直接免疫熒光法快速檢測甲型流感病毒抗原的臨床意義*

劉玉蘭，何鳳屏△，肖　蕓，馬占忠，管振祺，郭艷樂，肖　捷，候紅梅，楊玉婷

(1.廣東省韶關市粵北人民醫院　512026；2.上海星耀醫藥有限公司　200444)

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直接免疫熒光法快速檢測甲型流感病毒抗原的臨床意義*

劉玉蘭1，何鳳屏1△，肖蕓1，馬占忠1，管振祺1，郭艷樂1，肖捷1，候紅梅1，楊玉婷2

(1.廣東省韶關市粵北人民醫院512026；2.上海星耀醫藥有限公司200444)

目的探討直接免疫熒光法快速檢測早期甲型流感病毒抗原及其臨床應用。方法選擇臨床上診斷為急性呼吸道感染入院的患者，采集標本200例，將其分為兩組：冬春兩季流行季節兒童組(100例)和夏秋兩季非流感流行期間兒童組(100例)，使用美國D3 Ultra甲型流感病毒抗原檢測試劑，采用熒光標記的單克隆抗體對感冒患者進行甲型流感病毒抗原檢測。結果在冬春兩季流感流行期間，100例兒童檢測有8例陽性，陽性率為8%；在夏秋兩季非流感流行期間100例兒童檢測有2例陽性，陽性率為2%；兩組陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論運用直接免疫熒光法快速檢測甲型流感毒感抗原是一種經濟、高效、快速、特異的檢測方法，能指導臨床快速診斷，合理用藥。

甲型流感病毒;直接免疫熒光;抗原;兒童

呼吸道病毒是指一大類能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病變或僅以呼吸道為侵入門戶，主要引起呼吸道外組織器官病變的病毒。目前已證明兒童95%的急性上呼吸道感染和大部分下呼吸道感染是由細菌以外的病原體引起的，其中病毒感染最為常見。呼吸道感染的病毒病原學因不同國家、不同省市和地區、不同年份、季節和年齡等而異。近年來隨著各種抗生素的廣泛應用，呼吸道細菌感染有所降低，而呼吸道病毒感染呈上升趨勢[1]。國內目前對于呼吸道病毒診斷的方法和技術還遠落后于發達國家，從病發到確診往往需要一周左右的時間從而錯過了治療的最佳時間。采用免疫熒光抗原檢測既能實現在呼吸道病毒感染的初始階段進行特異性診斷，又可以避免病毒分離培養費時費力的缺點，因此是對呼吸道病毒進行檢測的理想方法[2]。本文分析直接免疫熒光法用于甲型流感抗原的快速檢測，該研究對粵北人民醫院2013年和2014年兩年間分別在春、夏、秋、冬季節住院的200例呼吸道感染患兒的呼吸道病毒采用直接免疫熒光法進行快速檢測，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013～2014年粵北人民醫院呼吸道感染住院患兒200例，由患者的病史、X線片以及輔助檢查等結果以及原衛生部頒發的《甲型H1N1流感診療方案及診斷標準(2010年版)》[3]中規定的呼吸道感染診斷標準得到確診。其中男120例、女80例，年齡0～12歲。按照入院的季節將其分為兩組：冬春兩季流行季節兒童組(100例)和夏秋兩季非流感流行期間兒童組(100例)。

1.2方法

1.2.1標本采集由專職人員將一次性采樣導管經鼻腔插入7～8 cm到達鼻咽部，通過負壓誘導吸取1.0～2.0 mL分泌物置于10～15 mL放入微生物轉運液的試管中,避免混入唾液及奶液而影響檢出率，標本2 h內送檢。

1.2.2標本處理及制片用漩渦混勻器打散黏液，2 500 r/min離心10 min，棄去上清液(用于病毒分離鑒定)，留約100～150 μL，吸管吹打混勻，形成混濁細胞懸浮液。將標本點樣在載玻片上(15～20 μL)，用電吹風機冷風下風干10～15 min至干燥，浸沒在冷丙酮中固定10 min，取出晾干。

1.2.3標本反應及觀察每個標本分別加D3試劑一滴(25 μL)，必須完全覆蓋待測標本。將載玻片放在濕盒中置于37 ℃培養箱孵育15～30 min。載玻片用PBS沖洗一遍，然后浸沒在PBS中洗兩遍(PBS不能重復使用)。在載玻片中央加一滴封閉液，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4結果判斷200倍顯微鏡下每視野找到≥2個綠色熒光細胞即為陽性，否則為陰性。陰性細胞被Evans Blue染成紅色。

1.3統計學處理應用SPSS17.0統計軟件進行分析，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1甲型流感病毒陽性結果FITC標記的病毒特異性抗體和細胞中相應的抗原結合后，形成抗原抗體復合物，在熒光顯微鏡下細胞內呈黃綠色熒光，該細胞稱為陽性細胞，見圖1。而未發生抗原抗體特異性反應的細胞被Evans Blue染成紅色，見圖2。

圖1 甲型流感病毒陽性結果 圖2 甲型流感病毒陰性結果

2.2不同季節兩組兒童甲型流感病毒感染情況冬春兩季流感流行期間，100例兒童檢測有8例陽性，陽性率為8%；在夏秋兩季非流感流行期間100例兒童檢測有2例陽性，陽性率為2%；兩組陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)。

3　討　　論

在病毒流行季節，根據患兒的年齡和臨床表現，不難作出病毒感染診斷，但特異性病因學診斷對臨床預后、傳播方式、防治措施、危重患兒的監護及合理用藥十分重要。甲型流感病毒又稱A型流感病毒，在動物中廣為分布，能造成世界流感大流行,病毒感染免疫力較弱的兒童時會引起較嚴重的癥狀，如肺炎或是心肺衰竭等[4-5]。血清學檢查是目前應用較廣泛的感染性疾病檢測方法，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中是否存在針對呼吸道病毒的特異性抗體，作為呼吸道病毒感染診斷的依據，但病毒特異性抗體通常在病毒感染一周以后方能在血液中被檢測到，因此難以實現對病毒感染的早期及時診斷。在甲型流感病毒流行季節，快速、準確檢測出該病毒感染能及時指導臨床治療，為合理選用抗病毒、抗細菌藥物提供依據，從而能避免嚴重并發癥的出現。目前臨床甲型流感病毒有多種方法，但均存在一定的局限性[6]。電鏡可檢測病毒顆粒，但操作復雜、昂貴，不適用于臨床快速診斷；病毒分離培養被稱為“金標準”，但費時、耗力，標本內病毒數量少時會出現假陰性。病毒核酸檢測應用雜交或PCR技術，通過檢測病毒特異性核酸來發現相關病毒；此法靈敏度高，能進行微量檢測，但實驗條件嚴格，容易出現假陽性或假陰性[7]。本文采用熒光標記的單克隆抗體對感冒患兒進行甲型流感病毒抗原檢測，結果判斷以見到≥2個完整細胞內有明亮的黃綠色熒光為陽性，整個實驗到發出報告可以在3 h內完成，而設備只需要熒光顯微鏡，在普通實驗室即可開展，有效地保證了快速出具診斷結果，滿足臨床對治療時效性的要求。

在冬春兩季流感流行期間，本文所檢測的甲型流感病毒感染患兒陽性率為8%，夏秋兩季非流感流行期間陽性率為2%，可見不同季節兒童感染甲型流感病毒的情況也有所不同，冬春兩季的感染率高于夏秋兩季(P<0.05)，說明冬春兩季是甲型流感病毒感染的好發季節[8-9]。該病毒感染患兒時會引起較嚴重的癥狀，早期快速檢測病原體能為臨床提供病原學資料，及時對癥治療，縮短病程。運用直接免疫熒光法快速檢測甲型流感病毒抗原是一種經濟、高效、快速、特異的檢測方法[10]，能指導臨床快速診斷，合理用藥。

[1]李軍偉，孫南葉，王慧晶．流感病毒快速檢測法對甲型H1N1流感的臨床診斷價值[J]．當代醫學，2013，19(12)：83．

[2]賴曉亞，栗燕．直接免疫熒光抗體法和血清IgM檢測呼吸道病毒的比較[J]．中外婦兒健康，2011，19(3)：6-7．

[3]中華人民共和國衛生部.甲型H1N1流感診療方案：2010年版[S].北京：中華人民共和國衛生部，2010．

[4]黃一偉，高立冬，李芳彩，等．湖南省甲型H1N1流行性感冒大流行后乙型流行性感冒病毒的特征[J]．中華傳染病雜志，2012，30(6)：334-338．

[5]李忠，劉倜，林藝，等．2009年山東省四起甲型H1N1流行性感冒樣病例暴發疫情病原學分析[J]．中華預防醫學雜志，2010，44(12)：1069-1074．

[6]馬建敏．流感病毒分離的主要影響因素分析[J]．河南預防醫學雜志，2015，26(4)：244-245．

[7]Deng J,Ma Z,Huang W,et al.Respiratory virus multiplex RT-PCR assay sensitivities and influence factors in hospitalized children with lower respiratory tract infections[J].Virol Sin,2013,28(2):97-102.

[8]Liu Q,Lu L,Sun Z,et al.Genomic signature and protein sequence analysis of a novel influenza A(H7N9)virus that causes an outbreak in humans in China[J].Microbes Infect,2013,15(6/7):432-439.

[9]蘇明權，楊柳，馬越云，等．甲型H1N1流感病毒臨床實驗室診斷策略[J]．現代檢驗醫學雜志，2011，26(2)：19-22．

[10]李劍鴻．直接免疫熒光法用于多種呼吸道病毒抗原的快速檢測分析[J]．中外醫療，2013，32(22)：15-16．

Clinical significance of direct immunofluorescence assay for rapidly detecting influenza A virus antigen*

LIUYulan1,HEFengping1△,XIAOYun1,MAZhanzhong1,GUANZhenqi1,GUOYanle1,XIAOJie1,HOUHongmei1,YANGYuting2

(1.YuebeiPeople′sHospital,Shaoguan,Guangdong512026,China;2.ShanghaiXingyaoPhamarceuticalCo.Ltd.,Shanghai200444,China)

ObjectiveTo study the direct immunofluorescence method for rapidly detecting influenza A virus antigen and its clinical application.MethodsThe inpatients with clinically diagnosed acute respiratory tract infection were selected.Two hundred samples were collected and divided into two groups:the winter and spring epidemic seasons children group and the summer and autumn non-epidemic seasons children group,100 cases in each group.The US D3 Ultra influenza A virus antigen detection reagent was used.The fluorescence labeled monoclonal antibody was adopted to detect influenza A virus antigen in the patients with cold.ResultsDuring the winter and spring seasons of influenza prevalence,8 cases of 100 detected cases were positive with the positive rate of 8%;during the summer and autumn seasons of non-influenza prevalence,2 cases of 100 cases were positive with positive rate of 2%,the difference in the positive rate between the two groups had statistical significance(P<0.05).ConclusionApplying the direct immunofluorescence method for rapidly detecting influenza A virus antigen is an economical,efficient,rapid and specific detection method,and can guide clinical rapid diagnosis and rational medication.

influenza A virus;direct immunofluorescence;antigen;children

廣東省韶關市科技計劃項目(2013CX/K199)。

劉玉蘭，女，主管技師，主要從事檢驗醫學工作?！?/p>

，E-mail:fengphe@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.011

A

1673-4130(2016)16-2234-02

2016-01-07

2016-06-14)