基于COⅠ基因序列的11種蛀莖害蟲的分子鑒定

吳　敏,　韓盛楠,2,　陳　陽,　王康旭,　韓召軍*

(1. 南京農業大學植物保護學院, 南京　210095; 2. 皇崗出入境檢驗檢疫局, 深圳　518000)

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基于COⅠ基因序列的11種蛀莖害蟲的分子鑒定

吳敏1,韓盛楠1,2,陳陽1,王康旭1,韓召軍1*

(1. 南京農業大學植物保護學院, 南京210095; 2. 皇崗出入境檢驗檢疫局, 深圳518000)

本研究克隆了二化螟(Chilosuppressalis)、臺灣稻螟(C.auricilius)、蘆苞螟(C.luteellus)、甘蔗條螟(C.sacchariphagus)、三化螟(Tryporyzaincertulas)、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、甘蔗紅尾白螟(Scirpophagaexcerptalis)、黃紋髓草螟(Calamotrophapaludella)、桃蛀螟(Conogethespunctiferalis)、棘禾草螟(Chilohyrax)和稻蛀莖夜蛾(Sesamiainferens) 11種常見蛀莖害蟲102個個體的線粒體DNA細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因片段。序列分析顯示:該COⅠ基因片段長為709 bp,序列都未發生缺失或插入現象,堿基顛換率(55.42%)高于轉換率(44.58%);種間遺傳距離平均值為0.140(0.088～0.179),種內遺傳距離平均值為0.004(0～0.015), 兩者之間沒有重疊區域;聚類分析表明,不同種蛀莖害蟲分別形成獨立的進化分支,分支自展值均為100%。研究結果表明該COⅠ基因序列具有適宜的變異信息,種內相對保守,種間變異顯著,適用于蛀莖害蟲的物種識別,并為開發蛀莖害蟲DNA條形碼技術奠定了基礎。

蛀莖害蟲;線粒體COⅠ基因;分子鑒定

蛀莖害蟲是以蛀莖稈方式為害禾本科植物的鱗翅目害蟲,除了稻田中常見的二化螟[Chilosuppressalis(Walker)]、三化螟[Tryporyzaincertulas(Walker)]、稻蛀莖夜蛾(舊稱大螟)[Sesamiainferens(Walker)]和臺灣稻螟[Chiloauricilius(Dudgeon)]外,還有其他禾本科植物蛀莖害蟲。它們的棲境、形態和為害方式類似。生產上通過田間調查監測幼蟲、蛹、卵以及成蟲來準確預測害蟲的發生期、發生量,并選擇適當防治措施進行及時防控。因此,準確鑒定蛀莖害蟲的種類是防治的關鍵。

目前蛀莖害蟲的鑒定主要依據形態特征,包括體型、體色、翅面斑紋、翅脈、生殖器形狀等;幼蟲則主要依據腹足、背線、體色、毛片等;卵的特征主要是形狀、產卵方式和位置、卵塊的性質和卵的排列方式等;蛹的鑒定特征較少。此外,水稻重要螟蟲與近似種的差異通常很細微,例如, 稻田常見的臺灣稻螟幼蟲與二化螟的幼蟲極為相似,僅有前胸背板顏色略有差異,鑒別主要依靠前胸氣門附近的毛片相對于氣門上線的位置;而蘆禾草螟的成蟲在體型、形態上與二化螟也非常相似,僅體色略有差異,詳細區分需要檢查翅脈和生殖器。

由于昆蟲的傳統形態學分類鑒定專業性強,對材料要求較高。此外,大多數昆蟲在不同的發育階段形態結構變化很大,同種昆蟲也會因為地理分布不同產生形態差異,因此根據形態學直接進行昆蟲鑒定有時會比較困難,尤其是近緣種的幼體(卵、幼蟲、蛹),形態非常相似,很難對其進行快速、準確的鑒定。更重要的是,許多分類記錄種和次要害蟲,僅有成蟲形態描述,難以對不同蟲態進行準確判斷。因此,生產上迫切需要簡便的蛀莖害蟲鑒定技術。

2002年Tautz等基于分子生物學和網絡技術的發展, 提出DNA分類的概念[1],即以DNA序列為主體構建DNA分類系統平臺,對生物進行鑒定分類。隨后Hebert等對不同類群動物的線粒體DNA細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)進行了堿基序列和氨基酸序列分析,認為線粒體COⅠ序列可以作為動物物種鑒定的核心序列,并構建了COⅠ動物物種鑒定系統[2]。目前已有報道表明,利用線粒體COⅠ基因序列對不同類群昆蟲的種,甚至種下類群均可以進行有效的鑒定[3-10]。因此,本研究通過探討基于線粒體COⅠ基因序列的DNA分子鑒定方法用于蛀莖害蟲分類的可行性,確定適宜的DNA片段,建立蛀莖害蟲的快速識別的技術,對蛀莖害蟲的準確預測預報和及時防治具有重要意義。

1　材料與方法

1.111種蛀莖害蟲的采集和鑒定

采用受害植株剝查法采集幼蟲,運用形態學知識通過鏡檢幼蟲和飼養羽化的成蟲進行鑒定。在水稻、蘆葦、甘蔗和玉米等多種禾本科寄主植物上采集二化螟(浙江溫嶺)、臺灣稻螟(廣東廣州)、蘆苞螟[Chiloluteellus(Motschulsky)](江蘇南京)、甘蔗條螟(ChilosacchariphagusBojer)(廣東廣州)、稻蛀莖夜蛾(江蘇南京)、三化螟(廣東廣州)、亞洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)](湖北襄陽)、甘蔗紅尾白螟(ScirpophagaexcerptalisWalker)(廣東廣州)、黃紋髓草螟(CalamotrophapaludellaHübner)(湖北大冶)、桃蛀螟[Conogethespunctiferalis(Guenée)](江蘇南京)和棘禾草螟(ChilohyraxBleszynski)(湖北石首)等11種蛀莖害蟲,共102頭。其中, 稻蛀莖夜蛾屬于夜蛾科(Noctuidae), 其余昆蟲都是草螟科(Crambidae)害蟲。

1.2基因組DNA的提取和PCR擴增

采用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒分別提取102頭昆蟲的基因組DNA。利用上游引物LCO-1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′) 和下游引物HCO-2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)[11]對102個基因組DNA模板分別進行PCR擴增, 使用rTaqDNA聚合酶進行PCR反應:94℃預變性3 min;94℃變性1 min,退火1 min,72℃延伸1 min。循環39次;最后72℃延伸10 min,12℃保持。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的條帶,進一步連接轉化,經菌液PCR檢測后,取適量送至上海英駿公司進行測序。

1.3COⅠ基因序列分析

用Gene-Explorer 對所測得的基因序列進行手工校正,校正后用NCBI 中的BLAST 軟件進行相似性檢索,驗證所測序列是線粒體COⅠ基因片段。將確認后的序列載入ClustalX2 軟件[12]進行序列比對,輸出格式為FASTA。將比對結果導入MEGA 5.0 軟件中[13],計算序列的保守位點(conserved sites,C)、變異位點(variable sites,V)及簡約信息位點(parsim-informative sites,Pi)數和單突變位點數,并分析其堿基組成及轉換顛換率,計算各物種間和種內的遺傳距離;同時構建基于遺傳距離模型Kimura 2-parameter 的鄰接法(neighbor-joining,NJ)系統發育進化樹。

2　結果與分析

2.1COⅠ基因序列分析

以102個昆蟲基因組DNA為模板,分別進行COⅠ基因片段擴增,克隆獲得了102條709 bp的目的片段,經BLAST比對,證實這些片段均為線粒體COⅠ基因序列。102條COⅠ基因序列中未發生缺失或插入現象,保守位點有465個,變異位點有244個,簡約信息位點221個,單突變位點23個。所有位點中各堿基平均含量分別為:T(30%)、C(15.3%)、A(38.6%)、G(16.1%),其中A+T的含量(68.6%)明顯高于G+C的含量(31.4%),符合昆蟲線粒體堿基組成的基本特征[14]。

11種蛀莖害蟲COⅠ基因序列的堿基顛換率(transversion,Tv/Tv+Ts)為55.42%, 明顯高于轉換率(transition,Ts/Tv+Ts) 44.58%,轉換/顛換偏倚率R值(Ts/Tv)為0.8。堿基的轉換以AG為主(75.68%),少數為TC間的轉換(24.32%);顛換主要發生在TA間(78.26%),其他TG、CA和CG分別占顛換總數的13.04%、6.52%和2.17%(見表1)。由于物種間的親緣關系越近堿基轉換率越高,親緣關系越遠則物種間堿基替換率越高[15-16],因此,該COⅠ基因片段能夠真實體現不同蛀莖害蟲間親緣關系的遠近。

表1　11種蛀莖害蟲COⅠ基因片段堿基替換1)

1) ii:一致序列;Ts:轉換數;Tv:顛換數;R:Ts/Tv;TT:一致堿基T;TC:TC間轉換;TA:TA間顛換;TG:TG間顛換;CC:一致堿基C;CA:CA間顛換;CG:CG間顛換;AA:一致堿基A;AG:AG間轉換;GG:一致堿基G;Avg:平均頻率;1st第1 位點;2nd:第2 位點;3rd:第3 位點。

ii: Identical pairs;Ts: Transition;Tv: Transversion;R:Ts/Tv; TT: T Identical base T; TC: TC transition; TA: TA transversion; TG: TG transversion; CC: Identical base C; CA: CA transversion; CG: CG transversion; AA: Identical base A; AG: AG transition; GG: Identical base G; Avg: Average frequency; 1st: The first position; 2nd: The second position; 3rd: The third position.

2.2種內和種間遺傳距離

基于Kimura 2-parameter 模型分析,計算不同蛀莖害蟲種內及種間的遺傳距離,采用bootstrap(1 000 次)進行檢驗[17],結果如表2 所示,11種不同蛀莖害蟲種間遺傳距離介于0.088～0.179之間,平均值為0.140。其中,二化螟和蘆苞螟之間的遺傳距離最小(0.088),其次是蘆苞螟和臺灣稻螟(0.098);甘蔗紅尾白螟和棘禾草螟之間遺傳距離值最大(0.179)。11種蛀莖害蟲種內遺傳距離介于0～0.015 之間,平均值為0.004,符合種內遺傳距離的大小。此外,種間遺傳距離為種內遺傳距離的35倍; 而且種內遺傳距離與種間遺傳距離沒有重疊區域,完全符合DNA 條形碼有效性的檢驗標準[18]。

表2　11種不同蛀莖害蟲的種間和種內遺傳距離1)

1) DM: 稻蛀莖夜蛾; JHCM: 棘禾草螟; Y: 亞洲玉米螟; TZM: 桃蛀螟; HWSCM: 黃紋髓草螟; TM: 甘蔗條螟; L: 蘆苞螟; ER: 二化螟; BM: 甘蔗紅尾白螟; TW: 臺灣稻螟; S: 三化螟。DM:Sesamiainferens; JHCM:Chilohyrax; Y:Ostriniafurnacalis;TZM:Conogethespunctiferalis;HWSCM:Calamotrophapaludella;TM:Chilosacchariphagus;L:C.luteellus;ER:C.suppressalis;BM:Scirpophagaexcerptalis;TW:Chiloauricilius;S:Tryporyzaincertulas.

2.3系統發育樹分析

以11種蛀莖害蟲COⅠ基因序列為靶標,以鄰接法構建系統發育樹。聚類分析結果表明, 每種蛀莖害蟲分別形成獨立的進化分支,而且最初分支自展值均為100% (見圖1)。聚類結果也反映了物種間的親緣關系,例如,二化螟與蘆苞螟是近緣種,兩個物種的進化分支聚集在一起。 由此可見,蛀莖害蟲COⅠ基因序列具有足夠的遺傳變異性和分化度,既可以區分不同的蛀莖害蟲,同時種內相對保守。

圖1　鄰接法構建的11種蛀莖害蟲基于COⅠ基因的系統發育樹Fig.1　Neighbor-joining tree of the 11 borer species based on the COⅠgene sequences

3　討論

目前生產上蛀莖害蟲的鑒定主要依靠傳統的形態分類學,形態分類是建立在形態特征的分析與比較上的方法。然而,由于外部形態特征都是昆蟲體內遺傳物質被表達后的結果,往往會受到周圍環境和發育時期的影響。因此,建立一種基于體內遺傳物質的分子鑒定新技術可以彌補當前蛀莖害蟲形態學分類的不足。

Hebert等對動物界,包括脊椎動物和無脊椎動物共11門13 320個物種的COⅠ基因序列的比較分析得出:除刺胞動物外,其余98%的物種遺傳距離的差異在種內為0～0.002,種間平均遺傳距離可達到0.113[2]。由于該序列能夠很好地區分不同的物種,確定了其在動物鑒定中的作用。因此,本文探討了利用COⅠ基因序列進行蛀莖害蟲分子鑒定的可行性。

針對本研究涉及的常見蛀莖害蟲亞洲玉米螟、桃蛀螟和三化螟,已有文獻報道了不同的地理種群的同種個體內基因交流頻繁,沒有顯著的遺傳分化[19-21];我們已有的研究結果也表明,不同地理種群的55頭二化螟和180頭稻蛀莖夜蛾的種內遺傳分化距離分別為0.009和0.029,該距離遠沒有達到種間0.113的標準,因此仍然屬于同一個種,只是在某些地區間出現了很微弱的遺傳變異[22-23]。通過進一步擴大本研究中其他6種試蟲棘禾草螟、臺灣稻螟、蘆苞螟、甘蔗條螟、甘蔗紅尾白螟和黃紋髓草螟的采集地點和取樣量,是建立和完善DNA條形碼技術進行害蟲分子鑒定所必需的。

此外,通過搜索已發表文獻和NCBI上已登錄的其他蛀莖害蟲基因發現,褐邊螟(CatagelaadjurellaWalker)、稻雪禾螟[Niphadosesgilviberbis(Zeller)]、軸禾草螟[Chilopolychrysus(Meyrick)] 和地中海玉米蛀莖夜蛾[Sesamianonagrioides(Lefebvre)]的COⅠ序列已經被克隆并登錄至NCBI 數據庫[24-25]。因此,如果研究者繼續收集尚未研究過的田間蛀莖害蟲,例如燈草雪禾螟(Niphadosesdengcaolites)、茭白禾草螟(Chilozizaniae)、二點螟 (Chiloinfuscatellus)、稷螟(Chilopanici)、列星大螟(Sesamiavuteria)和列點大螟(Sesamiauniformis)等昆蟲,繼續探討在上述昆蟲中COⅠ基因序列作為DNA分子鑒定的可行性,最終將建立起所有蛀莖害蟲的標準DNA序列庫,建立蛀莖害蟲DNA條形碼技術,為我國的害蟲測報提供可靠的蛀莖害蟲鑒定方法。該方法的建立能夠解決目前生產上常見蛀莖害蟲近似種難以通過形態進行鑒定的問題;解決蛀莖害蟲因不同地理分布和不同發育階段產生不同形態而難以鑒定的問題;解決蛀莖害蟲幼蟲、卵和蛹以及不完整標本進行準確鑒定的問題;解決缺乏特定的昆蟲分類專家進行鑒定蛀莖害蟲的問題,對保護農業生產安全具有重要意義。

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(責任編輯：田喆)

Molecular identification of 11 stem borer species based on the mitochondrialCOⅠ gene

Wu Min1,Han Shengnan1,2,Chen Yang1,Wang Kangxu1,Han Zhaojun1

(1. College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing210095, China;2. Huanggang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen518000, China)

Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COⅠ) gene sequences of 102 larvae from 11 different borer species (Chilosuppressalis,C.auricilius,C.luteellus,C.sacchariphagus,Sesamiainferens,Tryporyzaincertulas,Ostriniafurnacalis,Scirpophagaexcerptalis,Calamotrophapaludella,ConogethespunctiferalisandChilohyrax) were cloned, respectively. Sequence analysis revealed that theseCOⅠgene fragments were 709 bp in length, and no insertion and deletion occurred in each fragments. The rate of base transversion was higher than that of base transition. The average inter-species genetic distance was 0.140 (0.088-0.179), and the average intra-species genetic distance was 0.004 (0-0.015). There was no overlap between the two items of data. The cluster analysis showed that different borer species formed independent evolutionary branch, and the branch bootstrap values were 100%. These results proved that the clonedCOⅠ gene contains suitable information of genetic variation. It conserves within species, and varies well between species. Thus, it should be a suitable barcoding DNA fragment for identification of the borer species in fields.

stem borer;mitochondrialCOⅠgene;molecular identification

2015-08-26

2015-09-21

公益性行業(農業)科研專項(201303017)

E-mail: zjhan@njau.edu.cn

S 435.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.014

致謝：感謝廣東省農科院張揚研究員、廣州甘蔗糖業研究所龔恒亮研究員、廣西壯族自治區農科院植保所龍麗萍所長、湖北省農科院呂亮副研究員、湖南省農科院植保所彭兆普研究員、貴州大學楊洪副教授、四川省農科院李曉研究員、安徽省農科院胡本進老師、江西省農科院黃水金研究員、江蘇吳江市植保站朱福官站長等對本研究提供的熱情幫助與支持。