基于中藥指紋圖譜結合化學模式識別的清開靈軟/硬膠囊的成分分析

滕會會　杜守穎　白　潔　陸　洋　李鵬躍　張　晴　杜　秋　王　振　田志浩

基于中藥指紋圖譜結合化學模式識別的清開靈軟/硬膠囊的成分分析

滕會會杜守穎白潔陸洋李鵬躍張晴杜秋王振田志浩

目的 對清開靈軟/硬膠囊化學成分進行全面整體分析。方法 采用HPLC-DAD建立5種指標性成分含量測定及指紋圖譜方法；通過模式識別技術進行整體分析，并尋找出兩者差異最大的化學成分。結果 兩者膽酸、豬去氧膽酸和黃芩苷含量差異較小，綠原酸和梔子苷含量差異較大；PCA分析得到59個化學成分濃度在軟膠囊中高，40個化學成分濃度在硬膠囊中高，PLS分析得到對兩者差異性貢獻度最大的16個成分。結論 清開靈軟/硬膠囊化學成分存在明顯的差異；多成分定量結合指紋圖譜與化學模式識別技術可用于化學成分的全面分析。

化學模式識別； HPLC指紋圖譜； 清開靈軟/硬膠囊； 含量測定

清開靈作為純中藥復方制劑，具有清熱解毒、化痰通絡、醒神開竅的功效，目前被制成多種劑型［1］，由于清開靈注射劑不良反應多［2］，口服制劑越來越受青睞。當前臨床應用廣泛的兩種口服制劑——硬膠囊和軟膠囊，兩者雖然處方相同，但制備工藝明顯有別［1］，這使得兩種制劑的化學成分可能存在差異。而化學成分不同，其相互間的促進或抑制作用及對酶活性的影響等均有一定差異，從而導致不同制劑在吸收、代謝、排泄以及作用機理和不良反應上存在一定差異［3-5］，臨床使用也隨之調

中藥指紋圖譜技術是一種表征中藥所含成分與其質量關系的有效手段，但目前采用相似度評價，不能對所含成分進行立體多維的整體分析，而化學模式識別能實現中藥多維信息的綜合分析，已廣泛應用于中藥材及中成藥的研究［7-11］。因此，本實驗以清開靈軟/硬膠囊為研究對象，對比兩者指標性成分含量，進一步采用HPLC-DAD建立清開靈軟硬膠囊指紋圖譜，再結合模式識別方法對清開靈軟/硬膠囊化學成分進行整體性分析，為進一步譜效關系、體內吸收、代謝等深入研究奠定基礎，也為不同劑型比較研究提供一種新手段。

1　儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀（LC-20AD泵，SIL-20A自 動 進 樣 器，SPD-M20A檢 測 器）；KQ5200DA型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），分析天平（賽多利斯儀器系統有限公司）；G20型醫用離心機（北京白洋醫療機械有限公司）。

黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201318）；梔子苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-201115）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201314）；膽酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100078-201415）；豬去氧膽酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100087-201411）；甲醇、乙腈（Fisher公司，色譜純）；磷酸（TED公司，色譜純）；哇哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；清開靈軟膠囊（神威藥業集團有限公司，批號：14072411，15052042，15051641，15051941，15051841，15051942，15052041，15052241，15051741，15052111，15052141，每粒0.4 g，含黃芩苷20 mg），清開靈硬膠囊（廣州白云山明興制藥有限公司，批號：141208，140607，548902，549009，141001，140711，141041，549010，141143，150142，140512，每粒 0.25 g，含黃芩苷10 mg）。

2　實驗方法與結果

2.1膽酸、豬去氧膽酸、綠原酸、梔子苷、黃芩苷5種指標性成分含量測定

線性關系考察、精密度、穩定性、重復性及加樣回收率均參照2015版《中華人民共和國藥典》四部（藥品質量標準分析方法驗證指導原則9101），結果均符合要求。樣品含量測定結果表明膽酸、梔子苷、黃芩苷含量均在藥典含量限定范圍內。按臨床口服劑量（軟膠囊口服1粒/次，硬膠囊口服2粒/次）計算結果表明軟/硬膠囊中綠原酸和梔子苷含量差異較大，膽酸、豬去氧膽酸和黃芩苷含量差異較小。

2.2清開靈軟/硬膠囊指紋圖譜研究

2.2.1色譜條件 Phenomenex Luna RP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相（A）0.4%磷酸的水溶液-（B）甲醇-乙腈（體積比為4∶1），梯度洗脫；流速 1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量為5 μL；檢測波長254 nm。梯度洗脫程序：0～15分鐘，5% ～30%B；15～22分鐘，30% ～35%B；22～40分鐘，35% ～40%B；40～43分鐘，40%B；43～55分鐘，40%～81%B；55～60分鐘，81%～90% B；60～65分鐘90%B。整。雖然有文獻對兩者的氨基酸成分進行過報道［6］，但缺乏兩制劑間化學成分的整體性研究。對不同制劑的化學成分進行整體性分析，可以為不同制劑的體內吸收、代謝等深入研究奠定基礎，在闡明中醫的方藥理論、揭示中藥的配伍規律和作用機制、優化制劑工藝、制訂質控標準等方面均具有重要意義。

2.2.2溶液的配制 軟膠囊供試品的制備：取1.2 g硅藻土置于蒸發皿中，精密稱定，再取軟膠囊內容物0.4 g，精密稱定于上述蒸發皿中，研勻后，將其全部轉入錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲 70分鐘（功率200 W，頻率40 KHz），再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，吸取5 mL以10000 rpm離心10分鐘，上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

硬膠囊供試品的制備：取清開靈硬膠囊內容物0.5 g，精密稱定，將其全部轉入錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲70分鐘（功率200 W，頻率40 KHz），再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，吸取5 mL以10000 rpm離心10分鐘，上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

黃芩苷對照品溶液的配制：稱量黃芩苷對照品適量，加 70%甲醇超聲溶解，配制成含黃芩苷100 μg/mL的對照品溶液。

2.2.3指紋圖譜分析方法及數據處理方法 中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）進行指紋圖譜分析。多元數據分析和建模均由SIMCA-P11.5軟件及SPSS 16.0來完成。

2.2.4清開靈軟/硬膠囊指紋圖譜方法學考察 精密度、穩定性、重復性考察均參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》，以黃芩苷色譜峰作為參照峰，統計各共有峰的相對保留時間和相對保留面積，計算RSD值，共有峰相對保留時間及相對保留面積的RSD值均小于3%，符合指紋圖譜研究技術的要求。

2.2.5樣品測定 取11批清開靈軟膠囊，11批清開靈硬膠囊，分別按2.2.2項下對應的方法制備各供試液并按2.2.1項下色譜條件進樣檢測，并用中藥指紋圖譜相似度計算軟件進行分析，考慮到黃芩苷峰面積過大，會影響相似度計算的準確性，因此在相似度計算時將其剔除。結果標示出了清開靈軟膠囊21個共有峰（如圖1），共有峰面積所占總面積比例為87.18%。標示出了清開靈硬膠囊16個共有峰（如圖2），共有峰面積所占總面積比例為84.40%。所得11批次清開靈軟膠囊的相似度為0.994、0.993、0.995、0.992、0.92、0.998、0.992、0.994、0.989、0.992、0.976；11批硬膠囊相似度結果為0.992、0.973、0.995、0.944、0.989、0.977、0.981、0.946、0.994、0.975、0.991。說明清開靈軟硬膠囊各自批次之間具有高度相似性，同時由軟/硬膠囊的HPLC對比色譜圖可直觀得到，兩者之間化學成分種類及峰面積大小均有一定差異（如圖3，箭頭標出），為了更加形象和確切地說明清開靈軟/硬膠囊的成分差異，擬采用模式識別技術對其進行整體性分析，判別兩者之間的差異。

圖1　11批清開靈軟膠囊指紋圖譜

圖2　11批清開靈硬膠囊指紋圖譜

圖3　清開靈軟/硬膠囊HPLC色譜對比圖（A為軟膠囊，B為硬膠囊）

表1　三種數據導入所得PCA、PLS模型的相關參數

2.3色譜峰的峰匹配及數據轉化

通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，將10個較大峰進行保留時間對比，把清開靈軟/硬膠囊各11批的圖譜進行峰匹配，數據導出后經原始數據、離差標準化及Z-score標準化三種方式處理，導入到SIMCA-P 11.5軟件中，比較所建模型的各相關參數，結果見表1。由表1可得，數據經Z-score標準化處理后，在PCA模型及PLS模型中各相關參數最優，因此在接下來建模中對數據進行Z-score標準化預處理。

2.4基于PCA模型對清開靈軟/硬膠囊進行整體性評價

通過將數據導入SIMCA-P中，得3個主成分模型，模型的R2X=0.712，Q2=0.452，說明模型的解釋能力較高，符合實驗要求。分別繪制出PCA得分圖（見圖4）、PCA得分與載荷匯總圖（見圖5）。

圖4　PCA得分圖（■為硬膠囊，▲為軟膠囊）

圖5　PCA得分與載荷匯總圖（■為硬膠囊，▲為軟膠囊）

由得分圖（圖4）結果可知，軟硬膠囊11批次各自聚集在一起，說明各自批次間具有高度相似性，與指紋圖譜相似性計算結果一致，而兩劑型組分別分布在得分圖左右象限各兩邊，說明兩組之間存在明顯差異，硬膠囊中第四個樣品超出95%置信區間，但對比其色譜圖發現差異不大，因此將其保留，這也說明硬膠囊與軟膠囊相比，其離散程度更大，提示硬膠囊的生產工藝可能不如軟膠囊穩定。由得分與載荷匯總圖（圖5）可知，總變量的整體分布趨勢大致集中在左右象限對應的軟硬膠囊樣本各兩邊，有少數分布在原點附近，根據PCA相似相近的原理，變量距離哪個樣本近表明其在相應的樣本中含量越高，距離越遠表明其含量越低或不存在于該樣本中，而兩劑型組間變量分布各自集中在左右象限兩端且相互距離較遠，說明軟/硬膠囊兩種制劑的化學成分在種類或含量上存在較大差異，這種差異有可能由不同的生產工藝及原料來源不同導致。綠原酸（峰號59）、梔子苷（峰號66）和黃芩苷（峰號82）在22個樣本中的分布比例圖（圖6）顯示綠原酸與梔子苷在軟硬膠囊中含量差異較大（為一折線），黃芩苷含量差異較?。橐恢本€），這與HPLC含量測定結果相一致（由于黃芩苷含量較綠原酸、梔子苷含量高很多倍，因此將綠原酸、梔子苷分布比例圖放大）。

2.5清開靈軟/硬膠囊組間差異化學成分的篩選

圖6　分布比例圖（左為綠原酸、梔子苷、黃芩苷分布比例圖，右為綠原酸、梔子苷放大比例圖）

圖7　PLS模型中預測值與觀測值擬合曲線

圖8　PLS得分與載荷匯總圖（■為硬膠囊，▲為軟膠囊）

為考察引起兩種制劑間差異的化學成分具體有哪些，進行PLS建模分析。通過將數據導入SIMCA-P中，得2個主成分，模型的R2X為0.626，R2Y為0.998，Q2為0.992，能夠解釋62.6%的X變量，解釋99.8%的Y變量，交叉有效性為99.2%，解釋指標及預測指標均較高，模型擬合較好。分別繪制出預測值與觀測值擬合曲線圖（圖7）、得分與匯總圖（圖8）、各化合物系數圖（圖9）、和各化合物VIP值圖（圖10）。

由圖7可見PLS模型的預測值與觀測值基本一致，R2=0.9976，RMSEE=0.0527，模型較好，能夠很好地通過模型預測Y。

由圖8可見，與PCA模型類似，軟硬膠囊兩組分布在得分與載荷圖左右象限，說明兩劑型具有明顯差異。由圖9可得，59個峰對應的化學成分濃度在軟膠囊中高，40個峰對應的化學成分濃度在硬膠囊中高。其中除峰號82、41、56、18、39、63、84、43、15、54、36、2、92、30、31、86、37、20、73、28、76、79、42、24、69、87、32、12、46、27共30個峰沒有較大差異（如圖9灰色部分）外，其余峰對應的化學成分均存在較大差異。由圖10可得，共53個峰（圖10中標綠部分）VIP值均大于1，說明這53個峰對應的化學成分對軟硬膠囊兩組間差異貢獻較大。通過將第一主成分loading值、系數分布及VIP值（閾值＞1）相關參數總值|r|對比，再結合色譜峰比對及T檢驗（閾值P<0.05），結果見表2，由表可得，共16個峰的總值|r|均大于1，色譜峰對比得到其保留時間及峰響應強度，t檢驗P值均小于0.0001，說明組間存在顯著差異，因此最終確定峰號17、19、40、48、59、60、66、70、75、77、78、81、83、90、94、97共16個峰對應的化學成分是引起組間差異的主要化學成分，即為潛在標志物，其中59、66號峰鑒定為綠原酸及梔子苷。

圖9　PLS中各化學成分的系數結果

圖10　PLS中各化合物的VIP值

表2　潛在標志物的各相關參數

3　討論

本實驗采用HPLC-DAD法建立清開靈軟/硬膠囊指紋圖譜并同時測定綠原酸、梔子苷、黃芩苷三種成分，在192 nm下同時測定膽酸和豬去氧膽酸2個有效成分，相比較通用的單個成分測定及膽酸成分的HPLC-ELSD測定，方法簡便、準確、可靠，可以實現5種成分的快速定量分析，多成分定量結合指紋圖譜可為清開靈軟/硬膠囊的質量評價提供實驗數據基礎。

由清開靈軟/硬膠囊指紋圖譜相似度計算結果可得出清開靈軟/硬膠囊各自批次之間沒有較大差異性，而PCA及PLS分析得出清開靈軟硬膠囊兩種劑型存在明顯差異，說明兩者之間差異主要不是來自于批次本身，而是由于不同廠家原料來源及生產工藝不同所導致。硬膠囊與軟膠囊相比，其離散程度更大，由于在硬膠囊的生產工藝中，缺少醇沉的純化工藝，由此造成的批間差異要大于軟膠囊，也提示硬膠囊的生產工藝不如軟膠囊穩定。5個指標性成分的含量測定結果表明兩者之間的化學成分含量有一定的差異，其中通過PCA模型對綠原酸、梔子苷、黃芩苷三種指標性成分對應的色譜峰提取分析，所得結果與指標性成分含量測定結果一致，2種方法得到相互印證，也從側面反映出所建模型的可行性。最后通過進一步歸納，分析得出59個化學成分濃度在軟膠囊中高，40個化學成分濃度在硬膠囊中高，得到對兩者差異性貢獻度最大的16個成分（其中兩個成分鑒定為綠原酸和梔子苷），即為潛在的標志物，說明兩者化學成分差異較大。

本實驗基于多成分定量結合中藥指紋圖譜與化學模式識別技術成功地對清開靈軟/硬膠囊化學成分進行了初步研究，該分析及數據處理方法能實現成分的整體分析，同時能得出不同劑型間的成分差異，提示該方法能運用于中藥及中藥材的成分分析及質量控制研究。由于時間原因，未對存在差異的化合物（標志物）進行結構鑒定，筆者團隊后續將會進行深入研究。

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（本文編輯：董歷華）

Composition analysis of Qingkailing hard and soft capsule based on fingerprint combined with chemical pattern recognition

TENG Hui-hui，DU Shou-ying，BAI Jie，et al. School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China

DU Shou-ying，E-mail：dushouying@263.net

Objective To realize the comprehensive overall analysis on the Qingkailing hard and soft capsule chemical composition.Methods HPLC-DAD method was used to establish five indexes determination of component content and fingerprint method.Chemical pattern recognition technology was used for the overall analysis，and the biggest difference in chemical composition between hard and soft capsule was found out.Results The content of baicalin and hyodeoxycholic acid and cholic acid had no significant differences，but obvious differences were found in contents between chlorogenic acid and geniposide.PCA analysis got 59 chemical components concentration highly included in soft capsule，40 high chemical concentration in hard capsule.PLS analysis obtained 16 largest differences chemical compositions.Conclusion Qingkailing Soft/hard capsules chemical composition existed obvious differences.Multicomponent quantitative methods combined with fingerprint and chemical pattern recognition technology can be used for the comprehensive analysis of chemical composition.

Chemical pattern recognition； HPLC fingerprint； Qingkailing hard and soft capsule； Content determination

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.06.007

北京市科技新星計劃（xx2015A048）；證候與方劑基礎研究北京市重點實驗室（BZ0102）

100102 北京中醫藥大學中藥學院［滕會會（碩士研究生）、杜守穎、白潔、陸洋、李鵬躍、張晴（碩士研究生）、杜秋（碩士研究生）、王振（碩士研究生）、田志浩（博士研究生）］

滕會會（1988-），女，2013級在讀碩士研究生。研究方向：中藥新劑型與新技術研究。E-mail：h15810377850@163.com

杜守穎（1960-），女，博士，教授，博士生導師。研究方向：中藥新劑型與制劑關鍵技術。E-mail：dushouying@263.net

2015-09-30）