重組產番茄紅素大腸桿菌工程菌株中異戊烯異構酶(IDI)基因的篩選

韓　莉,張莎莎,王博軍,劉京國,劉偉豐,*,王艷萍,陶　勇

(1.天津科技大學 食品工程與生物技術學院,天津 300457;2.中國科學院微生物研究所,北京 100101;3.北京農學院 生物科學與工程學院,北京 102206)

?

重組產番茄紅素大腸桿菌工程菌株中異戊烯異構酶(IDI)基因的篩選

韓莉1,2,張莎莎2,王博軍3,劉京國3,劉偉豐2,*,王艷萍1,*,陶勇2

(1.天津科技大學 食品工程與生物技術學院,天津 300457;2.中國科學院微生物研究所,北京 100101;3.北京農學院 生物科學與工程學院,北京 102206)

番茄紅素是一類在食品、醫藥等領域具有廣泛應用價值的萜類化合物。異戊烯基焦磷酸異構酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)是番茄紅素合成途徑中的關鍵酶,也是代謝工程改造的主要靶點。本研究為了系統比較不同來源IDI對重組大腸桿菌番茄紅素(Lycopene)產量的影響,分別克隆了原核微生物、真核微生物、植物、古菌等多種來源的I型及II型異戊烯基焦磷酸異構酶(IDI)基因,在大腸桿菌E.coli中異源表達,在加強自身2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)代謝途徑的背景下,通過優化多靶點組合及轉化時間提高番茄紅素的合成水平。結果表明釀酒酵母來源的I型IDI(ScIDI)及枯草芽孢桿菌來源的II型IDI(BsIDI)在經優化的背景下可以獲得最高的番茄紅素產量,產量分別達到9.96 mg/g DCW,8.78 mg/g DCW,番茄紅素積累在轉化8 h達到最高,最高能達到10.29 mg/g DCW。本研究最終確定了不同類型IDI發揮功能的條件,為后續番茄紅素以及萜類化合物的代謝途徑的改造提供依據。

異戊烯基焦磷酸異構酶(IDI),大腸桿菌,番茄紅素,代謝工程,MEP途徑

番茄紅素是一種天然萜類色素,主要存在于番茄等茄科植物的成熟果實中。它是目前自然界中發現的最強抗氧化劑之一。番茄紅素可以有效地防治因衰老,免疫力下降引起的各種疾病。在食品、醫藥、飼料等領域具有廣泛的應用價值。與所有的萜類化合物一樣,番茄紅素是由萜類通用前體——異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)裝配合成的[1]。通用前體物質IPP/DMAPP在生物體內主要有兩條生成途徑:甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA pathway)和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway,MEP pathway)生物合成途徑[2-4]。其中,MVA途徑主要存在于古細菌、真菌、以及動物體;而高等植物、大多數細菌、藻類則主要以MEP途徑合成。野生型大腸桿菌以MEP途徑作為唯一的萜類前體合成途徑[5]。Martin等[6]在大腸桿菌中引入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MVA途徑,從而構建了能夠高產紫槐二烯(Amorphadiene)的工程菌,并為其他萜類化合物的生產提供了理論基礎。Ajikumar P K等[7-9]就MEP途徑中的各關鍵基因進行優化,來提高異戊二烯(Isoprene)的產量。

異戊烯基焦磷酸異構酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)催化IPP與DMAPP的異構化反應,是萜類化合物生物合成的一個重要的限速酶[10]。Rad S A等[11]在大腸桿菌中分別過表達大腸桿菌E.coli和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的IDI基因,使番茄紅素的產量有較大提高。在MVA途徑和MEP途徑中,異戊烯基焦磷酸異構酶IDI催化通用前體物質IPP/DMAPP之間進行異構化,再經過后續的酶催化反應,生成所要的目標產物。MVA途徑中,兩分子的乙酰輔酶A經過一系列的酶的催化作用,生成前體物質IPP,IPP經過IDI的異構化作用,生成其異構體DMAPP;而在MEP途徑中,3-磷酸甘油醛和丙酮酸在一系列酶的作用下,同時生成IPP和DMAPP,IDI作為異構酶,平衡前體物質IPP/DMAPP的量,使得DMAPP在下游酶的作用下,進入目標產物的合成途徑[12],如圖1所示。

圖1　IDI在番茄紅素合成途徑的作用[14]Fig.1　The role of IDI on lycopene biosynthesis pathway[14]

IDI在萜類化合物代謝途徑中起到了至關重要的作用[13],目前工程菌株中強化IDI的策略往往局限在大腸桿菌來源基因idi等少數候選基因。IDI根據序列及催化機理可以分成I型IDI和II型IDI[10]。其中I型IDI分子量較小,約為20 u左右。催化中心為二價金屬離子。II型IDI分子量約為35 u左右。催化活性中心含有FMN等輔基。不同來源IDI在大腸桿菌中的表達特性各不相同,對提高工程菌株中番茄紅素產量的作用也各不相同。仍然有大量不同來源的idi基因沒有得到表征。在本研究中,我們分別對不同種來源的I型及II型idi基因進行異源過表達,對不同來源IDI對工程菌株合成番茄紅素的作用進行系統性研究,為后續萜類化合物代謝途徑的進一步改造優化提供依據。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

克隆宿主菌E.coliDH5α及表達宿主菌E.coliBW25113由中科院微生物所微生物生理與代謝工程院重點實驗室保存;各種質粒由本實驗室提供(具體信息見表1);胰蛋白胨、酵母粉Oxoid公司;DNA 分子量標準、蛋白分子量標準Thermo Scientific公司;TransStart FastPfu DNA聚合酶北京全式金生物技術有限公司;限制性內切酶(NcoⅠ、XhoⅠ等)NEB(北京)公司;質粒提取試劑盒、普通DNA 回收試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒Omega(北京)有限公司;其他試劑國產分析純。

離心機Eppendorf 公司;凝膠成像系統美國BIO-RAD公司;SDS-PAGE 電泳儀美國BIO-RAD公司;UV-Vis(-NIR)分光光度計島津公司(中國)。

1.2實驗方法

1.2.1培養基和溶液的配制LB液體培養基(g/L):1%蛋白胨,0.5%酵母浸粉,1% NaCl。

LB固體培養基(g/L):1%蛋白胨,0.5%酵母浸粉,1% NaCl,1.5%瓊脂粉。

抗生素終濃度:氯霉素17 μg/mL,卡那霉素50 μg/mL,鏈霉素50 μg/mL。

自誘導培養基(g/L):1%蛋白胨,0.5%酵母浸粉。

1000×微量元素:50 mmol/L FeCl3,20 mmol/L CaCl2,10 mmol/L MnCl2,10 mmol/L ZnSO4,CoCl2、NiCl2、Na2MO4、Na2SeO3、H3BO3各 2 mmol/L。

50×M:1.25 mol/L Na2HPO4,1.25 mol/L KH2PO4,2.5 mol/L NH4Cl,0.25 mol/L Na2SO4。

50×5052:25%甘油,2.5%葡萄糖,10%阿拉伯糖。

表1　用于本研究的菌株和質粒

1 mol/L MgSO4:稱取24.6 gMgSO4·7H2O加ddH2O溶解,定溶至 100 mL,高壓滅菌。

自誘導培養基[15]ZYM:在100 mL ZY 培養基中加入 2 mL 50×M,2 mL 50× 5052,200 μL 1 mol/L MgSO4,100 μL 1000×微量元素。

M9培養基:100 mL培養基中含終濃度 2 mmol/L MgSO4,0.1 mmol/L CaCl2,20 mL 5×M9鹽溶液(200 mL溶液中含Na2PO4·7H2O 12.8 g,KH2PO43.0 g,NaCl 0.5 g,NH4Cl 1.0 g)

1.2.2目的基因的克隆以實驗室保存的基因組為模版,按表2中相應的正反向配對引物,使用pfu DNA聚合酶分別擴增得到ecoidi,savidi,scoidi,ptidi,mmidi,bsidi,scidi這幾個目的基因。PCR條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,30個循環;72 ℃ 5 min。

1.2.3目的基因構建到表達載體將載體pSB1s用NcoI和XhoI雙酶切,回收條帶。同樣上述目的基因的PCR產物用相應的限制性內切酶處理,按照表1的描述,將相應的目的基因片段與載體連接[16],轉化E.coliDH5α。涂相應抗性的Str(使用終濃度為50 μg/mL)平板,待長出菌落后挑取克隆鑒定,驗證引物分別pBAD-F/pBAD-R,鑒定正確的送北京睿博興科測序,鑒定正確的重組載體分別命名pSEco、pSSav、pSSco、pSPt、pSBs、pSSc及pSMm(如表1描述)。將載體pSX用NcoI和XhoI雙酶切,回收目的條帶。將相應的目的基因片段與載體連接,按上述過程篩選鑒定得到相應重組質粒pSXEco、pSXSav、pSXSco、pSXPt、pSXBs、pSXSc及pSXMm(如表1描述)。

1.2.4重組菌株的誘導表達及生物轉化在MEP途徑強化菌株PX中表達不同來源的IDI的實驗部分,分別將pSEco、pSSav、pSSco、pSPt、pSBs、pSSc及pSMm與番茄紅素報告質粒pREIBk共轉化入PX菌株,同時在此背景中轉入空載體pSB1s。其中PX菌株以敲除pgi使得糖代謝途徑進入ED途徑以及PP途徑,對MEP的前體物質3-磷酸甘油醛和丙酮酸的量進行平衡[17]。在利用異源的IDI構建高水平合成番茄紅素的工程菌株的實驗部分,分別將pSXEco、pSXSav、pSXSco、pSXPt、pSXBs、pSXSc及pSXMm與番茄紅素報告質粒pREIBk共轉化入PXDF菌株,涂Str、Kan(使用終濃度為50 μg/mL)平板進行篩選培養,得到相應的MEP重組菌株,同時在此背景中轉入空載體pSX。其中PXDF菌株是在菌株PX的背景上,對MEP途徑的關鍵基因靶點ispD、ispF的染色體上的內源啟動子用強的T5啟動子進行替換,而得到的MEP背景強化菌株。

挑取單克隆在新鮮的相應抗性的LB培養基中培養,待OD值到達0.6～0.8,以1%的接種量轉接到5 mL的相應抗性的ZYM培養基中,誘導培養12～14 h,誘導后測OD600,并取30OD誘導后的菌,在4 ℃,4000 r/min的條件下離心,棄去培養基,然后用M9培養基和4% 葡萄糖(總體積3 mL)的轉化液重懸菌體,37 ℃,280 r/min搖床進行生物轉化20 h。分別測定轉化前后番茄紅素產量水平。在對相應工程菌株進行轉化時間的優化時,如前所述,接種工程菌株于自誘導培養基誘導后,轉接于含4%葡萄糖的M9培養基中。分別選取轉化0、8、20 h,進行番茄紅素合成水平的檢測。

1.2.5番茄紅素的測定番茄紅素的測定方法參照Li Chun等[17]。具體操作:對進行生物轉化前后的菌體細胞,分別測定轉化0 h和20 h的OD600,取1×108cfu細胞的培養液離心收集菌體,雙蒸水洗滌菌體一次,于菌體中加入1 mL丙酮,冰上萃取2 h后,13000 r/min,10 min離心,吸取上清液,用分光光度計掃描340～550 nm的吸收光譜,并讀取474 nm處的特征吸收峰值。再根據標準曲線計算番茄紅素的產量。實驗設計三次重復。

表2　用于本研究的引物

注:Restriction sites are underlined.

2　結果與討論

2.1I型IDI與II型IDI的序列分析

選擇大腸桿菌(Escherichiacoli)來源IDI(EcIDI)、阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源IDI(SavIDI)以及天藍鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)來源IDI(ScoIDI)作為原核微生物I型IDI代表;選擇釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)來源IDI(ScIDI)為真核微生物I型IDI的代表;選擇楊樹(Populustomentosa)來源IDI(PtIDI)為植物I型IDI的代表。同時我們選擇了芽孢桿菌(Bacillussubtilis)來源IDI(BsIDI)作為原核微生物II型IDI的代表;選擇了馬氏甲烷八疊球菌(Methanosarcinamazei)來源IDI(MmIDI)為古菌II型IDI的代表。

采用Vector NTI分別對所選擇的I型IDI和II型IDI進行了序列比對分析。結果表明在所選I型IDI中(圖2),SavIDI、ScoIDI、PtIDI、ScIDI與EcoIDI的氨基酸序列一致性分別為43.43%、38.58%、25.93%、36.51%。所有5種I型IDI均含有保守的與催化功能相關的二價金屬離子結合位點。BsIDI與MmIDI二種II型IDI間的氨基酸序列一致性為41.91%。二種II型IDI均含有與FMN輔酶結合的保守氨基酸位點(圖3)。

圖2　I型IDI的序列分析Fig.2　Sequence analysis of type I IDI

圖3　II型IDI的序列分析Fig.3　Sequence analysis of type II IDI

2.2I型IDI及II型IDI的重組表達

為了有利于在代謝工程應用中的不同蛋白間表達平衡,實驗將全部IDI克隆到以pSC101為復制起始位點的低拷貝表達載體pSB1s中。將重組質粒轉入大腸桿菌表達宿主BW25113中。其中在BW25113中轉入pSB1s作為對照。經阿拉伯糖誘導后檢測可溶性表達情況。SDS-PAGE分析結果表明(圖4),所有I型IDI未見明顯可溶性表達帶。這一結果與實驗之前表達EcIDI的結果相一致,表明I型IDI在大腸桿菌中發揮作用與重組蛋白表達量沒有必然關系。來源于枯草芽孢桿菌的II型IDI(BsIDI)可見明顯可溶性表達帶,而MmIDI的表達帶則不明顯,則無法通過SDS-PAGE檢測。

圖4　不同IDI的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of IDIs注：M:蛋白分子量標準；C:對照組pSB1s。

2.3在MEP途徑強化菌株中表達IDI對番茄紅素產量的影響

將上述構建的重組質粒轉入含有番茄紅素合成質粒pREIBk的MEP途徑強化菌株PX中,獲得不同的IDI/PX菌株。在含有阿拉伯糖的自誘導培養基中誘導培養16 h后,在含有4%葡萄糖的M9培養基中轉化20 h。以番茄紅素的產量作為檢測指標,比較不同來源的IDI在MEP背景菌株中對于番茄紅素產量的影響。結果如圖5,在異源表達不同種來源的IDI基因后,重組菌株的番茄紅素產量得到了不同程度的提高。重組表達I型IDI能夠更有效地提高番茄紅素產量。其中,表達SavIDI(阿維鏈霉菌來源)、ScoIDI(天藍鏈霉菌來源)、PtIDI(楊樹來源)的菌株番茄紅素產量要明顯高于其它菌株,番茄紅素產量分別可達6.78、6.59、6.29 mg/g DCW。其中最高的SavIDI比沒有轉化IDI的對照菌株產量(0.69 mg/g DCW)可提高約9倍。

圖5　不同IDI對番茄紅素產量的影響Fig.5　The effects of IDIs on lycopene production

I型IDI對番茄紅素產量的影響為SavIDI>ScoIDI>PtIDI>EcoIDI>ScIDI。而強化II型IDI工程菌株中,番茄紅素產量明顯低于I型IDI強化菌株。其中BsIDI對番茄紅素產量的影響接近I型IDI中的ScIDI,番茄紅素產量為4.41 mg/g DCW,約為對照菌株的6倍。而MmIDI則對番茄紅素產量提高最低,僅提高了約60%。

2.4利用異源IDI構建高水平合成番茄紅素的工程菌株

以上結果表明異源IDI的強化對MEP途徑的強化具有明顯的作用。但合成番茄紅素工程菌株的構建需要在強化IDI的同時,協同強化其它代謝途徑靶點。其中DXS是MEP途徑中另一關鍵性的強化靶點。為了構建高水平合成番茄紅素的大腸桿菌工程菌株,實驗將不同來源的idi基因構建到上游含有大腸桿菌dxs基因的pSB1s載體中。通過協同表達DXS和IDI兩種靶點來進一步提高番茄紅素的合成水平。我們將相關質粒轉化到強化MEP途徑的PXDF菌株中,獲得不同的XI/PXDF菌株。在含有阿拉伯糖的自誘導培養基中誘導培養16 h后收集菌體,轉入含有4%葡萄糖的M9培養基中進行生物轉化。檢測轉化20 h后番茄紅素產量。結果表明(圖6),強化ScIDI的工程菌株獲得了最高的番茄紅素產量,番茄紅素產量可達9.96 mg/g DCW。而強化II型IDI的BsIDI強化菌株番茄紅素產量可達8.78 mg/g DCW。以上結果暗示,I型IDI和II型IDI均可在合成番茄紅素工程菌株中發揮明顯的作用。但其作用不僅與IDI本身的活性有關,同時與DXS等其它靶點強化背景有關。

圖6　不同IDI在工程菌株中的作用Fig.6　The effects of IDIs in engineering strains

2.5工程菌株合成番茄紅素轉化時間的優化

以上結果表明,異源IDI對合成番茄紅素的作用在不同背景下各不相同。為了確定最優的番茄紅素合成條件,我們進一步系統比較了上述工程菌株中分別含有EcoIDI、ScoIDI、SavIDI、PtIDI、ScIDI等5種I型IDI及BsIDI(II型IDI)等6株工程菌株的番茄紅素合成特性。結果表明(圖7),所有6株工程菌株均在8 h時達到番茄紅素的最高積累。其中含有ScIDI的工程菌株番茄紅素產量最高,于轉化8 h時可達10.29 mg/g DCW。以上結果顯示,在進行自誘導培養后,細胞內獲得代謝途徑中一定的酶積累量,在提供生物轉化培養基進行進一步的轉化時,產物呈現逐步積累的狀態,但同時細胞處于生長狀態,隨著轉化的進行,前體物質不斷消耗使得前體物質供應不足,導致在轉化的后期單位細胞的產量有所下降。從而呈現出在8 h 時產量最高的現象。

圖7　轉化時間對番茄紅素產量的影響Fig.7　The effects of bioconversional time on lycopene production

3　結論與討論

異戊烯焦磷酸異構酶(IDI)是合成番茄紅素、β-胡蘿卜素、異戊二烯等萜類化合物的關鍵催化酶類。也是代謝工程對萜類化合物合成途徑改造的最重要的靶點之一。IDI在蛋白質序列及催化機制上可以分成I型與II型,但2種IDI在生物工程改造中促進萜類化合物的各自作用仍然不清楚。Rad S A[11]等報道II型IDI在大腸桿菌工程菌株中更有利于番茄紅素的合成,但由于候選基因過少,并沒有對2類IDI進行系統性比較。在本研究中,我們分別選擇原核微生物、真核微生物、植物、古菌等來源的2類IDI進行了系統性分析,分別通過過表達及與其它靶點的協同作用研究了不同IDI種類在工程菌株的作用。為進一步萜類化合物代謝工程的改造提供了充足的依據。

在代謝工程構建微生物工程菌株過程中,通常過表達單個基因會造成“蛋白質預算”的失衡[18]。有研究表明采用強啟動子、高拷貝復制起始位點蛋白重組表達常用的元件,往往不能達到模塊功能的理想最優狀態。Jones KL等[19]認為強啟動子、高拷貝數質粒往往會在菌株代謝過程中造成代謝壓力,有毒產物積累,同時在菌體內存在穩定性問題,相反,低拷貝質粒能夠通過緩解代謝壓力而對產物水平進行優化。為此我們采用低拷貝的pSB1s表達載體表達IDI,為進一步工程菌株的改造和多靶點蛋白表達的協同優化打下基礎。我們的結果顯示I型IDI在發揮功能時往往不需要過高的表達量,從而減少了對其它靶點的干擾,使這一類IDI成為番茄紅素工程菌株構建時的良好候選酶類。在工程菌株中,來自于釀酒酵母的I型IDI(ScIDI)與來自枯草芽孢桿菌的II型IDI(BsIDI)能夠最有效地促進工程菌株番茄紅素的合成,而在單獨強化IDI時楊樹來源的IDI(PtIDI)則作用最為明顯。這一結果顯示IDI在不同的背景下發揮作用各不相同,可能是由于不同強化靶點疊加時的影響造成的。因此在實際應用過程中需充分考慮啟動子、基因順序等具體的表達手段。

IPP與DMAPP作為萜類化合物合成途徑的通用前體物質,是在IDI作用下的同分異構體,這兩種物質的分配比例會涉及到下游目標產物的合成,因此建立對IPP/DMAPP的含量進行檢測的方法成為一個難點。本研究對于不同來源IDI基因對MEP途徑菌株的番茄紅素的產量的影響,分別從MEP途徑中篩選出具有針對性的較好來源的IDI基因,可以應用于萜類化合物代謝途徑改造的設計,同時也為生產番茄紅素的基因工程菌株的改造提供一定的思路。

[1]Misawa N.Pathway engineering for functional isoprenoids[J].Current opinion in biotechnology,2011,22(5):627-633.

[2]Bochar D A,Stauffacher C V,Rodwell V W.Sequence comparisons reveal two classes of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase[J].Molecular Genetics and Metabolism,1999,66(2):122-127.

[3]Hedl M,Tabernero L,Stauffacher C V,et al.Class II 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductases[J].Journal of Bacteriology,2004,186(7):1927-1932.

[4]Kuzuyama T.Mevalonate and nonmevalonate pathways for the biosynthesis of isoprene units[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2002,66(8):1619-1627.

[5]Rodríguez-Concepción M,Boronat A.Elucidation of the methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids.A metabolic milestone achieved through genomics[J].Plant Physiology,2002,130(3):1079-1089.

[6]Martin V J J,Pitera D J,Withers S T,et al.Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids[J].Nature Biotechnology,2003,21(7):796-802.

[7]Ajikumar P K,Xiao W H,Tyo K E J,et al.Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli[J].Science,2010,330(6000):70-74.

[8]Lv X,Xu H,Yu H.Significantly enhanced production of isoprene by ordered coexpression of genes dxs,dxr,and idi in Escherichia coli[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(6):2357-2365.

[9]Zurbriggen A,Kirst H,Melis A.Isoprene production via the mevalonic acid pathway in Escherichia coli(Bacteria)[J]. BioEnergy Research,2012,5(4):814-828.

[10]Berthelot K,Estevez Y,Deffieux A,et al.Isopentenyl diphosphate isomerase:A checkpoint to isoprenoidbiosynthesis[J].Biochimie,2012,94(8):1621-1634.

[11]Rad S A,Zahiri H S,Noghabi K A,et al.Type 2 IDI performs better than type 1 for improving lycopene production in metabolically engineered E. coli strains[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,28(1):313-321.

[12]de Ruyck J,Wouters J,Poulter C D.Inhibition Studies on Enzymes Involved in Isoprenoid Biosynthesis:Focus on Two Potential Drug Targets:DXR and IDI-2 Enzymes[J].Current Enzyme Inhibition,2011,7(2).

[13]Zhou C,Li Z,Wiberley-Bradford A E,et al.Isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate/isopentenyl diphosphate ratio measured with recombinant isopentenyl diphosphate isomerase and isoprene synthase[J].Analytical Biochemistry,2013,440(2):130-136.

[14]Yoon S H,Kim J E,Lee S H,et al.Engineering the lycopene synthetic pathway in E. coli by comparison of the carotenoid genes of Pantoea agglomerans and Pantoea ananatis[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,74(1):131-139.

[15]Studier F W.Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures[J].Protein Expression and Purification,2005,41(1):207-234.

[16]Gibson D G,Young L,Chuang R Y,et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J]. Nature Methods,2009,6(5):343-345.

[17]Li C,Ying L Q,Zhang S S,et al.Modification of targets related to the Entner-Doudoroff/pentose phosphate pathway route for methyl-d-erythritol 4-phosphate-dependent carotenoid biosynthesis in Escherichia coli[J].Microbial Cell Factories,2015,14(1):117.

[18]劉偉豐,陶勇. 蛋白質預算:合成生物學的成本標尺[J]. 生物工程學報,2013,29(8):1123-1132.

[19]Jones K L,Kim S W,Keasling J D.Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic engineering of bacteria[J].Metabolic Engineering,2000,2(4):328-338.

Screening of isopentenyl diphosphate isomerase(IDI) in engineeringEscherichiacolistrains for lycopene production

HAN Li1,2,ZHANG Sha-sha2,WANG Bo-jun3,LIU Jing-guo3,LIU Wei-feng2,*,WANG Yan-ping1,*,TAO Yong2

(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China;3.College of Biological Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

Lycopene is a terpenoid pigment that has diverse applications in the fields of food and medicine. A prospective approach for lycopene production is by metabolic engineering in microbial hosts such asEscherichiacoli. Isopentenyl diphosphate isomerase(IDI)is the key enzyme in lycopene biosynthetic pathway,and one of the most important targets during metabolic engineering. In this study,in order to systematic compare the effects of different IDI on lycopene production,the type1 and type2 genes of isopentenyl diphosphate isomerase were cloned from different species,including prokaryotic microbe,eukaryotic microbe,plant,archaea,and heterologous expressed inEscherichiacoli. The effects of different IDI on lycopene production and the bioconversional conditions were investigated in a MEP-enhanced background inEscherichiacoli. In the result,ScIDI and BsIDI were the most efficient IDI species for lycopene production and the yield of lycopene rose to 9.96 mg/g DCW,8.78 mg/g DCW. As observed after bioconversion for 8 h,the yield of lycopene was up to a maximum of 10.29 mg/g DCW. The results will provide new information for further metabolic engineering study involved in lycopene and terpenoid production.

isopentenyl diphosphate isomerase(IDI);Escherichiacoli;lycopene;metabolic engineering;MEP pathway

2015-11-03

韓莉(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學，代謝工程，E-mail：hanlireal@163.com。

劉偉豐(1976-)，男，博士，助理研究員，研究方向：代謝工程，E-mail：liuwfv@im.ac.cn。

王艷萍(1962-)，女，博士，教授，研究方向：食品科學、生物技術，E-mail：ypwang@tust.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31170038)；中國科學院重點部署項目(KSZD-EW-Z-016-1)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)13-0137-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.019