黃瓜綠斑駁花葉病毒安徽分離物全基因組序列測定及分析

嚴丹侃,　張海珊,　鄭紅英,　燕　飛,　章東方*

(1. 安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所, 合肥　230031;2. 浙江省農業科學院病毒學與生物技術研究所, 杭州　310021)

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黃瓜綠斑駁花葉病毒安徽分離物全基因組序列測定及分析

嚴丹侃1,張海珊1,鄭紅英2,燕飛2,章東方1*

(1. 安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所, 合肥230031;2. 浙江省農業科學院病毒學與生物技術研究所, 杭州310021)

通過膠體金免疫層析試紙條和RT-PCR等手段對采自安徽和縣的西瓜病株進行檢測,確定其病原為黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus, CGMMV)。為明確CGMMV安徽分離物CGMMV-Anhui的分類地位,進一步克隆了該病毒的全基因組序列,分析了其基因組結構特征。結果表明,CGMMV-Anhui基因組全長為6 423 bp (GenBank登錄號 KT236095),與已報道的CGMMV的編碼區的基因結構一致,僅5′和3′端非編碼區核苷酸數目略有差異。將CGMMV-Anhui與已報道的分離物的全基因組序列和外殼蛋白基因序列進行系統發育分析,顯示CGMMV 不同分離物可分為亞洲和歐洲兩個組,安徽分離物CGMMV-Anhui與亞洲分離物親緣關系較近,可能具有共同的侵染源。

黃瓜綠斑駁病毒;安徽分離物;基因組;序列分析

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV),為煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)成員,主要侵染葫蘆科作物,致使植株生長緩慢、矮化，葉片出現色斑、水皰及變形；結果延遲,甚至不育。西瓜感染該病毒后,種子周圍的果肉呈紫紅色或暗紅色的水漬狀,西瓜成熟后,變為暗褐色且出現空洞,失去經濟價值,給農民帶來巨大的經濟損失。常溫下,該病毒的侵染力可保持數月,極易通過汁液傳播。種子帶毒是其遠距離傳播的主要方式[1-2]。該病毒自Ainsworth首次在黃瓜上發現并報道以來[3],在世界上許多國家被相繼發現。在我國，該病毒于1986年在臺灣首次被報道[4],隨后，2004年從日本進口的南瓜種子中被截獲,之后2005年在廣西某農業展示中心的觀賞南瓜葉片上分離得到[5]。根據我國農業部公布的《全國農業植物檢疫性有害生物分布行政區名錄(2014)》,遼寧、上海、江蘇、浙江、安徽、山東、湖北、湖南、廣東、廣西、海南等11個省區市74個縣市區均有CGMMV分布。

CGMMV是一種正單鏈RNA病毒,直桿狀,大小為300 nm×18 nm。該病毒基因組大小約6 423 bp,編碼至少4個蛋白,2個復制酶蛋白 (186 kD和 129 kD)、運動蛋白 (30 kD)和外殼蛋白 (17.5 kD)[6]。目前,日本[7]、西班牙[8]、印度[9]、以色列[1]、韓國[10]和加拿大[11]等國家已報道了該病毒多個分離物的基因組信息。在我國,遼寧分離物[12]、北京分離物、山東分離物[13-14]、河北分離物[15]和海南分離物[16]等的全基因組或近全基因組序列都已測定并報道。

2015年筆者在安徽和縣發現個別西瓜種植大棚出現疫情,病株葉片出現淺綠色的斑紋,上端葉片皺縮,植株矮小、生長緩慢。運用膠體金免疫層析試紙條檢測,發現陽性樣本后,將病樣采回,運用分子生物學的方法,進一步檢測和鑒定,確定為CGMMV侵染。本文克隆了該病毒分離物的全基因組序列并分析了其基因組結構特征,與已報道分離物進行系統進化相關性分析,以期揭示CGMMV安徽分離物(CGMMV-Anhui)的基因組信息及系統進化情況,為研究該病毒的傳播途徑提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

病毒病樣: 2015年5月10日采集于安徽和縣歷陽鎮西瓜大棚中,干燥保存于-70℃冰箱中備用。

主要試劑:MiniBEST Plant RNA Extraction Kit和PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit購自TaKaRa公司,克隆載體pUCm-T和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購自上海生工生物工程有限公司,黃瓜綠斑駁花葉病毒膠體金免疫層析試紙條購自美國Agdia公司。

引物:CGMMV鑒定所用引物CGMMV-F和CGMMV-R由浙江大學生物技術研究所謝艷老師提供，擴增片段大小約850 bp;4對用于CGMMV-Anhui全基因組序列擴增的引物參考鐘敏等[15]的報道。引物序列見表1,所有引物均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

病毒RNA:稱取100 mg西瓜病株葉片,在液氮中磨碎,使用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取葉片總RNA,溶解于經DEPC處理的滅菌超純水中,-80℃保存備用。

表1　CGMMV-Anhui 基因組序列擴增引物

1.2方法

1.2.1黃瓜綠斑駁花葉病毒膠體金免疫層析試紙條檢測

參照說明書進行。

1.2.2CGMMV-Anhui 全基因組序列測定與分析

以CGMMV-Anhui侵染發病的西瓜葉片組織總RNA為模板,按照PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit 說明書,以RT-PCR特異性引物和覆蓋CGMMV全基因組序列的4對引物進行PCR擴增,PCR產物在1×TAE電泳緩沖液中,經1%瓊脂糖凝膠電泳分離。PCR產物使用UNIQ-10 柱式DNA凝膠回收試劑盒[生工生物工程 (上海) 股份有限公司]回收純化后,分別與pUCm-T載體連接并轉化大腸桿菌DH5α,每個片段選取多個鑒定為陽性的克隆委托生工生物工程(上海) 股份有限公司測序,通過比對選擇3個測序結果相同的序列作為最終測序結果,拼接序列獲得CGMMV-Anhui全基因組序列,從GenBank中獲得20個CGMMV分離物全基因組序列,根據全基因組序列及外殼蛋白(coat protein,CP) 基因序列,分析CGMMV-Anhui與其他分離物的系統進化關系,以KGMMV(NC_003610)為外群。使用DNAstar軟件中的MegAlign進行開放閱讀框及非編碼區序列比對分析。針對全基因組序列和外殼蛋白基因序列,采用Mega 6.0軟件進行系統發育樹分析,采用鄰位相接聚類分析法構建系統發育樹,用1 000次重復的自展檢驗評價系統發育樹拓撲結構的可靠性[15]。

2　結果與分析

2.1CGMMV的膠體金免疫層析試紙條和RT-PCR檢測

使用黃瓜綠斑駁花葉病毒膠體金免疫層析試紙條對安徽和縣西瓜病株和健康葉片進行檢測,病株葉片在質控線和測試線均出現紫紅色條帶,結果為陽性,表明該病株中含有黃瓜綠斑駁花葉病毒;而健康葉片在質控線呈紫紅色而測試線未顯色,結果為陰性,表明不含黃瓜綠斑駁花葉病毒。使用CGMMV特異性引物(CGMMV-F/CGMMV-R)對檢測結果進行驗證,結果顯示病株葉片可擴增出約850 bp條帶,而健康葉片未擴增出條帶,對條帶進行克隆后測序,結果顯示為黃瓜綠斑駁花葉病毒。

2.2CGMMV-Anhui 的全基因組RT-PCR擴增與序列測定

通過4對引物擴增CGMMV-Anhui全基因組序列,獲得4段DNA片段,大小與預期一致,分別為1 944、 1 564、1 618和1 466 bp (圖1)。將得到的CGMMV基因組各DNA片段進行拼接,得到CGMMV-Anhui全基因組序列,全長6 423 bp,將該序列提交GenBank,登錄號為KT236095。

圖1　CGMMV-Anhui全基因組序列4 個片段的擴增Fig.1　Amplification of four fragments of CGMMV-Anhui genomic sequence

2.3CGMMV-Anhui基因組序列分析

對CGMMV-Anhui的全基因組序列進行分析表明,其包含5′非編碼區(60 bp)、復制酶蛋白(3 435 bp和4 947 bp)、運動蛋白(795 bp)、外殼蛋白(486 bp)和3′非編碼區(175 bp)。將CGMMV-Anhui各部分序列與已報道的其他20個CGMMV分離物進行核苷酸比對(表2),基因組核苷酸相似性在90.1%～99.8%,其中與4株歐洲分離物差異最大,與亞洲分離物和北美分離物相似性較高,而與以色列的4個分離物的相似性在94.1%～98.3%,各分離物間的差異較大。將CGMMV-Anhui非編碼區序列與其他地區分離物比對發現,5′非編碼區的相似性在95.0%～100%,而3′ 非編碼區的相似性在93.3%～99.4%。相對而言,4個蛋白質編碼區的核苷酸序列變化較大,其中復制酶蛋白編碼區與4株歐洲分離物的相似性小于90%。

將CGMMV-Anhui的4個蛋白質的氨基酸序列與其他20個CGMMV分離物進行比對,結果表明,2個復制酶蛋白的氨基酸相似性分別為97.6%～100% 和 97.7%～100%,運動蛋白的相似性為97.7%～99.6%,外殼蛋白的相似性為95.7%～100%。其中與西班牙分離物差異較大,4個蛋白質的氨基酸序列相似性為95.7%～97.8%。

2.4CGMMV-Anhui與其他分離物系統進化分析

基于CGMMV基因組序列構建系統發育樹,結果(圖2)表明21個CGMMV分離物可分為兩個亞組,其中歐洲4個分離物與以色列分離物CGMMV-Ec在同一亞組中。CGMMV-Anhui分離物與其他以色列分離物、亞洲分離物和北美分離物在一個亞組中,其中CGMMV-Anhui與中國河南鄭州CGMMV-hn、浙江海寧分離物CGMMV-ZJ、河北分離物CGMMV-chb在同一分支上,而中國山東泰安分離物CGMMV-CCMV-TANG和韓國分離物CGMMV-KW處于同一分支中,遼寧分離物CGMMV-Liaoning與臺灣臺中分離物CGMMV11單獨形成分支。日本、韓國、印度和中國分離物處于同一較大分支中,而北美分離物和以色列CGMMV-Rd和CGMMV-TY分離物處于同一分支中(圖2)。相對而言,安徽分離物CGMMV-Anhui與亞洲分離物親緣關系較近,與歐洲分離物的親緣關系較遠,這與基于外殼蛋白基因序列的系統進化關系分析結果基本一致,但是在各分支上存在差異(圖3)。

圖2　基于CGMMV-Anhui全長基因組序列的CGMMV分離物系統進化關系Fig.2　Phylogenetic relationships of CGMMV-Anhui with other reported isolates based on genomic sequences

圖3　基于外殼蛋白基因序列的CGMMV-Anhui 與其他分離物的系統進化關系Fig.3　Phylogenetic relationships of CGMMV-Anhui with other reported isolates based on the gene sequences of coat protein

分離物Isolate登錄號Accessionno.國家Country相似性/% Identity基因組Genoment5'非編碼區5'-noncodingregionnt129kD復制酶129kDviralreplicasentaa186kD復制酶186kDviralreplicasentaa運動蛋白Movementproteinntaa外殼蛋白Coatproteinntaa3'非編碼區3'-noncodingregionntCGMMV-hnKC851866中國99.7100.099.699.299.799.399.999.699.899.499.4CGMMV-ZJKP244682中國99.7100.099.7100.099.799.999.799.699.899.497.8CGMMV11HQ692886中國99.4100.099.399.899.499.999.999.699.2100.098.9CGMMV-LiaoningEF611826中國99.298.399.199.599.299.599.598.599.6100.098.9CGMMV-CCMV-TANGHM008919中國99.398.399.099.699.299.799.699.2100.0100.098.9CGMMV-chbKJ658958中國99.8100.0100.0100.099.8100.099.999.699.4100.098.3CGMMV-KWAF417242韓國99.398.399.299.799.399.799.999.699.2100.098.3CGMMV-KOMAF417243韓國99.2100.099.199.899.299.899.699.699.4100.097.2CGMMV-SHD12505日本99.3100.099.299.899.399.999.699.299.4100.098.3CGMMV-watermelonAB015146日本97.7100.097.199.197.499.398.498.998.4100.098.9CGMMV-ABCA13-01KP772568加拿大98.798.398.599.598.699.699.498.998.699.498.9CGMMVDQ767631印度98.798.398.499.598.699.699.699.699.0100.097.2CGMMV-TYKF155229以色列98.396.798.299.398.299.399.199.298.198.897.2CGMMV-RdKF155230以色列98.195.098.099.598.199.599.098.596.798.897.2CGMMV-AhKF155232以色列97.598.397.299.097.599.298.799.297.199.496.1CGMMV-EcKF155231以色列94.198.393.798.693.998.895.798.192.898.196.1CGMMV-MC-2GQ495274俄羅斯90.396.789.097.889.497.993.598.592.699.493.3CGMMV-VIROG-43MGQ495275俄羅斯90.296.788.997.689.397.793.598.592.699.493.3CGMMV-MC-1FJ848666俄羅斯90.396.788.997.989.497.993.698.592.699.493.3CGMMV-SPGQ411361西班牙90.196.788.997.889.497.893.297.791.695.793.3

3　討論

黃瓜綠斑駁花葉病毒病是我國葫蘆科作物上的主要病毒病之一,嚴重危害西瓜、葫蘆等作物[17]。本研究利用膠體金免疫層析試紙條技術在安徽和縣西瓜大棚中檢測到黃瓜綠斑駁花葉病毒,并利用黃瓜綠斑駁花葉病毒特異性引物對病樣進行RT-PCR檢測,確定為黃瓜綠斑駁花葉病毒。本研究首次克隆了CGMMV安徽分離物全基因組序列,分析了其基因組結構特征以及與其他分離物的系統發育關系,為揭示我國CGMMV分類地位及該病毒的傳播途徑奠定了基礎。

目前,我國已報道了浙江、河北、山東、遼寧、臺灣和海南等多個地區的CGMMV分離物全基因組序列。本研究將獲得的安徽分離物CGMMV-Anhui全基因組序列和20個已知CGMMV分離物進行系統發育分析,結果表明CGMMV分離物可以大致分為兩組,第Ⅰ組為亞洲組，主要包括中國、日本、韓國、印度分離物，此外還包括1個北美分離物和3個以色列分離物;第Ⅱ組為歐洲分離物,主要包括西班牙和俄羅斯分離物，以及1個以色列分離物。CGMMV-Anhui與我國內陸地區(河北、浙江、河南)的分離物同源性最高,同時與亞洲國家(韓國、日本)分離物同源性也較高,而與歐洲的4個分離物存在非常明顯的進化差異。由此可知,CGMMV-Anhui與CGMMV日本和韓國分離物有共同的流行學侵染源,但是西瓜病株采集地未從日本或韓國引種,這說明在我國多地發生CGMMV的情況下,該病毒已在我國定殖,并逐步擴散,新發生的病毒毒源可能來自于國內[16, 18-19]。此外,基于CGMMV全基因組分析發現,相比于我國其他地區,山東的分離物與韓國分離物更為接近,而基于外殼蛋白基因序列分析發現,河北、遼寧分離物與日韓分離物同處于1個分支中,這可能與CGMMV基因組不同位置的進化速度,寄主和地域差異等因素有關,但結果仍需進一步驗證。

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(責任編輯：楊明麗)

Cloning and sequence analysis of the genome of CucumbergreenmottlemosaicvirusAnhui isolate

Yan Dankan1,Zhang Haishan1,Zheng Hongying2,Yan Fei2,Zhang Dongfang1

(1. Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei230031,China; 2. Institute of Virology and Biotechnology,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou310021,China)

Based on gold immunochromatographic assay and RT-PCR methods, the pathogen infecting watermelon in He County of Anhui Province was identified asCucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV). In order to clarify the genome characteristics ofCucumbergreenmottlemosaicvirusisolate from Anhui (CGMMV-Anhui), the complete genomic sequence of CGMMV-Anhui was determined by molecular cloning. The results showed that the genome of CGMMV-Anhui contained 6 423 nucleotides (GenBank accession no. KT236095) and its genomic structure was the same as that of the CGMMV isolates previously reported, except for the nucleotide numbers of 5′-noncoding region (NCR) and 3′-NCR. The phylogenetic relationship of CGMMV-Anhui with other reported isolates was analyzed based on the genomic sequence and coat protein gene sequence.The analysis of phylogenetic tree showed that CGMMV could be separated into Asian isolates and European isolates. CGMMV-Anhui showed the closest relationship with Asian isolates and they might share the same infection source.

Cucumbergreenmottlemosaicvirus;Anhui isolate;genome;sequence analysis

2015-08-05

2015-10-08

公益性行業(農業)科研專項(201303028)；安徽省蔬菜產業技術體系

E-mail：dfzhang2002@163.com

S 436.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.025