喉癌干細胞的新型培養純化方法及臨床應用前景

段廣亮 王凱峰 戴輝萍 唐婷婷 丁飛

喉癌干細胞的新型培養純化方法及臨床應用前景

段廣亮 王凱峰 戴輝萍 唐婷婷 丁飛

目的 通過含生長因子的無血清培養基（SFM）培養Hep-2喉癌細胞，分離并擴增腫瘤干細胞，為進一步制備放療增敏劑做基礎研究。方法 含生長因子的無血清培養基（SFM）培養Hep-2喉癌細胞，流式細胞儀檢測細胞中側群細胞的比例。當側群細胞比例達25%時，收集全部細胞球，FACS篩選出CD133+、CD44+細胞作為喉癌干細胞。結果 成功培養出側群細胞，流式細胞儀檢測其比例達26.2%，FACS篩選出CD133+CD44+細胞的比例均＞91%。結論 成功培養出高濃度喉癌干細胞。

無血清培養基 重組表皮生長因子 成纖維生長因子 側群細胞

腫瘤干細胞是腫瘤中少數具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細胞，且固有放射抵抗能力，而其它腫瘤細胞群并不增殖或數次增殖后自然凋亡。因此一般認為腫瘤干細胞是腫瘤發生發展和放射抵抗的根源［1～4］。近年成功分離鑒定近10種腫瘤干細胞，鑒別腫瘤干細胞目前常用的方法是對富集腫瘤細胞表面特殊抗原的識別，頭頸部鱗狀細胞癌表面標志物的研究較少，較為認可的“標志”細胞是流式細胞儀檢測的側群細胞（腫瘤干細胞樣細胞）和CDl33+、CD44+腫瘤細胞［5］，但分選效果不佳，作者自2010年6月至2012年3月結合自身試驗條件及喉癌干細胞的特點通過長期實驗摸索分兩步培養純化喉癌干細胞，成功的經流式細胞儀分選出具有較高濃度CDl33+、CD44+喉癌干細胞。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Anti-CD44-FITC（美國eBioscience公司）；Anti-CD133-PE（美國eBioscience公司）；Hocest33342（碧云天公司）；碘化丙啶（PI）（美國 Sigma公司）；維拉帕米（Verapamil）（美國 Sigma公司）；DMEM/ F12（美國Gibco公司）；重組表皮生長因子（EGF）（美國PeproTech公司）；成纖維生長因子（bFGF）（美國PeproTech公司）

1.2 實驗方法 （1）細胞的凍存和復蘇：①凍存：消化細胞，將細胞懸液收集到離心管中保存。1000r/min離心10min，棄上清液。沉淀加含10%DMSO的培養液，計數板計數，調整至5×106/ml左右。將懸浮液分到凍存管中，1ml/管。將凍存管擰緊封嚴，如用安瓿瓶火焰封口時，封口須嚴密，否則復蘇時較易爆裂。管瓶下部貼上標簽，注明細胞的種類及凍存日期。根據冷凍要求按順序降溫：室溫時→4℃（20min）→冰箱冷凍室（30min）→低溫冰箱（-30℃ 1h）→液氮。②復蘇：準備37℃的溫浴鍋，從液氮中取出凍存管、迅速置于37℃溫水中并不斷攪動，使凍存管中的凍存物在1min之內融化。打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。1000rpm離心10min，棄去上清液。沉淀加10ml培養液，吹打均勻，再離心10min，棄上清液。加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中，37℃培養，第2天觀察生長情況。（2）喉癌干細胞球培養和誘導分化試驗：采用常用的干細胞微球體分離培養法：①先將Hep-2喉癌細胞接種于含血清培養基中培養傳代。待細胞生長至80%瓶底面積時，用PBS液清洗，質量濃度為2.5g/L胰蛋白酶消化，吸管反復吹打制成單細胞懸液。②離心除去終止消化時殘留的含血清培養基后重懸于無血清培養基中，無血清培養基為在DMEM/ F12培養基中添加重組表皮生長因子（20μg/L）和重組成纖維生長因子（10μg/L），L-谷氨酰胺（2mmol/L），胰島素（4U/L），青霉素G（1×105U/L），鏈霉素（100mg/ L）。③臺盼藍染色、計數重懸成103/ml單細胞懸液，接種于培養瓶，在37℃，體積分數為5%的CO2飽和濕度培養箱中培養，培養瓶直立、每日搖數次以利細胞懸浮生長，觀察微球形成，在每個培養瓶中加入2 ml/2d新鮮無血清培養基，傳代1次/6d。④待喉癌細胞增殖形成細胞球4d后，Accutase消化、吹打成單細胞，洗滌后在SFM中傳代培養，以擴增和富集喉癌干細胞，按1：4的比例傳代。（3）側群細胞的檢測：①選擇對數生長期生長的細胞，細胞計數，調整細胞懸液的密度至1×109/L。②準備2個干燥無菌的流式上樣管（5 ml，材料為聚丙烯），分別在2管中加入上述細胞懸液各1ml，然后再加入Hoechst33342溶液，使終末濃度達到5 mg/L，在對照管中加入維拉帕米溶液，使終末濃度達到濃度50 mg/L。③給予反復吹打數次，均勻后置于37℃恒溫水浴箱中120 min，期間緩和搖動上樣管1次/15min使細胞充分染色。④待染色結束后在4℃ 1000 r/min離心機離心10min，棄上清液，加入4℃磷酸鹽緩沖液吹洗1次，再4℃ 1000 r/min離心10min，棄上清液，重懸于體積分數為2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中。⑤放在4℃環境中準備上機檢測。（4）喉癌干細胞的篩選及體外生長HE染色觀察：①當側群細胞比例達25%時，收集全部生長細胞球，制成單細胞PBS懸液100μl，計數細胞密度為1×107/ml。②用臺盼藍染色計活細胞數，要求活細胞數90%～95%。③加入Anti-CD44-FITC和Anti-CD133-PE各5μl，4℃避光孵育30min。④離心去上清液，PBS洗滌≥3次，1500r/min，離心3min，200目細胞網篩過濾。⑤加300μl PBS（pH=7.4），上機檢測。⑥分選之后調整細胞濃度達到1×106/ml，接種到含蓋玻片的培養瓶中培養，細胞長成單層后，取出蓋玻片，PBS洗滌，用95%的酒精固定15min，再洗滌，浸入蘇木精染液中染色10min，洗滌；浸入淡氨水中之前用稀鹽酸酒精溶液分色，使細胞核藍化5min洗滌；伊紅染液染色10min，洗滌；無水酒精脫水，過二甲苯3次，封片，光鏡下觀察。

2 結果

2.1 成功誘導和富集喉癌干細胞 （1）以含血清培養基培養Hep-2喉鱗癌細胞系細胞：接種后8h所有細胞均貼壁，3～4d后細胞即長滿瓶底，培養的喉癌細胞有明顯的腫瘤細胞特征：上皮樣形態，多邊形，似鋪路石樣排列，折光性好，不形成懸浮細胞球（如圖1）。（2）接種細胞于無血清培養基中：Hep-2喉鱗癌細胞株細胞接種于SFM中，培養瓶直立，每日搖數次，開始大部分細胞貼壁，在第3～7天，部分細胞開始懸浮，小球狀增生形成，部分細胞崩解死亡，不能在SMF培養基中存活生長。第9天時，小球狀細胞團部分凋亡，但仍能見小部分細胞擴增繼續形成細胞球，搖晃培養瓶可見較少的細胞球沉于培養瓶底部。球內細胞折光性較好，生長緊密，不能準確辨別細胞間的分界限。新形成的腫瘤干細胞球外形不規則，常以“發芽”的生長方式連接在球體上。傳代時通過Accutase消化、吹打成單細胞懸液，后第l～2天單個細胞間相互聚集連接成“樹枝狀”懸浮于SFM中，第3～4天形成不規則細胞球，第5～6天逐漸形成規則球形。隨著傳代次數的增加，球體趨于圓形（如圖2）。

圖1 含血清培養基培養的喉癌細胞

圖2 SFM培養喉癌細胞形成的細胞球（原放大倍數×200）

2.2 側群細胞的分選 側群細胞能排出熒光染料Hoechst33342而呈弱染色狀態，位于流式圖的左下角熒光弱染區域。對照組中加維拉帕米，抑制細胞轉運蛋白的功能，改變側群細胞外排熒光染料的特性，使側群細胞的比例減少到（0.0±0.0）%，經多次擴增和富集后成功使側群細胞達到26.2%（如圖3）。用離心管收集分選的SP細胞和NSP細胞備用。

圖3 Hoechst33342組（左）和Hoechst33342+維拉帕米組（右）染色結果

圖4 流式細胞儀篩選實體瘤來源的CD44+、CDl33+喉癌干細胞結果

圖5 喉癌干細胞HE染色結果

2.3 喉癌干細胞的篩選 采用無血清培養基培養細胞微球體，富集喉癌干細胞。流式細胞儀分別篩選出CD44+、CDl33+喉癌干細胞。分選前喉癌細胞CD44+、CDl33+的表達率均＜3%，分選后均＞91%，分選后喉癌細胞HE染色可見細胞分布均勻，體積較大，呈梭形，細胞核與細胞質的比例接近于1，核大濃染，核仁大而突出，有病理性核分裂相，符合惡性腫瘤干細胞病理特點（圖4、5）。

3 討論

目前腫瘤干細胞的分選可通過功能學分選（腫瘤干細胞高表達耐藥蛋白而將核染料Hoechst 33342排除出細胞外。流式圖中顯示這類細胞稱為側群細胞）或免疫學分選（流式或免疫磁珠法分選出腫瘤干細胞表面標志陽性的細胞）［6］。但上述兩種方法最大的問題是腫瘤干細胞存在于腫瘤組織中數量稀少，若純化足量的細胞以滿足研究所需，工作量極大。作者通過長期實驗摸索發現，在無血清培養基中添加bFGF、EGF、L-谷氨酰胺，胰島素作為血清替代物既保留了細胞賴以生存的必需營養物質又去除了血清中的促分化劑，通過富集培養成功使側群細胞＞25%。喉癌鱗狀細胞中，CD44和CD133的陽性比例均＜3%，作者成功地通過流式細胞儀分選出具有CD44+、CDl33+喉癌干細胞的比例均＞91%。

流式細胞儀分選法，也稱為熒光活化細胞分選法，是利用待分選細胞結合熒光素標記抗體能力的差異或者利用外排熒光染料性質的差異來分離腫瘤干細胞，是目前應用最為廣泛的分離技術，已應用于人白血病、乳腺癌及神經膠質瘤干細胞的分離。磁性激活細胞分選法基于細胞表面抗原與連結有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而留滯在磁場中，無該類表面抗原的細胞不能與連接有磁珠的特異性抗體結合，不能被磁珠捕獲，因而無磁性，這些細胞不能在磁場中留下，細胞進而得到分離，目前膠質瘤干細胞的分離常采用此法。還有一種腫瘤干細胞分選法是側群細胞分選法，有關研究表明體外培養的側群細胞具有神經干細胞特性，且與非側群細胞不同，側群可以在裸鼠中高效表達移植瘤。由于腫瘤干細胞包膜高度表達ATP結合盒（ATP-binding cassette，ABC）膜轉運蛋白（包括P-糖蛋白P-gp、乳腺癌耐藥蛋白、ABCG1、ABCG2等）對進入細胞內的化療藥物和染料有外排泵作用。因此可以利用側群細胞不被Hoechst33342染色的特性，即利用干細胞通過分子標記來分離純化腫瘤干細胞，這一方法有利于分離純化未知表面標志物的腫瘤干細胞。研究證明大多數腫瘤細胞系中存在側群細胞［5］，并在C6神經膠質瘤、MCF-7乳腺癌、B104成神經細胞瘤細胞系中成功分離出側群細胞亞群，且證實了C6中僅占細胞總數0.4%的側群細胞具有多向分化和少量成瘤的特性，提示側群細胞是適用于腫瘤干細胞分離的一種方法。目前尚無最優化的腫瘤干細胞分選方案，流式細胞儀分選與純化具有高敏感和高特異性，由于流式細胞分選法是在分選血細胞的過程中建立的，許多腫瘤細胞可能難以承受高壓小直徑的液流，進而影響分選細胞的活性，磁性激活細胞分選法對細胞損傷小，不會影響細胞的活性與功能，微型磁珠可被生物降解等優點，但與流式細胞分選法相比分選純度較低。側群細胞分離的最優化條件是用355nm左右的紫外光激發，需要特殊的氬氣激發光源，其功率較高，需要水冷卻系統及相應的濾片，這些設備價格昂貴，限制了側群細胞分選法的普遍推廣。

我國喉癌的發病率呈逐年上升趨勢，成為危害嚴重的常見惡性腫瘤之一。放療是喉癌的臨床最重要的治療手段之一，但是腫瘤細胞固有的和放療誘導的放療抵抗嚴重影響了療效，希望在分選出喉癌干細胞的基礎上進一步研究開發出放療增敏劑，解決喉癌放療抵抗，根治腫瘤。

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Objective To explore a new culturing method for Hep-2 Laryngeal Cancer Cell by menas of the SFM of containing growth factor separate and to amplify cancer stem cell. Methods Culturing Hep-2 Laryngeal Cancer Cell by menas of the SFM of containing growth factor，FACS was used to detect the ratio of side population. When the ratio of side population expressed reached 25%，the whole cell balls were collected. FACS was used to screen out CD133+CD44+cells， which were laryngeal cancer stem cell. Results The side population were successful cultured and reached the ratio of 26.2% by detection of FACS；Overtop 91% of CD133+CD44+cells were screened out by FACS. Conclusion High ration of laryngeal cancer stem cell can be successfully cultured.

SFM EGF bFGF Side population

310015 杭州師范大學附屬醫院