SIRT3通過Rb/p16途徑促進肝癌細胞衰老的研究*

宋春麗，黃　榮，李澤華，周義文△

(南方醫科大學深圳醫院：1.臨床檢驗醫學中心；2.燒傷整形科，廣東深圳 518100 )

?

SIRT3通過Rb/p16途徑促進肝癌細胞衰老的研究*

宋春麗1，黃榮1，李澤華2，周義文1△

(南方醫科大學深圳醫院：1.臨床檢驗醫學中心；2.燒傷整形科，廣東深圳 518100 )

目的探討沉默信息調節因子3(SIRT3)對肝癌細胞老化的作用，并初步研究其作用機制。方法通過轉染SIRT3基因，使其在肝癌細胞內過表達。用實時熒光定量PCR和Western blot技術驗證SIRT3基因的過表達效果；BrdU標記實驗檢測它對肝癌細胞增殖的影響；β-半乳糖苷酶染色檢測肝癌細胞的老化情況；Western blot檢測它對衰老相關基因Rb、p16、P53蛋白表達的影響。結果SIRT3過表達質粒使肝癌細胞中SIRT3的mRNA及蛋白水平明顯增加。SIRT3基因的過表達能抑制肝癌細胞的增殖，抑制率為40%～50%；同時，SIRT3基因過表達能顯著誘導肝癌細胞G2期周期阻滯：轉染pc-DNA3.1質粒的對照組細胞處于G2期比例為(22.83±1.58)%，而轉染SIRT3基因的實驗組處于G2期細胞為(35.65±1.55)%；SIRT3基因過表達使肝癌細胞中衰老相關的β-半乳糖苷酶染色較對照組顯著增高，陽性細胞占40%～50%，差異有統計學意義(P<0.05)，并伴隨衰老相關基因Rb、p16蛋白表達水平明顯增加。結論SIRT3基因過表達可能通過Rb/p16途徑促進肝癌細胞衰老。

沉默信息調節因子3；肝細胞癌；細胞衰老

肝細胞癌(HCC)占原發性肝癌的90%[1]。HCC起病隱匿,出現典型臨床癥狀時大多已處于中晚期,失去手術機會,自然生存期不超過半年[2]。sirtuin家族是一類依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ類組蛋白去乙?；竅3]，包括SIRT1～SIRT7,沉默信息調節因子3(SIRT3)是線粒體內主要的去乙?；?，一般存在于線粒體基質中，在成熟過程中它的N末端在線粒體基質容易被水解。只有被切割的SIRT3蛋白才具有活性，當SIRT3信號肽被切除以后，它使組蛋白去乙?；瘡亩l揮其活性。SIRT3作為一種線粒體蛋白，主要在以下方面發揮著重要作用，如細胞凋亡[4]、物質代謝[5]、細胞老化[6]、能量產生[7]和細胞內信號控制等[8]。近年來SIRT3在腫瘤中的作用日益受到人們的關注，但其在HCC中發生、發展過程中的機制還不完全清楚。本研究通過將過表達SIRT3基因的質粒轉染于肝癌細胞中，檢測SIRT3基因過表達對肝癌細胞老化的作用，并初步探討其作用機制，以尋求其對肝癌基因治療的意義。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器熒光定量PCR儀、Western blot 電泳儀、Western blot 電轉膜儀均購自美國Bio-rad公司，Mastercycler96孔普通PCR儀、5810R臺式高速低溫離心機購自美國Eppendorf公司，酶標儀購自美國Gene Company Limited公司。

1.1.2試劑人肝癌細胞株SK-Hep-1購自ATCC公司，SIRT3質粒(載體為pc-DNA3.1)、pc-DNA3.1質粒購自Addgene公司。Brdu ELISA試劑盒購自羅氏公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，SIRT3抗體(#2627)、P16抗體(#4824)、P53抗體(#2527)、Rb抗體(#9313)、β-actin 抗體(#4970) 購自CST公司，二抗購自瑞典GE healthcare公司。反轉錄試劑盒購自美國伯樂公司，LightCycler?FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Roche 12239264001購自羅氏公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養將SK-Hep-1肝癌細胞株在含有1%青/鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，放置于37 ℃細胞培養箱，于5% CO2的環境中進行常規培養。

1.2.2實時熒光定量PCR(qPCR)檢測SIRT3基因過表達的mRNA水平提取細胞中的RNA，用30 μL去RNA酶的水將RNA溶解，測濃度,電泳檢測RNA提取質量，純度合格后構建反轉錄反應體系：1 000 ng RNA，5×反應混合液4 μL，iScript酶混合液1 μL，去RNA酶水補齊至20 μL。充分混勻后按以下條件反應:25 ℃ 5min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。構建10 μL qPCR體系:反轉錄產物1 μL，去RNA酶水3.6 μL，SYBR Green qPCR Mix(2×)5 μL，SIRT3上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL。反應條件:預變性95 ℃ 2 min;變性94 ℃ 20 s,退火60 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 20 s,隨后75 ℃ 1 s,34個循環,從第2個循環開始讀數，溶解曲線為55～95 ℃,每次波動1 ℃,保持2 s。SIRT3引物序列，F：5′-ATCGATGGGCTTGAGAGAGT-3′；R：5′-AGGTTCCATGAGCTTCAACC-3′。所有測試管均采用三管重復，并重復實驗3次，取其平均值。

1.2.3Western blot檢測SIRT3基因過表達的蛋白水平種SK-Hep-1細胞(每孔8×104)于6孔板中，24 h后將表達SIRT3的質粒轉染進SK-Hep-1細胞中，同時以pc-DNA3.1作為空白對照，24 h后換液繼續培養72 h，然后裂解細胞進行Western blot檢測。

1.2.4BrdU標記法檢測肝癌細胞增殖SK-Hep-1細胞以25×104/mL細胞數接種于6孔板中24 h分別轉染了pc-DNA3.1、SIRT3,第2天再以6 000/每孔的細胞數分至96孔板培養2 d，終止細胞培養前，加入BrdU(終濃度為30 μg/L)，37 ℃ 6 h，用FixDenat37溶液固定細胞30 min，加抗BrdU單抗(工作濃度1∶100)，陰性對照孔加磷酸鹽緩沖液(PBS，室溫，90 min)，酶標儀讀取的OD值跟細胞內DNA的合成速率呈正比。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期將表達SIRT3的質粒轉染進SK-Hep-1細胞中，以pc-DNA3.1作為空白對照，96 h后收集細胞，應用5 mL的PBS洗滌收集的細胞3次，離心沉淀細胞，棄上清液，70%預冷的乙醇-20 ℃過夜固定，離心固定過的細胞，棄上清液，PBS洗滌細胞3次用來除去殘留的乙醇，用含有0.2 mg RNase A的1 mL PI/Triton X-100染色液(20 μg PI/0.1% Triton X-100)重懸細胞，37 ℃染色15 min。上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6衰老因子相關的β-半乳糖苷酶染色將生長狀態良好的SK-Hep-1細胞接種至6孔板中，24 h后分別轉染pc-DNA3.1、SIRT3質粒。轉染4 d后加入X-Gal底物，進行跟衰老相關的β-半乳糖苷酶染色，在光學顯微鏡下觀察變成藍色的表達β-半乳糖苷酶的細胞數，隨機選擇3個視野進行觀察，每個視野計數200個細胞，計算β-半乳糖苷酶染色陽性的細胞占總細胞數的百分比。

1.2.7Western blot分析衰老相關蛋白提取肝癌細胞中的蛋白，BCA法檢測樣本蛋白水平，取蛋白總量為30 μg的樣品，加入對應體積的 6×SDS蛋白質電泳上樣緩沖液(含β巰基乙醇)，95 ℃ 10 min使蛋白變性，在含有8%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的凝膠中120 V恒壓電泳1.5 h，然后90 V恒壓轉膜4 h，將NC膜轉至5%脫脂牛奶中封閉，搖床上室溫1 h，TBST洗滌后分別加入用5%BSA稀釋的一抗中(SIRT3抗體的工作濃度1∶3 000，P16抗體、P53抗體、Rb抗體的工作濃度均為1∶1 500)，搖床，4 ℃過夜，1×TBST洗滌3次，將NC膜置于用5%脫脂牛奶稀釋用HRP標記的二抗(工作濃度1∶3 000)中，搖床，室溫2 h后，1×TBST洗滌3次，5 min 1次，然后將NC膜置在暗盒中ECL顯影曝光。

2　結　　果

2.1qPCR檢測SIRT3的過表達效果將SIRT3質粒轉染SK-Hep-1細胞，同時以pc-DNA3.1作為空白對照，轉染72 h后提取細胞總RNA。結果顯示轉染了SIRT3質粒的肝癌細胞mRNA水平較對照組明顯增加，說明SIRT3基因的過表達是成功的。見圖1。

注：1為pc-DNA3.1；2為SIRT3；aP<0.05。

2.2Western blot檢測SIRT3基因過表達的蛋白水平將SIRT3質粒轉染SK-Hep-1細胞，同時以pc-DNA3.1作為空白對照，轉染72 h后提取細胞蛋白裂解液進行Western blot檢測，結果顯示轉染了SIRT3質粒的肝癌細胞中SIRT3基因的蛋白水平較對照組明顯增加，說明SIRT3的蛋白水平也成功地過表達，見圖2。

注：1為pc-DNA3.1；2為SIRT3。

2.4SIRT3基因過表達對細胞周期的影響將pc-DNA3.1、SIRT3質粒分別轉染SK-Hep1細胞，轉染96 h后固定細胞進行流式細胞術分析。結果顯示，轉染SIRT3的細胞處于G2期細胞較對照組細胞(pc-DNA3.1組)明顯增加(P<0.05)，說明SIRT3基因過表達會誘使細胞產生G2期細胞周期阻滯。見圖3和表1。

注：1為pc-DNA3.1；2為SIRT3；aP<0.05。

表1　　流式細胞術檢測細胞周期(%)

注：與pc-DNA3.1組比較，aP<0.05。

注：1為pc-DNA3.1;2為SIRT3；aP<0.05。

2.5SIRT3基因過表達誘導肝癌細胞衰老在光學顯微鏡下觀察到變成藍色的表達β-半乳糖苷酶的細胞數較對照細胞明顯增多；在SK-Hep1細胞中，轉染SIRT3質粒的細胞的染色陽性細胞數比對照細胞多近3倍，以上結果說明SIRT3過表達誘導肝癌細胞老化。見圖4。

2.6SIRT3基因過表達促進衰老相關蛋白Rb、p16和p53的表達Western blot結果顯示在SK-Hep-1細胞中，SIRT3基因過表達使SK-Hep1細胞中Rb蛋白和p16蛋白的表達量明顯增多，而p53蛋白的表達量卻沒有明顯變化。Rb可以通過誘導p16的表達從而引起細胞周期阻滯，從而在細胞衰老中起關鍵作用。提示SIRT3過表達可能通過調控Rb/p16途徑誘導了細胞衰老。見圖5。

圖5　　　　　Western blot分析轉染SIRT3質粒96 h后的細胞中Rb、p16和p53蛋白水平

3　討　　論

近年來，SIRT3在腫瘤發生、凋亡及調控中的作用越來越受到人們的關注。SIRT3可以通過調節KU70-Bax通路參與細胞凋亡[9]，通過去乙?；疭OD2、MnSOD來調節氧化應激反應[10-11]，通過調節p53途徑來誘導老化等[7]。SIRT3在一些腫瘤中也起著雙重調節的作用，比如它在口腔癌中表達上調，對口腔癌起促進腫瘤發生的作用[12]，而在乳腺癌[13]、骨肉瘤[14]、結腸癌[15]中表達降低，對腫瘤起抑制作用。SIRT3在肝癌中的作用及機制，目前國內外這方面的報道很少。本研究通過前期大量HCC標本的篩查,發現SIRT3在人HCC組織中的表達明顯低于癌旁組織，同時發現SIRT3在多個肝癌細胞系中也呈現低表達狀態[16]。在本研究發現SIRT3過表達可使肝癌細胞受到明顯抑制，引起細胞周期G2期細胞阻滯，并使與老化相關的β-半乳糖苷酶明顯增加，Western blot檢測發現部分老化相關基因(Rb、p16)的蛋白表達水平均明顯增加，而p53蛋白表達卻沒有明顯變化，從而得出 IRT3基因的過表達可能通過Rb/p16途徑,而不是p53/p21途徑促進肝癌細胞衰老從而抑制細胞的增殖。筆者前期報道過SIRT1基因沉默后引起細胞周期G1期細胞阻滯，衰老相關基因p53和p21蛋白表達增加，可能通過p53/p21途徑促進細胞衰老[17]。說明SIRT1和SIRT3雖同屬于sirtuin家族，但在肝癌細胞衰老中的作用路徑和調控機制卻有明顯差異，甚至發揮相反的作用，特別是其作用在細胞內的信號通路也會有明顯不同，進一步加深了研究者對sirtuin家族了解的興趣。

細胞衰老是引起生物體老化的一種潛在因素，也被認為是生物體抑制腫瘤的一種方式。目前研究報道普遍認為端粒長度的縮短是觸發細胞老化的關鍵因素[18-19]。本課題計劃下一步將合成Rb和p16 siRNA，觀察Rb和p16基因干擾后是否逆轉SIRT3過表達引起的部分老化，以提供更充分的證據確定它是否通過Rb/p16途徑引起肝癌細胞的衰老，并通過qPCR篩查端粒酶反轉錄酶(TERT)和保護端粒蛋白復合體(包括TRF1和POT1等)以及其他的端粒相關蛋白，希望通過對SIRT3在HCC中的功能鑒定和研究，加深對肝癌細胞老化機制的認識，為尋找新的肝癌治療靶點打下基礎。

[1]Brau N,Fox RK,Xiao P,et al.Presentation and outcome of hepatocellular carcinoma in HIV infected patients:a U.S.-Canadian multicenter study[J].J Hepatol,2007,47(4):527-537.

[2]Yuen MF,Hou JL,Chutaputti A,et al.Hepatocellular carcinoma in the Asia pacific region[J].J Gastroenterol Hepatol,2009,24(3):346-353.

[3]Imai S,Armstrong CM,Kaeberlein M,et al.Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase[J].Nature,2000,403(6771):795-800.

[4]Marfe G,Tafani M,Indelicato M,et al.Kaempferol induces apoptosis in two different cell lines via Akt inactivation,Bax and SIRT3 activation,and mitochondrial dysfunction[J].J Cell Biochem，2009，106(4):643-650.

[5]Hirschey MD,Shimazu T,Huang JY,et al.SIRT3 regulates mitochondrial protein acetylation and intermediary metabolism[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2011，76:267-277.

[6]Li S,Banck M,Mujtaba S,et al.p53-induced growth arrest is regulated by the mitochondrial SirT3 deacetylase[J].PLoS One，2010，5(5):e10486.

[7]Ahn BH,Kim HS,Song S,et al.A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis[J].Proc Nat Acad Sci U S A,2008,105(38)：14447-14452.

[8]Jing E,Emanuelli B,Hirschey MD,et al.Sirtuin-3(Sirt3) regulates skeletal muscle metabolism and insulin signaling via altered mitochondrial oxidation and reactive oxygen species production[J].Proc Nat Acad Sci U S A，2011，108(35):14608-14613.

[9]Sundaresan NR,Samant SA,Pillai VB,et al.SIRT3 is a stress-responsive deacetylase in cardiomyocytes that protects cells from stress-mediated cell death by deacetylation of Ku70[J].Mol Cell Biol，2008，28(20):6384-6401.

[10]Qiu X,Brown K,Hirschey MD,et al.Calorie restriction reduces oxidative stress by SIRT3-mediated SOD2 activation[J].Cell Metab，2010，12(6):662-667.

[11 ]Tao R,Coleman MC,Pennington JD,et al.Sirt3-mediated deacetylation of evolutionarily conserved lysine 122 regulates MnSOD activity in response to stress[J].Mol Cell，2010，40(6):893-904.

[12]Alhazzazi TY,Kamarajan P,Joo N,et al.Sirtuin-3(SIRT3),a novel potential therapeutic target for oral cancer[J].Cancer，2011，117(8):1670-1678.

[13]Zhang L,Ren X,Cheng Y,et al.Identification of Sirtuin 3,a mitochondrial protein deacetylase,as a new contributor to tamoxifen resistance in breast cancer cells[J].Biochem Pharmacol，2013，86(6):726-733.

[14]Aquila PD,Rose G,Panno ML,et al.SIRT3 gene expression:a link between inherited mitochondrial DNA variants and oxidative stress[J].Gene，2012，497(2):323-329.

[15]Bell EL,Emerling BM,Ricoult SJ,et al.SirT3 suppresses hypoxia inducible factor 1alpha and tumor growth by inhibiting mitochondrial ROS production[J].Oncogene，2011，30(26):2986-2996.

[16]Song CL,Tang H,Ran LK,et al.Sirtuin 3(SIRT3) inhibits hepatocellular carcinoma growth through the glycogen synthase kinase-3β/BCL2-associated X protein-dependent apoptotic pathway[J].Oncogene，2016，35(5):631-641.

[17]宋春麗,任吉華,張禎禎，等.SIRT1基因沉默誘導肝癌細胞老化及其機制[J].第三軍醫大學學報，2012，34(19)：1929-1932.

[18]Deng,Y,Chan SS,Chang S.Telomere dysfunction and tumour suppression:the senescence connection[J].Nat Rev Cancer,2008，8(6):450-458.

[19]Stewart SA,Weinberg RA.Telomeres:cancer to human aging[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2006，22:531-557.

Study on the SIRT3 inducing senescence in hepatocelluar carcinoma cells through the Rb/p16 pathway*

SONGChunli1,HUANGRong1,LIZehua2,ZHOUYiwen1△

(1.CenterforClinicalLaboratoryMedicine,ShenzhenHospitalofSouthernMedicalUniversity,Shenzhen,Guangdong518100,China;2.BurnandPlasticSurgeryDepartment,ShenzhenHospitalofSouthernMedicalUniversity,Shenzhen,Guangdong518100,China)

ObjectiveTo study the effect of SIRT3 gene(SIRT3) on aging of hepatocellular carcinoma cells(HCC) and it's mechanism.MethodsSIRT3 over-expression was targeted by plasmid transfected technology.Effect of SIRT3 on aging of HCC was detected by RT-PCR and Western blot,respectively.Proliferation of HCC was assayed by Brdu-labeling test.Cell cycle of HCC was displayed by flow cytometry.Aging of HCC was observed with SA-β-gal staining.Aging-related Rb,p16,P53 proteins were demonstrated by Western blot.ResultsSIRT3 over-expression significantly upregulated the SIRT3 mRNA and protein expression levels in HCC.SIRT3 suppressed the proliferation of HCC with an suppression rate of 40%-50%,and significantly induced cell cycle arrest of HCC at stage G2.The proportion of pc-DNA3.1,SIRT3 plasmid transfected HCC at stage G2was about (22.83±1.58)% and (35.65±1.55)%.The aging-related β-galactosidase-stained HCC were significantly greater with a positive rate of 40%-50%(P<0.05),and the aging-related Rb,p16 protein expression levels were significantly higher.ConclusionSIRT3 promotes the aging of HCC possibly through the Rb/p16 pathway.

SIRT3;hepatocellular carcinoma;cell aging

廣東省醫學科學技術研究基金資助項目(A2016568)；廣東省深圳市衛生計生系統科研基金(201601043)。

宋春麗，女，主管技師，主要從事分子生物學研究?！?/p>

，E-mail:yiwenzhou21@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.006

A

1673-4130(2016)16-2220-04

2016-06-23

2016-07-29)