青稞種子帶菌檢測及殺菌劑消毒處理效果

況衛剛,　思紅兵,　羅來鑫,　張治萍,　李迎賓,　李健強*

(1. 中國農業大學植物病理系,種苗健康北京市工程研究中心, 北京　100193;2. 云南省迪慶藏族自治州植保植檢站, 云南　674400)

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技術與應用

青稞種子帶菌檢測及殺菌劑消毒處理效果

況衛剛1,思紅兵2,羅來鑫1,張治萍1,李迎賓1,李健強1*

(1. 中國農業大學植物病理系,種苗健康北京市工程研究中心, 北京100193;2. 云南省迪慶藏族自治州植保植檢站, 云南674400)

為了研究青稞種子外部和內部攜帶真菌情況,比較不同殺菌劑對青稞種子的帶菌消毒效果和對幼苗生長的影響,為青稞種子播前包衣處理和種傳真菌病害防控提供依據，采用離體平皿法對云南迪慶‘云青1號’、‘云青2號’和‘短白青稞’3個主栽品種進行帶菌檢測,并對種子進行拌種或浸種處理測定6種殺菌劑對種子消毒效果,分析殺菌劑對種子發芽和幼苗生長的影響。結果表明:供試青稞種子表面攜帶的優勢菌群為青霉(Penicilliumspp.)、鐮刀菌(Fusariumspp.);種子內部寄藏的真菌主要為鐮刀菌、核腔菌(Pyrenophoraspp.)、附球菌(Epicoccumspp.)、絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)和木霉(Trichodermaspp.)。青稞不同品種的種子表面及內部攜帶的真菌種類差異較大。致病性測定表明,鐮刀菌對種子萌發和幼苗生長影響最大,后期出現幼苗壞死現象。45%咪鮮胺EW、75%百菌清WP、50%福美雙WP對青稞種子攜帶真菌均有顯著抑制作用和消毒效果,50%福美雙WP消毒效果最優,達100%;45%咪鮮胺EW、75%百菌清WP、50%福美雙WP處理對青稞種子發芽和幼苗生長均無顯著影響。

青稞;種帶真菌;帶菌檢測;殺菌劑;消毒效果

青稞(HordeumvulgareLinn.var.nudumHook.f.)是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物,籽粒裸露,又稱裸大麥、元麥[1],生長的海拔高度可達4 700 m以上[2-3],主要分布在我國西藏、青海、四川甘孜和阿壩、云南迪慶、甘肅甘南等青藏高原高寒地區。裸大麥作為我國藏族人民的主要糧食作物具有重要的經濟價值,但國外相關資源材料匱乏,國內由于研究手段及技術設備等多方面限制,也未能對其進行深入的研究[4]。青稞是云南迪慶高原藏區不可替代的糧食作物,是以青稞為依托的系列產品的重要原料,具有廣闊的開發利用前景,但由于病蟲害等的影響,其產量、品質不容樂觀。青稞上發生的病害種類多、分布廣、危害大,常見的種傳病害有黑穗病﹑云紋病﹑網斑病、條紋病等[5-6]。這些病害對青稞種質資源的生產及利用造成了重大的影響。目前生產中尚無產前種子處理預防青稞病害的技術措施,造成青稞出苗前爛種爛芽、出苗后發生病害,防治難度大,防治效果差,以致減產、減收。種子處理是建立在種子帶菌檢測和種傳、土傳病害發生發展規律基礎之上的一項綜合技術[7]。播種前對種子進行健康檢測和消毒處理,可以提高播種質量,有效降低種傳病害的發生[8],是防治青稞種傳病害最簡單有效的措施之一。國內外對種子帶菌檢測和種子消毒處理做了很多研究[9-11],但目前關于青稞種子健康檢測和種子藥劑消毒處理鮮有文獻報道。

本研究參考國際種子檢驗規程和農作物種子健康檢測方法[12],通過對云南迪慶高原藏區目前主栽的3個青稞品種進行種子寄藏真菌檢測,依據青稞種子攜帶優勢菌種類及不同殺菌劑的作用特點,篩選出適合種子消毒處理的藥劑,為青稞種子產區間安全調運和實施種子預防保健處理，預防種傳病害提供參考和理論依據。

1　材料與方法

1.1研究材料

供試種子:‘云青1號’,‘云青2號’和‘短白青稞’為云南迪慶主栽青稞品種,其籽粒由云南迪慶州植保站提供,2012年采收。

供試殺菌劑:45%咪鮮胺水乳劑,50%多菌靈可濕性粉劑,50%福美雙可濕性粉劑,75%百菌清可濕性粉劑,15%三唑醇可濕性粉劑,25 g/L滅菌唑懸浮種衣劑,均由中國農業大學種子病理與殺菌劑藥理學研究室提供。

1.2種子內外部帶菌檢測

1)種子外部帶菌檢測:從每份樣品中隨機選取400粒種子放入300 mL錐形瓶中,加入50 mL無菌水充分振蕩,吸取懸浮液1 mL進行10、100、1 000濃度梯度稀釋,吸取100 μL加到直徑為9 cm的PDA平板上涂勻,每個濃度3皿。以加入無菌水作為空白對照,25℃溫箱中黑暗條件下培養,每隔24 h觀察1次,選取合適的稀釋濃度統計培養皿上的菌落數,計算種子的孢子負荷量及種子外部攜帶真菌的分離比例,對各處理中出現的分離物進行轉皿純化保存,備鑒定用[13]。

孢子負荷量(個/粒)=(3皿菌落總數/0.3 mL)×稀釋倍數×50 mL/400粒；

分離比例(%)=(攜帶某種真菌菌落數/菌落總數)×100。

2)種子內部帶菌檢測:從每個供試品種中隨機選取種子400粒,在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡1～3 min,無菌水沖洗4次,在無菌培養皿底部鋪兩層滅菌濾紙,將種子倒入其中,用濾紙吸干種子表面的水分;然后將種子均勻擺放在直徑為9 cm的PDA平板上,每皿10粒,5皿為1重復,重復3次;25℃恒溫箱中黑暗培養,每隔24 h觀察記錄。統計種子寄藏真菌種類、帶菌率和分離比例。對各處理中出現的分離物純化保存,備鑒定用[14]。

帶菌率(%)=(帶菌種子總數/檢測種子總數)×100。

1.3種子攜帶真菌種類鑒定

形態學鑒定：將分離到的各種真菌轉移到PDA培養基進行純化，利用單反數碼相機拍攝菌落形態。按常規真菌鑒定方法，根據病原菌培養性狀和形態特征，參考《真菌鑒定手冊》[15]進行鑒定。

分子鑒定：采用CTAB法提取各分離菌株的菌絲DNA[16]，利用真菌ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增[17]，PCR產物測序由北京博邁德生物技術有限公司完成，將獲得的各菌株ITS序列與NCBI核苷酸數據庫中已注冊的序列進行BLAST比對，其中，鐮刀菌ITS序列與鐮刀菌鑒定數據庫http://isolate.fusariumdb.org/index.php進行比對，進一步確定菌株的屬、種地位。

1.4種子攜帶真菌對種子發芽和幼苗生長的影響

將純化的真菌轉移到PDA平皿上,待菌落即將長滿全皿時,將‘短白青稞’種子分為9份,每份約400粒,用1%次氯酸鈉表面消毒1～3 min,無菌水漂洗4次后晾干,隨后將種子均勻撒播在長有該種子攜帶真菌的PDA平板上,種子與菌絲及孢子在25℃恒溫箱中共培養48 h,以不含真菌的PDA培養基為對照,培養期間將其在水平方向搖動3～5次,使種子均勻接觸到真菌[18-20],備用。

濾紙皿床發芽試驗,隨機選取接種過真菌的種子200 粒,以腹面朝下的方式均勻放入直徑為9 cm的培養皿中,培養皿底部放有3層滅菌濾紙,并向皿中加入約3 mL無菌水保持濾紙濕潤。每處理5皿,每皿放10粒種子,4個重復，于25℃培養箱中培養。每隔24 h記錄發芽種子數,以芽長超過種子長度約1/2為發芽標準,每皿每天加入約1 mL無菌水保持濾紙濕潤。第3天調查發芽勢,5 d后測定發芽率,并隨機取10株幼苗測定苗高、根長和幼苗鮮重。

發芽勢(%)=(第3天發芽種子數/檢測種子總數)×100;

發芽率(%)=(第5天發芽種子數/檢測種子總數)×100。

1.5殺菌劑對青稞帶菌種子的消毒效果

青稞種子用以下藥劑處理:50%多菌靈WP、50%福美雙WP、75%百菌清WP、15%三唑醇WP均按1∶333藥種比進行拌種;25g/L滅菌唑FSC按種子與藥液100∶1進行拌種,采用手工拌種法,在自封袋內加入稱好的藥劑和種子,加入適量無菌水振蕩均勻后晾干;45%咪鮮胺EW以900倍稀釋液進行浸種,浸種在培養皿內進行,加入適量去離子水和藥劑混勻,以正好完全浸沒種子為宜,風干備用。經過藥劑處理的種子均勻擺放在直徑為9 cm的PDA平板上,每皿10粒,共5皿,以不做任何處理的種子為空白對照,每個處理4次重復,25℃培養3 d后觀察結果,記錄種子帶菌情況,評價殺菌劑的種子消毒效果。

種子消毒效果(%)=(對照樣品的帶菌率-殺菌劑處理樣品的帶菌率)/對照樣品的帶菌率×100。

1.6殺菌劑對青稞種子發芽及幼苗生長的影響

將藥劑處理后的種子均勻擺放在直徑為9 cm、內置濕潤濾紙的培養皿上,每皿25粒,4次重復。25℃下培養并于第3天和第5天統計種子的發芽勢和發芽率。同時隨機挑選消毒后的種子播種在塑料育苗盆中,盆中沙子經160℃干熱滅菌2 h,每盆50粒,4次重復,7～10 d后觀察記錄出苗率,第14天,每處理隨機選取具有代表性的10株幼苗,記錄株高、根生長情況和植株鮮重等指標。

出苗率(%)=(出苗株數/播種量)×100。

1.7數據統計分析方法

采用Microsoft Excel進行數據統計,利用SAS 8.0軟件對試驗結果進行方差分析和多重比較(Duncan新復極差法)。

2　結果與分析

2.1種子攜帶病菌種類檢測

鑒定結果表明，各菌株ITS序列與NCBI中注冊的相應菌株的ITS序列相似度都達99%以上。分離獲得的優勢真菌主要為燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)、柔毛鐮刀菌(F.flocciferum)、三線鐮刀菌(F.tricinctum)、麥類核腔菌(Pyrenophoragraminea)、圓核腔菌(P.teres)、絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)和木霉(Trichodermaspp.)等，部分真菌菌落形態見圖1。

圖1　種帶真菌在PDA培養基上的菌落形態Fig.1　Colony morphology of fungal species on PDA

不同品種青稞種子內外攜帶病原情況差異較明顯(表1～2),‘云青1號’種子外部未檢測到攜帶真菌;內部只檢測到少量真菌?！贪浊囡N子內外攜帶的病菌分離比例達到了100%,其種子外部孢子負荷量為1 125個/粒,而種子內部帶菌率比其他2個品種高,達到41%。主要菌群為鐮刀菌(Fusariumspp.)、核腔菌(Pyrenophoraspp.)、附球菌(Epicoccumspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)分離比例分別為31.7%、31.7%、17.1%、9.76%?！魄?號’只在種子外部分離到了青霉,種子內部未分離到真菌。

表1　青稞種子外部攜帶的真菌種類和分離比例1)

1) 表中“-”表示未分離到真菌。下同。

“-” shows that no fungi was detected. The same as in the following tables.

表2　青稞種子內部攜帶的真菌種類和分離比例

2.2種帶真菌對種子發芽和幼苗生長的影響

由于‘云青1號’和‘云青2號’2個青稞品種種子內外部只分離到少量的真菌,因此本研究主要對‘短白青稞’種子內外部分離到的真菌進行研究。將分離到的真菌接種‘短白青稞’種子,通過檢測6項指標分析種帶真菌對種子活力的影響。不同真菌對種子萌、發生長均有一定的影響,其中鐮刀菌對種子萌發、生長的影響最大(表3)。F.flocciferum、F.tricinctum、F.avenaceum對種子萌發后苗的生長以及根的形成有顯著抑制作用；F.tricinctum、F.avenaceum對種子萌發和根的生長有顯著抑制作用；F.avenaceum處理的樣品根長與對照組有顯著差異,同時3種鐮刀菌處理過的種子萌發生長一定時間后大部分出現壞死現象,3種鐮刀菌處理后苗重、根重與對照相比均有顯著差異。核腔菌(Pyrenophoraspp.)、鏈格孢菌(Alternariasp.)、絲核菌(Rhizoctoniasp.)、木霉(Trichodermasp.)對青稞種子發芽率、發芽勢、苗長及根長比均無顯著影響。

表3　種帶真菌對青稞種子發芽和幼苗生長的影響1)

1) 同列數據后相同字母表示在0.05水平無顯著差異。下同。

Values followed by the same letters in same column are not significantly different at 0.05 level from each other, The same as follows.

2.3殺菌劑對帶菌種子的消毒效果

根據圖2可以得出,不同的藥劑處理對種子的消毒效果差異較明顯,50%福美雙WP、75%百菌清WP和45%咪鮮胺EW對青稞種子具有較好的消毒效果,分別達100%、86.67%、76.67%,在0.05水平顯著優于25 g/L滅菌唑FSC(53.33%)、15%三唑醇WP(50%)和50%多菌靈WP(20%)。

2.4殺菌劑對青稞種子發芽及幼苗生長的影響

25 g/L滅菌唑FSC和15%三唑醇WP拌種對青稞種子的發芽勢、發芽率有顯著抑制作用,同時15%三唑醇WP顯著抑制青稞種子的出苗以及莖的生長,卻對青稞幼苗根的生長有促進作用。45%咪鮮胺EW、75%百菌清WP、50%多菌靈WP、50%福美雙WP拌種對青稞種子的發芽及幼苗的生長與對照組相比均沒有顯著差異(表4)。

圖2　供試殺菌劑對帶菌青稞種子的消毒效果Fig.2　Effect of experimental fungicides on hullessbarley seed disinfection

處理藥劑Treatment發芽勢/%Germinationenergy發芽率/%Germinationrate出苗率/%Seedlingemergencerate苗重/gSeedlingfreshweight根長/cmLengthofroot苗長/cmLengthofseedling15%三唑醇WP15%TriadimenolWP67.50b70.00bc69.30b3.59a13.44a9.07c25g/L滅菌唑FSC25g/LTriticonazoleFSC68.30b74.20bc84.00a3.56a11.91b15.35ab50%福美雙WP50%ThiramWP73.80ab81.70abc89.30a3.17a11.21b14.57b45%咪鮮胺EW45%ProchlorazEW79.20ab81.70abc90.70a3.67a12.10ab15.24ab75%百菌清WP75%ChlorothalonilWP82.50a85.00ab88.00a3.16a11.52b16.90ab50%多菌靈WP50%CarbendazimWP85.00a91.70a82.70a3.50a11.80b17.14a對照CK83.30a87.50a83.30a3.93a11.82b15.36ab

3　結論與討論

3.1結論

(1) 供試青稞種子表面攜帶的優勢菌群為青霉和鐮刀菌,種子內部寄藏真菌主要為鐮刀菌、核腔菌、附球菌、絲核菌和鏈格孢;不同品種種子表面攜帶及內部寄藏的真菌種類差異較大,‘云青1號’和‘云青2號’兩個品種攜帶真菌較少,‘短白青稞’攜帶真菌較多。

(2) 青稞種子內寄藏的鐮刀菌對種子影響最大,顯著抑制種子萌發和幼苗生長,造成后期幼苗壞死。

(3) 45%咪鮮胺EW、75%百菌清WP、50%福美雙WP對青稞種子消毒效果顯著,其中50%福美雙WP的消毒效果達100%。試驗設計的劑量范圍內,三種殺菌劑處理對青稞種子發芽和幼苗生長安全。

3.2討論

(1) 青稞種子健康狀況:各種真菌的寄生或腐生可降低來年種子的發芽和出苗率,易引起種傳病害的發生,造成青稞品質下降。本研究對云南迪慶3個主栽青稞品種進行種子帶菌檢測,結果表明3個品種種子內外部攜帶真菌種類有較大差異,青稞品種與種子內外部帶菌率有明顯的關系,‘短白青稞’種子內外部攜帶大量的真菌,‘云青1號’和 ‘云青2號’種子攜帶的真菌較少?！贪浊囡N子表面攜帶的優勢菌群為鐮刀菌(Fusariumspp.),內部寄藏真菌種類及數量較多,優勢菌群主要為鐮刀菌屬、核腔菌屬、附球菌屬真菌。而‘云青1號’和‘云青2號’種子外部除分離到青霉外未分離到其他真菌,同時種子內部分離到的真菌也較少。龔弘強等[21]隨機選取拉薩地區尼木縣、林周縣青稞種子,對其籽粒真菌區系進行分析,表明優勢菌群為枝孢霉(Cladosporiumspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)和莖點霉(Phomaspp.),這與本研究的結果有一定差別,原因可能是受氣候環境、耕種方式等因素影響,不同來源的種子抗病性、攜帶的真菌種類差別較大[22]。

不同的分離方法分離獲得的真菌種類有差異。本研究采用PDA平板法和洗滌法檢測了云南迪慶3個主栽青稞品種種子內外部帶菌情況,未對青稞種子各部位的帶菌情況進行研究,還需要結合其他分離方法如濾紙保濕法[23]綜合分析種子各個部位的帶菌情況[24],同時進行種子消毒處理時應更加合理地有針對性用藥[25]。

(2) 殺菌劑對青稞種子的消毒效果及對種子發芽出苗的影響:致病性測定結果表明,鐮刀菌對種子的活力影響最大,可顯著抑制種子的萌發生長,這與前人對大豆種子寄藏真菌Fusariumspp.顯著影響大豆種子發芽和生長的研究結果相似[26]。6種殺菌劑對‘短白青稞’種子均有一定的消毒作用,其中50%福美雙WP、75%百菌清WP和45%咪鮮胺EW對種子消毒效果顯著優于其他3種殺菌劑,與殺菌劑對水稻種子消毒處理的研究結果一致[7]。福美雙和百菌清屬于保護性殺菌劑,咪鮮胺為廣譜內吸性殺菌劑,對核腔菌及鐮刀菌具有較好的抑制作用[27],這3種藥劑都廣泛用于種子處理,能夠有效地預防病害的發生。45%咪鮮胺EW、75%百菌清WP、50%多菌靈WP、50%福美雙WP 4種藥劑對‘短白青稞’種子進行拌種或浸種對種子發芽率和發芽勢以及各項生長活力測定指標無顯著影響,其中在供試濃度下,45%咪鮮胺EW、75%百菌清WP、50%福美雙WP對種子的出苗率均有一定的促進作用。15%三唑醇WP、25 g/L滅菌唑FSC對青稞出苗及莖的生長具有明顯的抑制作用,但能夠顯著促進根的生長,這與前人關于三唑類藥劑對種子發芽和生長具有抑制作用的研究結果一致[28-29]。但由于滅菌唑和三唑醇對麥類種傳病害具有良好的防治效果,因此需要進一步改善這兩種藥劑的拌種或浸種方法和用量。45%咪鮮胺EW、75%百菌清WP、50%福美雙WP對青稞種子出苗及生長與對照相比均沒有顯著差異,同時這3種藥劑的消毒效果都達到75%以上,可作為青稞生產上的拌種藥劑。

本研究按照6種供試殺菌劑的常規拌種劑量進行了青稞種子帶菌消毒效果和安全性初步試驗,可為青稞種子的健康保護和生產中種苗病害的防控提供參考依據。殺菌劑的質量濃度及浸種或拌種時間可能顯著影響消毒效果及種子發芽生長[30],這方面的工作有待深入研究。

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(責任編輯：楊明麗)

Testing of seed-borne fungi of hullessbarley and disinfection effect of six kinds of fungicides

Kuang Weigang1,Si Hongbing2,Luo Laixin1,Zhang Zhiping1,Li Yingbin1,Li Jianqiang1

(1.Department of Plant Pathology, Beijing Engineering Research Center of Seed and Plant Health, China Agricultural University, Beijing100193, China; 2.Plant Protection Station of Diqing, Yunnan674400, China)

The dominant seed-borne fungi were detected from three major hullessbarley varieties ‘Yunqing 1’, ‘Yunqing 2’ and ‘Short-white barley’ from Diqing Tibetan Autonomous Prefecture by petri-dish testing method, and the disinfection effects of six fungicides and growth of the seeds were also investigated after seeds treatment. The results showed thatFusariumspp. andPenicilliumspp. were the main pathogens on the surface of hullessbarley seeds,Fusariumspp.,Trichodermaspp. andEpicoccumspp.,Rhizoctoniaspp.,Alternariaspp. andTrichodermaspp. represented main pathogens inside. The fungi isolated from the external surface and interior of seeds expressed significantly difference among the tested varieties. Seeds growth were severely affected byFusariumspp.. 45% prochloraz EW, 75% chlorothalonil WP and 50% thiram WP had good control effects on seed-borne fungi. The disinfection effect of 50% thiram WP was up to 100%, much better than that of other fungicides. 45% prochloraz EW, 75% chlorothalonil WP and 50% thiram WP treatment had no significant effect on seed germination and seedling growth of hullessbarley.

hullessbarley;seed-borne fungi;seed testing;fungicides;disinfection effect

2015-06-13

2015-08-03

國家少數民族科技骨干特殊培養專項

E-mail: lijq231@cau.edu.cn

S 435.1

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.037

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