聚甲醛250 mL經心灌流，固定30～40 min；待大鼠全身僵硬后斷頭取腦組織，固定、石蠟包埋、切片，TUNEL染色后鏡下觀察，實驗重復3次。均設陰性對照，以PBS代替一抗。所有操作嚴格按照德國BM公司說明書操作。TUNEL陽性細胞呈藍紫色，細胞核著色。TUNEL陽性細胞陽性強弱用Image Proplus 6.0數碼醫學圖像分析系統定量分析測定，以積分光密度(IOD)值來表示大鼠海馬區神經細胞數。

1.3大鼠海馬組織p-ERK1/2蛋白檢測采用Western blot法。造模30 min、3 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d取各組大鼠各6只(假手術組3只)，處死大鼠后取海馬組織;4 ℃PBS充分洗滌，加入3倍體積的4 ℃全細胞裂解液，冰浴中勻漿；4 ℃離心5 min，12 000 r/min，取上清。轉膜、封閉后加入p-ERK1/2兔抗鼠單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，DAB顯色，實驗重復3次。用圖像分析儀測定各組p-ERK1/2蛋白條帶的光密度,進行半定量分析。

1.4大鼠學習記憶能力檢測采用Morris水迷宮實驗。造模14、16、18、21 d,取10只各組大鼠進行Morris水迷宮實驗。將安全島隨機置于水迷宮四個象限(N、S、E、W)中的任一象限，加水(奶粉沖呈乳白色)至高過安全島10 mm，水溫22～25 ℃，由攝象機及計算機自動跟蹤、拍攝和統計大鼠分別由其他3個象限入水后尋找到安全島的時間(潛伏期)。如在180 s內未找到安全島，則潛伏期值記為180 s。水迷宮視頻分析系統由中國醫學科學院藥物研究所提供。實驗重復3次，取平均值。以搜索安全島潛伏期表示其學習記憶能力。

2　結果

2.1各組海馬組織神經細胞凋亡情況比較造模后不同時點各組海馬組織神經細胞凋亡情況比較見表1。

表1　造模后不同時點各組海馬組織神經細胞凋亡情況比較±s)

注：與模型組和DMSO組比較,#P<0.05；與假手術組比較，*P<0.05。

2.2各組海馬組織p-ERK1/2蛋白相對表達量比較造模后不同時點各組海馬組織p-ERK1/2蛋白相對表達量比較見表2。

2.3各組大鼠學習記憶能力比較造模后不同時點各組大鼠學習記憶能力比較見表3。

2.4海馬區神經細胞凋亡與p-ERK1/2表達的關系相關性分析結果顯示，海馬區神經細胞凋亡情況與p-ERK1/2相關性呈正相關(r=0.468,P=0.002)。

表2　造模后不同時點各組海馬組織p-ERK1/2蛋白相對表達量

注：與模型組、DMSO組比較,#P<0.05；與假手術組比較，*P<0.05。

表3　造模14、16、18、21 d各組大鼠學習記憶能力比較

注：與DMSO組、模型組比較,﹟P<0.05; 與假手術組比較,*P<0.01。

3　討論

MAPKs是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞應激和損傷反應的主要信號通路,可將胞外刺激信號傳遞至胞核。細胞外信號調節激酶ERK是MAPKs重要成員[3]。研究顯示，腦缺血損傷后，激活的ERK1/2對神經元具有保護作用[4]，但有更多文獻報道與之相反。Mori等[5]研究顯示，腦損傷后ERK1/2的激活與細胞凋亡密切相關，其特異性抑制劑可明顯減少神經細胞死亡數目，減輕創傷后的腦損傷面積，并改善了損傷后的神經功能。Clausen等[6]在閉合性腦損傷的模型中，應用共聚焦顯微鏡觀測到損傷中心及周邊區活化的ERK1/2與TUNEL陽性細胞共同定位，為ERK通路活化可導致細胞凋亡提供最為直觀的證據。本研究發現，海馬區神經細胞凋亡與p-ERK1/2表達呈正相關。這一方面反應了創傷后ERK1/2的激活可加重腦損傷的病理過程，同時也提示ERK通路可能是腦損傷后治療的新靶點。

U0126是高選擇性和高效的MAPKs阻滯劑，可通過直接抑制MEK活性而阻滯其下游分子ERK1 /2的磷酸化[7]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組創傷后30 min海馬區p-ERK1/2相對表達量升高，且隨創傷時間增加其相對表達量逐漸升高，于創傷后24 h達到峰值，U0126組p-ERK1/2相對表達量低于模型組，可能原因為MAPKs通路被阻斷。TUNEL檢測結果顯示,隨著創傷時間延長，海馬區神經細胞凋亡數增多；而U0126組較模型組海馬區細胞凋亡數明顯減少；說明腦損傷后， ERK的活化增加，導致了神經細胞凋亡的增多，加重了腦損傷，與以往文獻報道一致。

海馬作為學習記憶信息通路的必要結構，在空間學習記憶的鞏固方面發揮著重要作用[8]。海馬神經細胞凋亡可能是導致TBI后學習記憶功能障礙、特別是空間學習記憶能力下降的機制之一。p-ERK參與認知功能，如學習與記憶形成[9～12]。最新研究證實，Ras/ERK通路參與了人類的認知過程。Silva等[13]利用基因工程技術，在研究Ⅰ型神經纖維母細胞瘤與精神發育遲緩的關系中發現，學習功能的降低與海馬Ras/ERK信號通路的缺損密切相關。目前臨床普遍認為ERK通路參與了突觸可塑性變化，進而影響了大腦信息存儲及記憶鞏固等過程。Mazzucchelli等[14]研究發現,ERK1基因敲除小鼠長時記憶功能顯著增強,而短時記憶力保持。Zhang等[15]研究發現,經過氣味休克訓練1 h的正常幼鼠ERK1和ERK2磷酸化水平顯著增強，從而激活ERK通路，而MAPK/ERK抑制劑PD98059可明顯降低ERK磷酸化水平，進而影響大鼠的學習記憶功能。

本研究中，U0126可減少TBI大鼠海馬神經細胞凋亡數，提高大鼠的學習記憶能力，可能與降低海馬組織中p-ERK1/2表達有關。但ERK通路激活后，通過作用于哪些因子發揮腦保護作用還有待進一步研究。

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Protective effects of MAPKs inhibitor U0126 on learning and memory function of rats with traumatic brain injury

LIUXingyu1,ZHENYanfeng,CUIJianzhong,GAOJunling

(1TangshanGongrenHospital,Tangshan063000,China)

ObjectiveTo observe the protection of mitogen-activated protein kinase (MAPK) inhibitor U0126 on learning and memory function of rats with traumatic brain injury (TBI) and to investigate its mechanism. MethodsMale Sprague-Dawley rats (n=313) were randomly divided into four groups: the sham operation group (n=52), TBI group (n=87), DMSO group (n=87) and U0126 group (n=87). Except the TBI group, diffused brain injury rat models were established in the other groups. In the U0126 group, 0.l mg/kg U0126 was dissolved in PBS, and 0.1 mM PBS was diluted to the total amount of 300 μL, then, this solution was injected into the rats 30 min before modeling by caudal vein. Rats in the DMSO group were injected with the same amount of DMSO dilute solution, and rats in the sham operation group and TBI group were injected with 300 μL normal saline. The in situ apoptosis assay was used to observe the nerve apoptosis of hippocampus of each group at 30 min, 3 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h and 7 d after modeling (n=5 respectively, except for sham operation groupn=3). The phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2 (p-ERK1/2) protein was detected in each group by Western blotting at 30 min, 3 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h and 7 d after modeling (n=6 respectively, except for sham operation groupn=3). The learning and memory function was evaluated by Morris water maze on the 14th, 16th, 18th and 21rd day after modeling in each group (eachn=10). ResultsThe number of nerve cell apoptosis of hippocampus in the U0126 group was lower than that of DMSO and TBI groups at 48 h and 72 h after modeling, allP<0.05; the number of nerve cell apoptosis of hippocampus in the U0126, DMSO and TBI groups was all higher than that of the sham operation group at 24 h, 48 h and 72 h, allP<0.05; the relative expression of p-ERK1/2 in hippocampus of the U0126 group was lower than that of the DMSOand TBL groups at 48 h and 72 h after modeling, allP<0.05; the relative expression of p-ERK1/2 in hippocampus of the U0126、DMSO and TBI groups was all higler than that of the sham group at 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after modeling, allP<0.05; the incubation period in the U0126 group was shorter than that of the DMSO and TBI groups on the 16th, 18th and 21rd day, allP<0.05; the incubation period in the U0126, DMSO and TBI groups was longer than that of the sham operation group on the 16th, 18th and 21rd day, allP<0.05; correlation analysis showed that the number of nerve cell apoptosis in hippocampus was positively correlated with p-ERK1/2 expression (r=0.468,P=0.002). ConclusionU0126 can inhibit neuronal apoptosis in hippocampus and improve learning and memory in rats, which may be correlated with the decreased p-ERK1/2 expression.

traumatic brain injury; learning and memory function; mitogen-activated protein kinase inhibitor; phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2

河北省自然科學基金資助項目(H2012401071)；河北省引進留學人員資助項目(2012-02)。

劉興宇(1980-)，男，碩士，主治醫師，研究方向為腦創傷機制。E-mail: 15931588358@126.com

簡介：高俊玲(1960-)，女，博士，教授，研究方向為腦損傷與腦保護單位。E-mail: junlinggao@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.007

R651.1

A

1002-266X(2016)18-0021-04

2015-11-08)