51例新疆尋常型銀屑病患者皮損中FOXP1和hMSH2的表達

陳春麗　王慧琴　劉新梅康曉靜　吳衛東

51例新疆尋常型銀屑病患者皮損中FOXP1和hMSH2的表達

陳春麗1王慧琴2#劉新梅1康曉靜1吳衛東2

目的： 檢測新疆尋常型銀屑?。≒V）患者皮損中FOXP1和hMSH2的表達。方法： EnVision免疫組化法分別檢測51例新疆PV患者皮損及29例正常人皮膚組織中FOXP1和hMSH2的表達。結果： FOXP1和hMSH2在PV皮損中的陽性表達率（92.16%，94.12%）均高于正常人皮膚組織（65.52%，55.17%），差異有明顯統計學意義（P＜0.01）。結論： FOXP1和hMSH2可能與尋常型銀屑病的發病有關。

尋常型銀屑??； FOXP1； hMSH2

銀屑病是多基因遺傳背景下由異?；罨腡細胞介導的炎癥性過度增殖性自身免疫性疾病，主要和環境、細胞免疫、表觀遺傳等有關。越來越多的研究證明1MiRNA通過與靶蛋白信使RNA的3'端非翻譯區結合調控蛋白質編碼基因的表達，從而參與銀屑病的發病過程［1］。本課題組前期研究證實MiR-34a和MiR-21在新疆尋常型銀屑?。≒V）皮損中的表達均高于正常皮膚組織，本實驗旨在研究其相應的靶蛋白FOXP1和hMSH2在上述兩種組織中的表達。

1　對象和方法

1.1研究對象 51例病例均來自2013年1月至2015年1月新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚科就診的PV患者，其中男23例，女28例，年齡7～76歲，平均（32.98±15.58）歲。29例正常人皮膚組織來自泌尿外科和整形外科手術切除多余的皮膚組織，其中男14例，女15例，年齡5～43歲，平均（21.97±14.32）歲。

1.2實驗標本的選擇 所有患者均具有典型皮損，并經組織病理確診。取材前3個月未系統使用過維A酸類、糖皮質激素及免疫調節劑治療；停止光療及外用藥物治療至少1個月；不伴有其他免疫性及腫瘤性疾??；女性患者排除妊娠、哺乳及月經期。對照組排除自身免疫性、遺傳性疾病，無銀屑病家族史。本研究獲新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.3主要試劑 兔抗人FOXP1單克隆抗體、鼠抗人hMSH2單克隆抗體、兔通用型二抗試劑盒（PV-6000）、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4實驗方法

1.4.1EnVision法染色 4 μL厚切片經二甲苯及梯度酒精濃度脫蠟至水，pH值9.0的EDTA抗原修復液中高壓修復，放涼后3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min，滴加一抗（FOXP1稀釋濃度為1∶200，hMSH2稀釋濃度為1∶100），同時用已知表達陽性組織作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對照，4℃冰箱過夜，復溫45 min后滴加DAB顯色液2～3 min（根據顯微鏡下觀察適時終止染色），蘇木素復染、鹽酸酒精分化、脫水、封片。

1.4.2陽性結果判定及標準 POXP1及hMSH2陽性顯色主要為表皮細胞核中出現棕黃色或棕褐色顆粒，單純胞漿著色為陰性細胞。由兩名副高級職稱病理醫師進行獨立雙盲評分。每張病理切片隨機選取5個光學顯微鏡高倍視野（×400），根據著色陽性細胞百分數和著色深度進行半定量分級，結果取平均值：著色陽性細胞占計數細胞數的百分數＜50%為0分、50%～75%為1分、＞75%為2分；未著色為0分，淺黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分。兩者得分的乘積為總評分，評分≥2分者判為陽性。

1.5統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行分析，所得數據采用X2檢驗和Spearman相關分析，檢驗水準α=0.01。

圖1　1a：FOXP1在尋常型銀屑病中為表皮全層表達（EnVision法，×100）；1b：FOXP1在正常皮膚組織中主要為表皮基底層和棘層表達（EnVision法，×100）

2　結果

2.1FOXP1在PV患者皮損和正常皮膚組織中的表達情況 FOXP1在PV組陽性表達率為92.16%（47/ 51），主要在表皮全層中；正常皮膚組陽性表達率為65.52%（19/29），主要在表皮基底層和棘層中，兩組經四格表檢驗，差異有統計學意義（X2=9.087，P＜0.01）見圖1。

2.2hMSH2在PV患者皮損和正常皮膚組織中的表達情況 見圖2。hMSH2在PV組陽性表達率為94.12%（48/51），主要在表皮全層中；正常皮膚組陽性表達率為55.17% （16/29），主要在表皮基底層和棘層中，兩組經四格表檢驗，差異有統計學意義（X2= 17.525，P＜0.01）。

圖2　2a：hMSH2在尋常型銀屑病中為表皮全層表達（EnVision法，×100）；2b：hMSH2在正常皮膚組織中主要為表皮基底層和棘層表達（EnVision法，×100）

2.3FOXP1和hMSH2在PV患者皮損中表達的關系

FOXP1表達陽性的47例PV患者中，hMSH2表達陽性44例（93.62%）；FOXP1表達陰性的4例PV患者hMSH2表達全部陽性；FOXP1和hMSH2的一致表達率為86.27%。兩者經Spearman相關分析，FOXP1 和hMSH2在PV中的表達無相關性（r=-0.073，P= 0.611）。

3　討論

叉頭框蛋白（Forkhead box，FOX）是一類以具有叉頭螺旋結構為特征、進化保守的轉錄因子家族，具有細胞周期調控、機體老化和免疫調節等作用［2］。目前將FOX蛋白分為17類，分別命名為FOXA～Q。FOXP1對免疫系統的細胞發育和功能具有重要調控作用，在免疫系統疾病中發揮重要作用［3］。FOXP1與調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）的發育及生物學功能發揮具有密切關系，FOXP1缺失的Treg細胞可抑制CD4+T細胞產生 IFN-γ［4］，而在銀屑病皮損中CD4+CD25+Treg細胞的數量較自身未受累皮膚及正常皮膚顯著增多，且與疾病的嚴重程度呈正相關［5］。Zhao等研究發現叉頭框轉錄因子家族的另一轉錄因子FOXP3受MiR-210的靶向調節可以誘發免疫功能紊亂，從而參與尋常型銀屑病的發生發展［6］，而分子生物學研究表明FOXP3可與FOXP1通過亮氨酸拉鏈結構域相互作用，兩者在疾病的發生中可能起協同作用。此外，FOXP1在皮膚基底細胞癌中的陽性表達率顯著高于癌旁正常皮膚組織［7］，而銀屑病皮損中的角質形成細胞細胞周期比正常細胞縮短，這與腫瘤的發生有著異曲同工之處。黃莉寧等［8］通過Western blot法檢測出FOXO1的磷酸化水平在尋常型銀屑病皮損中增高，導致下游效應分子的表達異常，使得角質形成細胞出現過度增殖。由以上證據推測，FOXP1也可能參與了尋常型銀屑病的發病機制。

DNA錯配修復基因（mismatch repair gene，MMR）的功能主要是消除DNA復制過程中由于DNA聚合酶滑動而引起的插入-缺失環的形成和堿基-堿基錯配，從而對DNA復制、重組過程中發生的錯誤進行監測、校正和修復。人mut S同種組蛋白2（human mut S homolog 2，hMSH2）是第一個被分離的人類MMR基因，它在DNA錯配修復過程中起主要作用。研究發現，在多種皮膚腫瘤中如皮膚惡性黑素瘤、Bowen病等均存在錯配修復系統的異常［9，10］，啟動子甲基化是導致hMSH2錯配修復功能缺陷的原因之一［11，12］。在急性淋巴細胞白血病患者的細胞系中，hMSH2過表達可以抑制細胞生長和誘導細胞凋亡［12］。Seifert等利用小干擾RNA技術證明在人類黑素細胞中，hMSH2參與調控由UVB輻射誘導的細胞周期調控和細胞凋亡［13］。還有學者證明只有不成熟的復制活躍的細胞，才需要hMSH2的不斷糾錯，并且這種作用貫穿于整個細胞周期［14］。本實驗中hMSH2在銀屑病中過表達，可能是由于銀屑病皮損中角質形成細胞過度增生和異常分化，導致堿基錯配不斷增加，細胞修復系統被激活，出現hMSH2代償性增高。

越來越多的研究證實miRNA的異常表達在銀屑病的發病機制中起重要作用。課題組前期通過實時熒光定量PCR實驗證實MiR-34a和MiR-21在新疆尋常型銀屑病皮損中的表達均高于正常皮膚組織，又通過miRwalk靶基因預測軟件（預測網址為 www. umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk）得出MiR-34a和MiR-21的靶基因之一分別是FOXP1和hMSH2。本研究中通過免疫組化法得出FOXP1和hMSH2在新疆PV皮損中的陽性表達率均高于正常皮膚組織，兩組差異具有明顯統計學意義（X2=9.087，17.525，均P＜0.01），提示MiR-34a和MiR-21通過調控各自靶基因FOXP1和hMSH2在銀屑病的發病中發揮作用，其機制可能為MiR-34a的過度表達靶向上調FOXP1，導致銀屑病中Treg細胞增多、炎性細胞因子IFN-γ等分泌增加，從而形成銀屑病特征性炎性皮損；或hMSH2受MiR-21靶向調控后致啟動子區高甲基化，使hMSH2錯配修復功能紊亂，從而導致銀屑病中角質形成細胞的增殖異常，異常分化的角質形成細胞又反過來激活hMSH2的功能，形成惡性循環。本研究還發現，FOXP1和hMSH2在新疆PV患者皮損中的表達無相關性（r=-0.73，P＞0.01），表明FOXP1和hMSH2在促進銀屑病發生發展中的作用可能是獨立的。但以上實驗結論需大樣本進一步驗證，FOXP1和hMSH2在銀屑病的發病過程中還有哪些途徑也尚需進一步研究。

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（收稿：2015-06-28 修回：2015-07-26）

Expression of FOXP1 and hMSH2 in patients with psoriasis vulgaris in Xinjiang region

CHEN Chunli1，WANG Huiqin2，LIU Xinmei1，KANG Xiaojing1，WU Weidong2.
1.Department of Dermatology and Venereology，People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China；2.The Center of Clinical Research，People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China Corresponding author：WU Weidong，E-mail：xjwudong@126.com

Objective：To detect the expression level of FOXP1 and hMSH2 in the lesions of patients with psoriasis vulgaris in Xinjiang region.Methods：The level of FOXP1 and hMSH2 was detected by EnVision immunohistochemistry method in the lesions of 51 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 29 healthy controls.Results：The level of FOXP1 and hMSH2 in lesions was 92.16%and 94.12%which was higher than those in the normal skin（65.52%and 55.17%），with significant differences（P＜0.01）.Conclusion：FOXP1 and hMSH2 may be associated with the onset of psoriasis vulgaris.

psoriasis vulgaris；FOXP1；hMSH2

新疆維吾爾自治區自然科學基金（編號：2015211C201）

1新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚性病科，烏魯木齊，830001

2新疆維吾爾自治區人民醫院臨床醫學研究中心，烏魯木齊，830001

吳衛東，E-mail：xjwudong@126.com#并列第一作者