3種絲柏油醇絡合物對11種植物病原真菌的室內抑菌活性

羅小勇,　徐　丹,　楊從軍,　邢小霞,　宋吉青

(1. 青島農業大學農學與植物保護學院, 山東省農作物病蟲害綜合防控重點實驗室,青島　266109; 2. 中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所, 農業部農業環境氣候變化重點開放實驗室, 農業部旱作節水農業重點開放實驗室, 北京　100081)

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3種絲柏油醇絡合物對11種植物病原真菌的室內抑菌活性

羅小勇1,徐丹1,楊從軍1,邢小霞1,宋吉青2*

(1. 青島農業大學農學與植物保護學院, 山東省農作物病蟲害綜合防控重點實驗室,青島266109; 2. 中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所, 農業部農業環境氣候變化重點開放實驗室, 農業部旱作節水農業重點開放實驗室, 北京100081)

采用生長速率法測定了絲柏油醇銅、鈣、鈉3種絡合物對11種常見植物病原真菌菌絲生長的抑制作用。結果表明,3種絲柏油醇絡合物對小麥全蝕病菌、小麥赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、蘋果輪紋病菌、黃瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、西瓜炭疽病菌、蘋果斑點落葉病菌、大蔥紫斑病菌、玉米紋枯病菌和番茄灰霉病菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用,其中對棉花枯萎病菌和番茄灰霉病菌的抑制效果相對較高,EC50分別為21.69～27.13 mg/L和25.18～29.43 mg/L。而3種絡合物對其他病菌的EC50，除鈣絡合物對柑橘炭疽病菌和西瓜炭疽病菌、鈉絡合物對柑橘炭疽病、西瓜炭疽病菌和小麥赤霉病菌的EC50高于50 mg/L外,均小于等于45.72 mg/L。說明3種絲柏油醇絡合物均具有防治上述植物病害的潛力,但以銅絡合物的活性相對較高。

絲柏油醇絡合物;植物病原真菌;抑菌作用

農作物真菌病害的防治長期以來一直依賴于人工合成的化學藥劑,其不但污染環境而且殘留嚴重,對人體易造成傷害,因此,尋求既能有效防治農作物病害又能保護環境的新型殺菌劑備受關注[1-3]。植物源農藥因其來源于天然產物,具有安全、無污染、對環境友好等優點[1-3]。目前,國內外利用植物源殺菌劑殺菌的報道較多[1-3],其中,孟昭禮等[4-5]從銀杏中分離出對植物病原真菌具有高活性的化合物白果酚,并人工模擬合成開發出了銀果、銀泰和仿生胺3種農用殺菌劑。1936年旅臺學者野副鉄男從臺灣絲柏中分離得到一種具有強抗菌活性的化合物絲柏油醇(C10H12O2),亦稱日扁柏醇(hinokitiol)[6-7]。該化合物對各種細菌具有很強的抗菌活性,已廣泛應用于醫藥、化妝品以及食物保鮮等領域[7-8];但因其光、熱穩定性差、極難溶于水以及對金屬具有極強的腐蝕性,應用的范圍在一定程度上受到限制[8]。宋吉青等研究發現,將絲柏油醇與金屬結合形成金屬化合物后,可從根本上改善其遇光易分解的問題,并制備得到絲柏油醇-Na、Ni、Ca、Cu、Zn、Ag、Mn、Fe等絡合物,這些化合物對真菌、細菌和線蟲等呈現出顯著的抑抗活性。大田試驗時每667 m2施用1g絲柏油醇防治大豆菌核病達85%的良好效果[9-10]。為了進一步發掘絲柏油醇在農業上防治農作物真菌病害的潛力,本研究對其銅、鈣和鈉3種絡合物的抑菌活性進行了室內測定。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試藥劑

絲柏油醇銅、絲柏油醇鈣和絲柏油醇鈉均由中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所提供。

1.1.2供試菌種

小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.triticiWalker)、小麥赤霉病菌[Gibberellazeae(Schw.) Petch]、柑橘炭疽病菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Penz. & Sacc.]、蘋果輪紋病菌[Botryosphaeriadothidea(Moug.) Ces.etDe Not]、黃瓜枯萎病菌[Fusariumoxysporum(Schl.) f.sp.cucumerinumOwen]、棉花枯萎病菌[Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(Atk.) Sndyder & Hansln]、西瓜炭疽病菌[Colletotrichumorbiculare(Berk. & Mont.) Arx]、蘋果斑點落葉病菌(Alternariaalternataf.sp.mali)、大蔥紫斑病菌[Alternariaporri(Ellis) Ciferri]、玉米紋枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn)和番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)菌種均由青島農業大學農藥學實驗室采集和保存。

1.2方法

1.2.1抑菌作用測定

采用生長速率法測定絲柏油醇絡合物對供試病原真菌的抑制作用。取滅菌培養皿,每皿倒入15 mL熔化的PDA培養基制成平板。挑取一小塊各供試菌種分別放入PDA平板中央,置于25℃恒溫箱內培養,待平板上長滿菌絲后,用滅菌打孔器(直徑3 mm)在菌落上打取菌餅用于生物測定。

將3種絲柏油醇絡合物用無水乙醇溶解后,分別配制濃度梯度為10、20、30、40和50 mg/L的含藥PDA培養基50 mL,冷凝前分別快速均勻倒入3個滅菌的培養皿中,其中乙醇的最終濃度均為0.5%。以 含0.5%乙醇的PDA培養基為空白對照,重復3次。

用接種針挑取菌餅接種于含藥PDA平板中央,每皿一塊菌餅,菌絲面向下。將接種后的培養皿用保鮮膜密封保濕。而后放入25℃培養箱中培養,3～4 d后采用十字交叉法測定各培養皿中菌落直徑,計算菌落純生長量及抑制率。

菌落純生長量=菌落直徑-菌餅直徑(3 mm)；

抑菌率(%)=

1.2.2毒力計算

采用劑量對數-幾率值回歸線(LD-P)法分別求出3種絲柏油醇絡合物對11種植物病原真菌菌絲生長的毒力回歸方程,計算抑菌中濃度(EC50)、抑制10%菌絲生長所需濃度(EC10)及抑制90%菌絲生長所需濃度(EC90)。試驗數據采用Microsoft Excel軟件處理,并采用SPSS 20統計軟件進行方差分析和線性回歸分析。

2　結果與分析

3種絲柏油醇絡合物對11種農作物病原真菌的抑菌活性如表1和表2所示。在10～50 mg/L的濃度處理下,其銅、鈣和鈉絡合物對供試的植物病原真菌均表現出不同程度的抑制活性,且抑制率均隨處理濃度的增加而提高。

表1　3種絲柏油醇絡合物對11種植物病原真菌菌絲生長的抑制作用1)

續表1Table 1 (Continued)

病原菌Fungus濃度/mg·L-1Concentration抑菌率/% Inhibitionrate絲柏油醇銅Hinokitiol-Cu絲柏油醇鈣Hinokitiol-Ca絲柏油醇鈉Hinokitiol-Na玉米紋枯病菌Rhizoctoniasolani10(14.73±0.93)aE(14.11±0.62)aE(13.81±0.67)aE20(23.24±0.95)abD(26.97±1.18)aD(21.92±0.78)bD30(39.83±0.18)bC(41.21±0.29)aC(39.83±0.18)bC40(51.04±1.00)aB(47.30±0.36)bB(44.40±0.48)cB50(60.58±0.48)bA(50.21±0.31)cA(66.39±0.31)aA番茄灰霉病菌Botrytiscinerea10(12.82±0.40)aE(7.69±1.26)bE (9.09±1.21)abE20(17.95±0.81)aD(12.12±0.73)bD(19.35±0.40)aD30(49.42±1.23)aC(24.50±2.44)bC(50.58±1.62)aC40(89.51±0.61)aB(87.88±0.53)aB(73.89±0.81)bB50(96.27±1.76)aA(96.50±0.70)aA(94.41±0.00)aA

1) 表中數據為三次重復平均值±標準誤。每種病原菌的同列不同大寫字母或同行不同小寫字母分別表示不同濃度處理或三種絡合物之間在0.05水平上差異顯著。Data in the table are mean±SE (n=3). Different capital letters in the same column indicated significant differences among different concentrations and different lower case letters in the same row indicated significant differences among the three compounds at 0.05 level, respectively.

對小麥全蝕病菌,絲柏油醇銅、鈣和鈉絡合物在10～50 mg/L處理濃度下的抑菌率分別達12.22%～86.67%、9.49%～86.75%和8.55%～91.89%,均表現出較強的抑菌活性。同一濃度下不同絡合物的抑菌率差異較大(表1)。三種絡合物的EC50分別為29.04、29.97和28.97 mg/L,EC10分別為11.64、13.15和14.96 mg/L(表2)。

對小麥赤霉病菌,絲柏油醇銅、鈣和鈉絡合物在10～50 mg/L處理濃度下的抑菌率分別為3.39%～77.40%、11.30%～73.73%和16.02%～43.22%,低于對小麥全蝕病菌的抑制率。盡管鈉絡合物在10 mg/L的低濃度下抑制率明顯高于銅和鈣絡合物,但隨著濃度的增加,其抑菌活性的提高幅度明顯低于其他兩種絡合物(表1)。其銅、鈣和鈉絡合物的EC50(EC10)分別為34.31(17.00)、34.80(11.29)和>50 mg/L(7.58 mg/L)(表2)。

對柑橘炭疽病菌,絲柏油醇銅、鈣和鈉絡合物的抑菌活性均較低,在10～50 mg/L處理濃度下的抑菌率分別只有13.17%～67.90%、12.55%～44.44%和5.99%～49.79%。同一濃度下不同絡合物相比,銅絡合物的抑菌效果明顯較高,除在30 mg/L處理下與鈉絡合物無顯著性差異外,其余濃度下與鈣、鈉絡合物存在顯著差異,而鈣和鈉絡合物的抑菌率差異較大(表1)。三種絡合物的EC50(EC10)分別為39.10(10.37)、>50(10.54)和>50 mg/L(13.83 mg/L)(表2)。

對蘋果輪紋病菌,絲柏油醇銅、鈣和鈉絡合物均表現出較高的抑制活性,在10～50 mg/L處理濃度下的抑菌率分別達23.48%～91.94%、22.04%～75.81%和28.57%～72.76%,且均隨處理濃度的增加而顯著提高。盡管在10 mg/L的低濃度處理下,鈉絡合物的抑制率明顯高于其他兩種絡合物,但當濃度增加至20 mg/L后,銅絡合物的活性顯著增加,明顯高于鈉和鈣絡合物,而鈉絡合物除了在50 mg/L處理下與鈣絡合物差異不顯著外,其余濃度處理均明顯高于鈣絡合物(表1)。銅、鈣和鈉絡合物的EC50(EC10)分別為20.39(7.18)、33.43(7.12)和29.13 mg/L(4.44 mg/L)(表2)。

對黃瓜枯萎病菌,絲柏油醇銅、鈣和鈉絡合物在10～50 mg/L處理濃度下的抑菌率分別達11.93%～86.36%、5.11%～100.00%和0.50%～96.71%,且均隨處理濃度的增加而明顯提高。但三者在10 ～40 mg/L的低濃度下,所表現出的抑菌率均相對較低,40 mg/L時抑菌率僅為38.07%、40.34%和53.59%,當濃度增加至50 mg/L時抑菌率才分別倍增至86.36%、100.00%和96.71%。同一濃度下不同絡合物相比,抑菌率變化較大(表1)。三者的EC50(EC10)分別為34.84(11.17)、32.69(15.92)和36.41 mg/L(25.32 mg/L)(表2)。

對棉花枯萎病菌,絲柏油醇銅、鈣和鈉絡合物均表現出較高的抑菌活性,在10～50 mg/L處理濃度下的抑菌率分別達5.17%～98.65%、8.31%～94.38%和15.22%～89.21%,且均隨處理濃度的增加而明顯提高。同一濃度下不同絡合物相比,在10～30 mg/L濃度下鈉絡合物的抑菌活性明顯高于銅和鈣絡合物,尤其是在30 mg/L濃度下其抑菌率高達83.82%,遠高于銅絡合物(46.07%)和鈣絡合物(48.58%)，但在40 mg/L處理下與銅、鈣絡合物無顯著性差異。當濃度增加至50 mg/L時以銅絡合物抑菌率最高,鈣絡合物次之,鈉絡合物最低,三者間差異顯著(表1)。銅、鈣和鈉絡合物的EC50(EC10)分別為26.73(15.63)、27.13(14.63)、和21.69 mg/L(10.12 mg/L)(表2)。

對西瓜炭疽病菌,只有銅絡合物的抑菌效果較好,達到了11.73%～79.65%,而鈣和鈉絡合物均較低,分別只有2.21%～37.17%和2.73%～33.85%。同一濃度下不同絡合物相比,銅絡合物的抑制活性顯著高于其他兩種絡合物,而鈣和鈉絡合物相比除40 mg/L處理下鈣絡合物抑菌率顯著高于鈉絡合物外,其余均無顯著性差異(表1)。銅、鈣和鈉絡合物的EC50(EC10)分別為24.99(8.60)、>50(20.73)和>50 mg/L(21.49 mg/L)(表2)。

對蘋果斑點落葉病菌,盡管其三種絡合物在10～40 mg/L濃度處理下的抑菌活性均較低,銅、鈣和鈉絡合物抑菌率分別只有6.20%～46.09%、3.77%～47.17%和3.32%～35.31%,但在50 mg/L的高濃度下分別提高到73.58%、100.00%和100.00%。同一濃度下不同絡合物相比,抑菌率變化較大(表1)。三者的EC50(EC10)分別為38.26(14.90)、35.34(20.58)和38.16 mg/L(22.57 mg/L)(表2)。

對大蔥紫斑病菌,其銅、鈣和鈉絡合物的抑菌活性均相對較低,在10～50 mg/L濃度處理下的抑菌率分別只有8.99%～73.03%、15.73%～69.66%和8.20%～69.66%,但各濃度處理間均達差異顯著水平。同一濃度下不同絡合物相比,除在30 mg/L和50 mg/L處理下三種絡合物的抑菌率間無顯著差異外,其余濃度下差異性較大(表1)。三者的EC50(EC10)分別為34.09(12.36)、38.97(8.70)和40.92 mg/L(14.36 mg/L)(表2)。

對玉米紋枯病菌,銅、鈣和鈉絡合物的抑菌活性盡管各濃度處理間差異顯著,但均相對較低,在10～50 mg/L濃度下的抑菌率分別只有14.73%～60.58%、14.11%～50.21%和13.81%～66.39%。同一濃度下不同絡合物相比,抑菌率差異性較大(表1)。雖然三者的EC10均低于10 mg/L,分別為8.80、7.31和9.66 mg/L,但它們的EC50均較高,分別達39.35、45.72和39.37 mg/L(表2)。

對番茄灰霉病菌,其銅、鈣和鈉絡合物在10～30 mg/L的低濃度下抑菌率相對較低,分別只有12.82%～49.42%、7.69%～24.50%和9.09%～50.58%,但濃度增加至40 mg/L后,活性明顯增強,在50 mg/L的處理濃度下抑菌率分別高達96.27%、96.50%和94.41%,且各濃度處理間差異顯著。同一濃度下不同絡合物相比,除在50 mg/L處理下三種絡合物的抑菌率無顯著差異外,其余濃度下差異較大(表1)。銅、鈣、鈉絡合物的EC50均較低,分別只有25.18、29.43和27.31 mg/L,EC10也分別達12.67、16.39 和13.34 mg/L(表2)。

銅、鈣和鈉絡合物對11種植物病原真菌菌絲生長的EC90(抑制90%病菌生長所需濃度)除對棉花枯萎病分別為45.68、50.32 和46.49 mg/L外,其余均明顯高于50 mg/L。

表2　3種絲柏油醇絡合物對11種植物病原真菌菌絲生長抑制活性的回歸分析

續表2Table 2 (Continued)

病原菌Fungus絲柏油醇絡合物Hinokitiolclathrates回歸方程Regressionequation相關系數(r)CorrelationcoefficientEC10/mg·L-1EC50/mg·L-1EC90/mg·L-1棉花枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum銅絡合物y=5.504x-7.8540.94715.6326.7345.68鈣絡合物y=4.777x-6.8480.93314.6327.1350.32鈉絡合物y=3.870x-5.1710.93310.1221.6946.49小麥赤霉病菌Gibberellazeae銅絡合物y=4.205x-6.4560.97417.0034.31>50鈣絡合物y=2.622x-4.0420.94711.2934.80>50鈉絡合物y=1.235x-2.3680.9307.58>50>50西瓜炭疽病菌Colletotrichumorbiculare銅絡合物y=2.766x-3.8660.9948.6024.99>50鈣絡合物y=2.465x-4.5270.99020.73>50>50鈉絡合物y=2.046x-4.0080.94421.49>50>50蘋果斑點落葉病菌Alternariaalternata銅絡合物y=3.129x-4.9530.95914.9038.26>50鈣絡合物y=5.458x-8.4510.90620.5835.34>50鈉絡合物y=5.618x-8.8850.91022.5738.16>50大蔥紫斑病菌Alternariaporri銅絡合物y=2.909x-4.4580.97912.3634.09>50鈣絡合物y=1.967x-3.1300.9098.7038.97>50鈉絡合物y=2.818x-4.5420.94114.3640.92>50玉米紋枯病菌Rhizoctoniasolani銅絡合物y=1.970x-3.1420.9778.8039.35>50鈣絡合物y=1.610x-2.6730.9907.3145.72>50鈉絡合物y=2.100x-3.3500.9559.6639.37>50番茄灰霉病菌Botrytiscinerea銅絡合物y=4.298x-6.0220.91312.6725.18>50鈣絡合物y=5.042x-7.4050.87616.3929.43>50鈉絡合物y=4.118x-5.9140.94713.3427.31>50

3　討論與結論

上述研究結果表明,絲柏油醇的3種絡合物對11種常見的植物病原真菌菌絲的生長均有不同程度的抑制作用,對棉花枯萎病菌和番茄灰霉病菌的抑制作用相對較強。三種絡合物對各種病原菌的抑制活性差異較大,既體現在EC50的不同,也體現在EC10的不同。根據EC50分析,3種絡合物對小麥全蝕病菌的效果基本相當;對柑橘炭疽病菌，銅絡合物的效果明顯高于鈣和鈉絡合物;對蘋果輪紋病菌和番茄灰霉病菌以銅絡合物的效果最高,鈉絡合物次之,鈣絡合物較低;對黃瓜枯萎病菌以鈣絡合物的效果最高,銅絡合物次之,鈉絡合物較低;對棉花枯萎病菌以鈉絡合物的效果最高,銅和鈣絡合物次之;對小麥赤霉病菌銅和鈣絡合物的效果相當,均高于鈉絡合物;對西瓜炭疽病菌銅絡合物的效果明顯高于鈣和鈉絡合物;對斑點落葉病菌以鈣絡合物的效果最高,銅和鈉絡合物次之;對大蔥紫斑病菌以銅絡合物的效果最高,鈣絡合物次之,鈉絡合物較低;對玉米紋枯病菌銅和鈉絡合物的效果相當,但明顯高于鈣絡合物。除鈣絡合物對柑橘炭疽病菌和西瓜炭疽病菌、鈉絡合物對柑橘炭疽病菌、西瓜炭疽病菌和小麥赤霉病菌的EC50高于50 mg/L外,其余均在20.39～45.72 mg/L之間。說明3種絲柏油醇絡合物均具有農用防除上述植物病原真菌的潛力,且銅絡合物的活性相對較高。但由于藥劑的作用受很多因素的影響,其室內毒力測定結果和田間藥效未必完全一致,因此,還有待于做進一步的田間防治效果試驗。

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(責任編輯：楊明麗)

Antagonism of three kinds of hinokitiol clathrates against eleven kinds of plant pathogenic fungi

Luo Xiaoyong1,Xu Dan1,Yang Congjun1,Xing Xiaoxia1,Song Jiqing2

(1. College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University; Key Lab of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province, Qingdao266109, China; 2. Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-Environment & Climate Change, Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Dryland Farming and Water-Saving Agriculture, Ministry of Agriculture, Beijing100081, China)

Inhibitory effects of three hinokitiol clathrates on hypha growth of 11 kinds of plant pathogenic fungi, includingGaeumannomycesgraminisvar.triticiWalker,Gibberellazeae(Schw.) Petch.,Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Penz. & Sacc.,Botryosphaeriadothidea(Moug.) Ces.etDe Not.,Fusariumoxysporum(Schl.) f.sp.cucumerinumOwen,F.oxysporumf.sp.vasinfectum(Atk.) Sndyder & Hansln,Colletotrichumorbiculare(Berk. & Mont.) Arx,Alternariaalternataf.sp.mali,A.porri(Ellis) Ciferri,RhizoctoniasolaniKühn. andBotrytiscinereaPers., were determined with mycelium growth rate method. The results showed that the three hinokitiol clathrates had different inhibitory activities against the 11 pathogenic fungi. Among them, the inhibitions of the three compounds onF.oxysporumandB.cinereawere relatively higher, with the median effective concentrations (EC50) of 21.69-27.13 mg/L and 25.18-29.43 mg/L, respectively. The EC50values of three compounds on other pathogen fungi were below 45.72 mg/L, except that hinokitiol-Ca onC.gloeosporioidesandC.orbiculare, and hinokitiol-Na onC.gloeosporioides,C.orbiculareandG.zeae, which were over 50 mg/L. It suggested that the three hinokitiol clathrates may have potential control effects on the above plant diseases, especially hinokitiol-Cu demonstrated higher inhibitory activity.

hinokitiol clathrates;plant pathogenic fungi;antagonism

2015-08-22

2015-09-13

教育部留學回國人員科研啟動基金；山東省“泰山學者”建設工程專項

E-mail：songjiqing@caas.cn

S 432

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.042