苜蓿毀滅刺盤孢菌的主要生物學特性

馬甲強,　王生榮,　袁慶華,　王　瑜

(1. 甘肅農業大學草業學院, 蘭州　730070; 2. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所, 北京　100193)

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苜蓿毀滅刺盤孢菌的主要生物學特性

馬甲強1,2,王生榮1*,袁慶華2*,王瑜2

(1. 甘肅農業大學草業學院, 蘭州730070; 2. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所, 北京100193)

苜蓿炭疽病是各苜蓿種植區分布較廣的毀滅性病害。毀滅刺盤孢(Colletotrichumdestructivum)是苜蓿炭疽病的主要病原菌之一。本試驗研究了培養基、碳源、氮源、溫度、pH、光照、濕度對毀滅刺盤孢菌菌絲生長、分生孢子產生和萌發的影響。結果表明:該菌菌絲適宜生長的培養基為PDA、PSA和V-8汁;適宜溫度范圍為28～36℃,最適溫度為32℃;適宜pH范圍為4～6。該病菌在PDA培養基上,分別以麥芽糖和蛋白胨為碳、氮源,在28℃,pH 6的條件下培養時其產孢能力最強。孢子萌發的最適碳、氮源分別為可溶性淀粉和牛肉膏、蛋白胨;最佳溫度28℃;最適pH為6。相對濕度98%以上有利于孢子的萌發。持續光照利于菌絲生長、產孢和萌發。

苜蓿炭疽病;毀滅刺盤孢;生物學特性

紫花苜蓿(Medicagosativa)是苜蓿屬內栽培面積最大的多年生豆科牧草,享有“牧草之王”之美譽。它富含蛋白質、具有高產量、適口性好等飼用價值,已成為我國畜牧發展中不可替代的重要飼料作物[1]。然而,隨著苜蓿種植面積的擴大,種植年限的增加,病害問題越來越嚴重,其中苜蓿炭疽病(alfalfa anthracnose)在世界各地苜蓿種植區分布較廣,可造成苜蓿毀滅性損失。1947年,美國南部報道了此病的危害[2],之后世界許多國家和地區也陸續報道[3-7]。近年來我們課題組在吉林、黑龍江、內蒙古、河北等省區進行苜蓿病害調查時發現,苜蓿炭疽病發病程度逐年增加,危害加重。該病發生后苜蓿葉片、莖部及根部均被侵染,發病嚴重時枝條枯萎,苜蓿減產達25%～30%[7]。目前已報道的能引起苜蓿炭疽病的炭疽菌有7種,分別是三葉草刺盤孢(Colletotrichumtrifolii)、毀滅刺盤孢(C.destructivum)、平頭刺盤孢(C.truncatum)、球狀刺盤孢(C.coccodes)、束狀刺盤孢(C.dematium)、亞麻刺盤孢(C.linicola)和C.americae-borealis[3-4,8,10]。其中,毀滅刺盤孢對苜蓿致病性強,它不僅能夠侵染多種豆科牧草,還能侵染禾本科、菊科等12科植物[5, 9-13]。目前該菌在我國煙草上相關報道較多[14-16],我國學者劉若[17]在吉林紫花苜蓿病害調查時發現了此菌,之后該菌引起苜蓿炭疽病的國內報道較少,而且對苜蓿毀滅刺盤孢的生物學特性研究鮮見報道。因此,本文對苜蓿毀滅刺盤孢的生物學特性進行系統研究,了解其菌絲和孢子生長所需營養物質和適宜的環境條件,以期為苜蓿炭疽病的綜合防治提供理論依據。

1　材料與方法

1.1病原菌的來源

苜蓿炭疽病病葉樣本采集于吉林白城,按照常規組織分離法[18]分離,并經過純化、單孢分離后獲得純菌株,通過形態學和ITS-rDNA序列分析結合鑒定為毀滅刺盤孢(Colletotrichumdestructivum)[7,10,19]。選取具有代表性的菌株J-4供生物學特性研究。

1.2生物學特性測定

1.2.1不同培養基對菌絲生長及產孢量的影響

將J-4菌株進行菌種活化,然后取菌餅(d=0.5 cm)分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)、水瓊脂(WA)、查氏(Czapek)、胡蘿卜瓊脂(CA)、燕麥片瓊脂(OMA)、玉米粉瓊脂(CMV)、V-8汁(V-8汁200 mL、CaCO32 g、瓊脂17 g、定容至1 000 mL)、米飯瓊脂(米飯200 g,水浴過濾、瓊脂17 g、定容至1 000 mL)、番茄瓊脂(番茄200 g、瓊脂17 g、定容至1 000 mL)和番茄+燕麥片(番茄200 g、燕麥片30 g、瓊脂17 g、定容至1 000 mL)培養基[20]平板中央(d=9 cm)。然后放入25℃恒溫黑暗培養箱中培養。每個處理3次重復,7 d后用十字交叉法測定菌落直徑,計算菌落凈生長量,15 d后用血球計數板測定產孢量[18]。

1.2.2不同碳源對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

試驗以真菌生理培養基(氮源1 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、碳源5 g、瓊脂12 g、蒸餾水1 000 mL)[21]為基礎,硝酸鉀為氮源,分別用相同含碳量的可溶性淀粉、半乳糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇,配制成7種不同碳源的培養基,以不加碳源為對照,每個處理3次重復。孢子萌發測定,先配制與1%葡萄糖溶液中含碳量相同的可溶性淀粉、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇溶液,然后分別用上述溶液配制孢子懸浮液。采用凹玻片萌發法[18],用移液槍吸取50 μL孢子懸浮液滴于凹玻片上,25℃恒溫黑暗培養9 h后時觀察100個分生孢子,統計分生孢子萌發數和孢子總數,計算分生孢子的萌發率。每個處理3次重復。

1.2.3不同氮源對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

以真菌生理培養基為基礎,葡萄糖為碳源,分別加入硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨、尿素、蛋白胨、牛肉膏、硝酸銨各1 g配成7種不同氮源的培養基。以不加氮源為對照,每處理3次重復。孢子萌發測定以0.5%的量加入硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨、尿素、蛋白胨、牛肉膏、硝酸銨配成孢子懸浮液。采用1.2.1和1.2.2的方法測定菌落直徑、產孢量和孢子萌發率。

1.2.4不同溫度對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

將病原菌菌餅(d=0.5 cm)接種到PSA平板中央,分別置于4、8、12、16、20、24、28、32、36、40℃等10個不同溫度梯度下黑暗培養。每處理3次重復。采用1.2.1測定方法測定菌絲生長和產孢量。孢子萌發采用水瓊脂玻片法[18],將孢子懸浮液滴在水瓊脂玻片上,置于帶有濕濾紙的培養皿中,然后放在不同溫度的恒溫培養箱培養。采用1.2.2統計方法計算孢子萌發率。

1.2.5不同 pH對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

以PSA為基礎培養基[20],用0.1% NaOH和0.1% HCl溶液調配培養基酸堿度,pH分別設置為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共11個梯度,每處理3次重復。采用1.2.1和1.2.2的方法測定菌落直徑、產孢量和孢子萌發率。

1.2.6不同光照對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

以PSA為基礎培養基[20],分別放置在持續光照、持續黑暗、光暗交替的培養箱內。每處理3次重復。采用1.2.1和1.2.2的方法測定菌落直徑、產孢量和孢子萌發率。

1.2.7不同濕度對孢子萌發的影響

在干燥器內配制不同濃度硫酸溶液和飽和鹽溶液[18]控制相對濕度,設相對濕度梯度為50%、65%、75%、86%、90%、98%,以水滴中孢子萌發率為對照,將孢子懸浮液(約100個/視野)直接涂于玻片上,每個處理3次重復。置于25℃黑暗培養12 h后統計孢子萌發率。

1.3數據分析

各試驗數據采用SPSS(19.0)軟件進行方差分析,Excel(2010版)程序繪圖。

2　結果與分析

2.1不同培養基對菌絲生長、產孢量的影響

不同培養基對菌絲生長具有顯著的影響(P<0.05),在PDA、PSA和V-8液汁培養基上菌絲生長速度快,菌絲較稠密,菌落表面小黑點(分生孢子盤)相對較多;在水瓊脂和查氏培養基上菌絲生長速度最慢,說明水瓊脂和查氏培養基不適宜此菌的生長。從產孢量來看,不同培養基間也存在顯著差異(P<0.05),其中PDA培養基產孢量最大,為1.5×106個/mL,顯著高于其他培養基的產孢量;其次是PSA和V-8汁,分別為3.8×105個/mL和2.3×105個/mL;胡蘿卜和番茄燕麥培養基產孢量少,而其余培養基均不產孢(圖1)。

圖1　不同培養基對菌絲生長和產孢量的影響Fig.1　Effects of media on mycelium growth and spore production

2.2不同碳源對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

不同碳源對菌絲生長有顯著的影響(P<0.05),菌絲在蔗糖、甘露醇、不加碳源的對照、可溶性淀粉和葡萄糖的培養基上生長較快,而在半乳糖和果糖培養基上生長較慢,在甘露醇和半乳糖培養上的生長速率分別是1.0、0.6 cm/d,甘露醇培養基上的生長速率是半乳糖培養基上的生長速率的1.7倍。從產孢量來看,不同碳源間產孢量也存在顯著差異(P<0.05),其中麥芽糖培養基產孢量最高,達6.8×106個/mL,并且與其他碳源培養基之間存在顯著差異。而半乳糖培養基產孢量最少,僅2.2×105個/mL(圖2a)。7種碳源溶液對分生孢子萌發與對照相比存在顯著差異(P<0.05),其中最適合分生孢子萌發的碳源為可溶性淀粉,其次是果糖、葡萄糖和麥芽糖,總體來說7種碳源對分生孢子的萌發均有促進作用(圖2b)。

2.3不同氮源對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

在含蛋白胨和KNO3的培養基上菌絲生長速度最快,其次是尿素和牛肉膏培養基,并且在這4種培養基上菌絲生長速度顯著高于對照(P<0.05),而在 (NH)2SO4和NH4Cl培養基上菌絲生長速度最慢,明顯低于對照;從產孢量來看,蛋白胨培養基上產孢量最大,顯著高于其他氮源的產孢量,其次是KNO3和尿素培養基,產孢量少的是NH4Cl和(NH)2SO4培養基,在不加氮的CK培養基上不產生孢子(圖3a);不同氮源對分生孢子的萌發有顯著影響(P<0.05),蛋白胨和牛肉膏溶液對孢子萌發有明顯的促進作用,可使孢子萌發率達50%以上,其次是(NH)2SO4和NH4NO3溶液,而在NH4Cl溶液中孢子萌發率最低,僅為14.5%,顯著低于對照(圖3b)。

圖2　不同碳源對菌絲生長、產孢量和分生孢子萌發的影響Fig.2　Effects of carbohydrates on mycelium growth,spore production and germination

圖3　不同氮源對菌絲生長、產孢量和分生孢子萌發的影響Fig.3　Effects of nitrogen sources on mycelium growth, spore production and germination

2.4不同溫度對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

不同培養溫度對菌絲生長有顯著的影響(P<0.05),菌絲體可在8～36℃之間生長,適宜的生長溫度范圍為24～36℃,最適生長溫度為32℃。該病菌在8～36℃均可產生分生孢子,適宜產孢的溫度范圍為24～32℃,最適產孢溫度為28℃,在此溫度下產孢量達5.9×106個/mL,顯著高于其他溫度處理(圖4a)。不同溫度處理對分生孢子萌發率的影響存在顯著差異(P<0.05),隨著溫度的升高分生孢子萌發率呈現上升趨勢,當溫度達到28℃時,分生孢子萌發率達到最高,為62.0%,之后隨著溫度的增加萌發率出現明顯的下降趨勢,當溫度達到40℃時,孢子不能萌發(圖4b)。

2.5不同pH對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

菌絲在pH 3～11范圍內均可生長(圖5a),其中以pH4～5時最適合菌絲的生長,在此范圍內菌落直徑及日生長量都達到最大,其次是pH6、7和8,當pH值低于3或高于11時,不能形成成熟的菌落,不適合菌絲生長。從產孢量來看,pH 3～10時均可產生分生孢子,其中pH為6時,產孢量最大,顯著高于其他pH的產孢量(P<0.05)。不同pH對分生孢子萌發有顯著的影響(P<0.05),在pH 3～12范圍內分生孢子均可萌發,適宜分生孢子萌發的pH范圍為5～7,萌發率達到38.2%以上,以pH為6時萌發率最高,達47.6%,當pH值小于3的條件下,孢子萌發率不足20.0%,不適宜病菌萌發(圖5b)。

2.6不同光照對菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

不同光照條件對菌絲生長、產孢量及孢子萌發率有顯著的影響(P<0.05),在持續光照條件下菌落直徑、產孢量及分生孢子萌發率均顯著高于其他處理(P<0.05),持續光照處理菌落直徑、產孢量及孢子萌發率分別比持續黑暗處理高12.5%、82.0%、50.2%,比黑暗交替處理高7.8%、80.4%、44.8%。說明該病原菌對光照比較敏感,菌絲生長,孢子萌發及產孢均喜歡持續的光照(表1)。

圖4　不同溫度對菌絲生長、產孢量和分生孢子萌發的影響Fig.4　Effects of temperature on mycelium growth, spore production and germination

圖5　pH對菌絲生長、產孢量和分生孢子萌發的影響Fig.5　Effects of pH on mycelium growth,spore production and germination

處理方式Treatment菌落直徑/cmColonydiameter產孢量/105個·mL-1No.ofspores孢子萌發率/%Germinationrate持續黑暗Continuousdark5.6b2.3b31.3b黑暗交替Alternatinglightanddark5.9b2.5b34.7b持續光照Continuouslight6.4a12.8a62.9a

1) 同列數據后不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。

The lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

2.7濕度對孢子萌發的影響

該病菌分生孢子在相對濕度50%和75%的條件下均不能萌發,在相對濕度為86%、90%時萌發率仍較低,分別為3.3%、8.9%,在相對濕度98%條件下萌發率達37.9%,在水滴中的萌發率最高,達54.6%(表2)。

表2　濕度對孢子萌發的影響

3　結論與討論

苜蓿毀滅刺盤孢菌的生物學特性很少有文獻報道,本文就其菌絲生長、產孢和孢子萌發條件等生物學特性作了較深入的研究。結果表明,PDA、PSA、V-8液汁培養基對菌絲生長和產孢均有促進作用,尤其是在PDA培養基上產孢量最高,這與田華等[16]的研究結果一致。說明PDA是苜蓿毀滅刺盤孢的最佳培養基。本研究還發現苜蓿毀滅刺盤孢在單獨有燕麥片或番茄的培養基上均不產孢,且菌絲稀疏,但將兩者混合后,其菌絲稠密,且產生少量分生孢子,說明兩者混合可能增加了分生孢子形成所需要的生長物質或微量元素,也可能兩者混合后中和某些抑制物質,還有待于進一步研究。這些研究結果表明,毀滅刺盤孢菌是否產孢的關鍵因素是培養基的營養成分。不同碳源和氮源對苜蓿毀滅刺盤孢菌絲生長、孢子產生和萌發有顯著的影響。以麥芽糖、可溶性淀粉最利于產孢和萌發的氮源,說明二糖適合病菌孢子產生和萌發。氮源對孢子的產生和萌發尤為重要,與對照相比差異顯著。最利于菌絲生長、產孢和萌發的氮源均為蛋白胨。碳源和氮源相比,碳源對孢子萌發影響更大。

適宜苜蓿毀滅刺盤孢菌絲生長、孢子產生和萌發的溫度范圍為24～32℃,低于24℃或高于32℃時,菌絲生長、孢子產生和萌發都會受阻。菌絲生長最適溫度為32℃,孢子產生和萌發的最適溫度均為28℃,說明該病菌適宜在高溫下生長,這與劉愛媛等[21]、傅俊范等[22]對其他作物炭疽病菌的研究結果基本一致；而與田華等[16]的研究結果不符,可能是寄主不同,地域不同,病原菌對溫度的要求不同。另外,分生孢子萌發對濕度的要求嚴格,相對濕度在98%以上時,分生孢子的萌發率比較高。持續光照更有利于該菌菌絲生長、產孢和孢子萌發。同時,對苜蓿炭疽病菌進行致病性測定時,發現延長光照周期有利于發病，由此也佐證了其對持續光照敏感。該菌對酸堿適應能力強,pH在3～11范圍均可生長,菌絲生長、產孢和孢子萌發的最適pH均為6。這與唐爽爽等[20]對西瓜炭疽病的研究結果一致,可見該病菌宜在偏酸性環境下生長。這與吉林7月、8月日照時長、高溫多雨的季節病害流行相吻合。因此利用提早刈割,降低空氣濕度等措施,可以有效控制病害發生。

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(責任編輯：田喆)

Major biological characteristics of Colletotrichum destructivum causing anthracnose of alfalfa

Ma Jiaqiang1,2,Wang Shengrong1,Yuan Qinghua2,Wang Yu2

(1. Pratacultural College of Gansu Agricultural University, Lanzhou730070, China; 2. Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

Alfalfa anthracnose is a destructive disease in the alfalfa-planting areas, which was mostly caused byColletotrichumdestructivum. The effects of medium, carbon, nitrogen, temperature, pH, illumination and humidity on the mycelial growth, sporulation and conidia germination of alfalfa anthracnose fungus were studied. The results showed that PDA, PSA and V-8 juice were the optimal medium for hyphal growth; the optimal temperature for mycelium growth ranged from 28℃ to 36℃, with the optimum temperature of 32℃ and the optimum pH of 4-6. The sporulation ability ofC.destructivumwas best when it was cultured on PDA, with maltose and peptone as carbon and nitrogen sources, respectively, at 28℃ and pH 6. For conidia germination, the optimal carbon and nitrogen sources were soluble starch, beef paste and peptone, and the optimal temperature was at 28℃; the optimum pH value was 6. The 98% or higher relative humidity favored the conidia germination, while the continuous light was conducive to mycelial growth, sporulation and conidia germination.

alfalfa anthracnose;Colletotrichumdestructivum;biological characteristic

2015-07-27

2015-08-26

公益性行業(農業)科研專項(201303057);“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD17B01)

E-mail：wangsr@gsau.edu.cn；yuanqinghua@hotmail.com

S 435.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.016