骨髓間充質干細胞聯合EPO對急性脊髓損傷大鼠神經運動功能的影響及機制探討

余化龍，何寧，劉志剛，熊敏

(湖北醫藥學院附屬東風醫院,湖北十堰442008)

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骨髓間充質干細胞聯合EPO對急性脊髓損傷大鼠神經運動功能的影響及機制探討

余化龍，何寧，劉志剛，熊敏

(湖北醫藥學院附屬東風醫院,湖北十堰442008)

目的觀察骨髓間充質干細胞(BMSCs)聯合促紅細胞生成素(EPO)治療急性脊髓損傷的效果，并探討其作用機制。方法采用腦紅蛋白(Ngb)基因重組綠色熒光蛋白-腺病毒載體轉染BMSCs，構建Ngb基因修飾的BMSCs。取成年雄性SD大鼠80只制作脊髓損傷模型，分為聯合組、EPO組、BMSCs組、對照組各20只，聯合組于造模前1 d予5 000 U/kg EPO腹腔注射，造模后于受損脊髓中點及受損中點上下5 mm注入Ngb基因轉染的BMSCs各5 μL；EPO組于造模前1 d腹腔注射5 000 U/kg EPO，造模后于脊髓中注入等量不含細胞的培養基；BMSCs組于造模前1 d腹腔注射等量生理鹽水，造模后脊髓注入等量Ngb基因轉染BMSCs；對照組僅在脊髓損傷前1 d經腹腔注射等量生理鹽水，造模后在受損脊髓中注射等量不含細胞培養基。分別于干預1、3、7、14、21 d，采用BBB評分法評價各組神經運動功能，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測脊髓Ngb 蛋白表達。結果干預1、3、7、14、21 d聯合組BBB評分均高于EPO組、BMSCs組、對照組，P均<0.05；干預1、3、7、14、21 d聯合組Ngb相對表達量均高于EPO組、BMSCs組、對照組，P均<0.05；干預3、7、14、21 d BMSCs組Ngb相對表達量均高于EPO組、BMSCs組、對照組，P均<0.05；干預3、7、14、21 d EPO組Ngb相對表達量均高于對照組，P均<0.05。結論 Ngb基因修飾的BMSCs聯合EPO可明顯提高急性脊髓損傷大鼠的神經運動功能，可能與促進Ngb表達有關。

骨髓基質干細胞；促紅細胞生成素；脊髓損傷；腦紅蛋白

脊髓損傷是臨床常見的神經損傷，致殘率和致死率均較高[1, 2]。其預后較差，多數患者的運動、感覺恢復情況均不理想。因此，尋求一種較好的恢復脊髓功能的治療手段是目前的研究熱點。近年來，細胞移植以及基因治療為脊髓損傷的治療提供了新思路[3]。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是具有多向分化潛能的干細胞，可分泌促進神經生長的因子，促進脊髓損傷的修復[4]。腦紅蛋白(Ngb)是人們發現的第3種攜氧球蛋白，主要定位于神經元的細胞質[5]，可作為內源性神經保護因子。既往研究發現，Ngb基因修飾的BMSCs可促進中樞神經系統的損傷恢復[6, 7]。促紅細胞生成素(EPO)是一種神經營養因子，目前常用于脊髓損傷的治療[8]。2015年6～12月，我們觀察了Ngb基因修飾的BMSCs聯合EPO對急性脊髓損傷大鼠神經運動功能的影響，并探討其作用機制?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1材料大鼠BMSCs由本實驗室分離與培養。成年SD大鼠80只，體質量220～240(225±8)g，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供。293細胞常規培養于湖北醫藥學院分子生物學中心實驗室。Ad-GFP質粒購買于Invitrigen公司，CO2細胞培養箱(Heraeus，德國)，倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)，低溫離心機(Heraeus,德國)，胎牛血清(Gibco)，TRIzol(Invitrogen,美國)，SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo Co Ltd,日本)，ReverTra Ace qPCR逆轉錄試劑盒(Toyobo Co. Ltd,日本)，Hanks(自制)，大鼠淋巴細胞分離液(天津灝洋生物技術公司),β-actin (1∶1 000，Santa Cruz,美國), Ngb(1∶1 000，Santa Cruz,美國)，RIPA蛋白提取液(博士德，武漢)，BCA蛋白定量試劑盒(博士德，武漢)。

1.2Ngb基因修飾的BMSCs構建采用Ngb基因重組綠色熒光蛋白-腺病毒載體(Ad-GFP)轉染BMSCs構建Ngb基因修飾的BMSCs。Ad-GFP質粒PacⅠ線性化后LipofectamineTM2000轉染293細胞，7～10 d后收集細胞。-70 ℃、37 ℃反復凍融，離心收集上清，獲取初毒，同法進行大量擴增。氯化銫純化病毒，倍比稀釋法檢測病毒滴度(PFU)。取3次傳代的BMSCs按1×105/孔接種于24孔板中，培養24 h后吸出培養液。以最佳MOI值的Ngb重組慢病毒，按不同MOI值加入pAdEasy-GFPCXCRGFP Ngb病毒液，于37 ℃、95%飽和濕度、5%CO2孵箱內培養。感染后每天用熒光顯微鏡觀察熒光表達情況，隨機取5 個200 倍視野，計數綠色熒光表達細胞的百分數，求其平均值為感染率。每一MOI 值測3個感染率，計算細胞感染率在80%以上時需要的病毒量來確定最適感染MOI 值。感染BMSCs，并制備濃度為1×106/mL的BMSCs懸液，備用。

1.3 模型構建及分組干預取成年雄性SD大鼠80只，麻醉后仰臥位固定。在T10椎板水平附近消毒上下各5 cm，逐層分離皮膚、皮下脂肪以及椎旁肌肉；用咬骨鉗將棘突和終板去除暴露脊髓，用脊髓損傷打擊器造成脊髓損傷模型[9]。以大鼠脊髓出血水腫、后肢出現遲緩性癱瘓和尾巴痙攣性擺動為造模成功。逐層縫合傷口后給予青霉素預防感染，分籠飼養，80只大鼠均造模成功。根據隨機數字表法將大鼠分為聯合組、EPO組、BMSCs組、對照組各20只，聯合組于造模前1 d予5 000 U/kg EPO腹腔注射，造模后于受損脊髓中點及受損中點上下5 mm注入Ngb基因轉染的BMSCs各5 μL；EPO組于造模前1 d腹腔注射5 000 U/kg EPO，造模后于脊髓中注入等量不含細胞的培養基；BMSCs組于造模前1 d腹腔注射等量生理鹽水，造模后脊髓注入等量Ngb基因轉染BMSCs；對照組僅在脊髓損傷前1 d經腹腔注射等量的生理鹽水，造模后在受損脊髓中注入等量不含細胞培養基。

1.4大鼠神經運動功能評價分別于干預后1、3、7、14、21 d每組各取4只大鼠，膀胱排空后置于直徑 1 m的光滑平面自由活動5 min。采用BBB評分量表評價各組大鼠神經運動功能，評分越高說明神經運動功能恢復越好。

1.5脊髓Ngb 蛋白檢測取1.5中各時段大鼠，斷頭處死后取脊髓備用。使用RIPA蛋白提取液提取脊髓總蛋白，SDS-PAGE電泳；5%去脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，一抗分別為β-actin、Ngb；用辣根過氧化物酶共軛的二抗室溫孵育2 h，使用BCA蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量。所有操作嚴格按照使用說明書進行。

2　結果

2.1各組BBB評分比較見表1。

2.2各組Ngb蛋白相對表達量比較見表2。

表1　干預1、3、7、14、21 d各組BBB評分比較

注：與EPO組、BMSCs組、對照組比較，*P<0.05。

表2　干預1、3、7、14、21 d各組Ngb 蛋白表達量比較

注：與EPO組、BMSCs組、對照組比較，*P<0.05；與EPO組、對照組比較，△P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

3　討論

脊髓損傷是脊柱外傷最嚴重的并發癥，往往導致損傷節段以下肢體嚴重的功能障礙。脊髓損傷不僅會給患者本人帶來身體和心理的嚴重傷害，還會對整個社會造成巨大的經濟負擔。脊髓組織的直接機械損傷通常會導致部分或全部的神經功能喪失，如感覺麻痹或運動功能喪失。統計數據顯示，車禍傷、高處墜落傷以及暴力事件是脊髓損傷的最常見誘因，分別占36.5%、28.5%和14.3%[10,11]。由于神經元細胞是不可再生細胞，故針對脊髓損傷的治療一直未取得突破性進展。目前,脊髓損傷的治療主要集中在急性反應期針對炎癥反應避免神經元軸突的二次損傷，以及損傷后針對神經的再生和修復[12, 13]。隨著基因治療和細胞移植的發展，尋找有效的目的基因是人們研究的熱點。Ngb是人體內第3種攜氧球蛋白，分子量為17 kD，因其主要在腦組織中表達而得名，定位于神經元的細胞質。近年來在腦損傷的研究中發現,Ngb是神經系統特異性攜氧珠蛋白及信號轉導的調控因子,可作為內源性神經保護因子，對腦缺血缺氧性損傷、創傷性顱腦損傷等中樞神經系統損傷有很好的神經保護作用，外源性Ngb 也具有神經保護作用。

本研究發現，干預1 d聯合組BBB評分均高于EPO組、BMSCs組、對照組，原因可能是在脊髓損傷早期Ngb可以發揮內源性保護神經的作用。干預1、3、7、14、21 d聯合組Ngb相對表達量均高于EPO組、BMSCs組、對照組，干預3、7、14、21 d BMSCs組Ngb相對表達量均高于EPO組、BMSCs組、對照組，干預3、7、14、21 d EPO組Ngb蛋白相對表達量均高于對照組。通過對各組BBB評分，我們發現在脊髓損傷早期(干預1 d)，各組治療除聯合組與對照組比較差異有統計學意義外，余各組與對照組比較差異均無統計學意義。Antao等[14]通過研究發現，增加神經細胞內Ngb表達可以減輕細胞損傷后繼發的線粒體異常，抑制線粒體途徑引起的細胞凋亡，從而提高神經細胞的存活率。而當脊髓損傷后，攜帶Ngb基因的BMSC可以定向歸巢到損傷部位，持續分泌Ngb，對損傷神經進行再生修復，而EPO可以促進損傷處血管再生，為BMSCs的歸巢和發揮作用提供了路徑。這可能是聯合治療優于單獨治療的原因之一。病毒轉染Ngb基因的BMSCs可以高水平的分泌Ngb蛋白，在急性脊髓損傷組織中發揮內源性保護作用。研究發現，內源性的Ngb基因對于創傷性顱腦損傷以及缺血缺氧性神經功能的恢復發揮了重要作用。有研究證實，在顱腦損傷后Ngb表達量會增加，而且表達量與時間成正比;EPO治療并不會增加Ngb表達，EPO治療急性脊髓損傷的機制可能是EPO僅單純修復損傷血管，降低炎癥反應程度，這也可能是其效果有限的原因。除此之外，有研究證實BMSCs對急性脊髓損傷后活性氧的清除有療效，這也是其發揮作用的原因之一[15]。通過清除活性氧，抑制氧化應激反應，進而發揮對神經細胞的保護作用。綜上所述，Ngb基因修飾的BMSCs聯合EPO可明顯提高急性脊髓損傷大鼠的神經運動功能，可能與促進Ngb表達有關。

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熊敏(E-mail： xiongmin1964@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.012

R651.2

A

1002-266X(2016)18-0037-03

2015-12-30)