血小板聚集功能檢測方法及參數的探索與研究

楚杜武，任軍偉，叢玉隆

(1.北京世紀壇醫院檢驗科　100038；2.兵器工業北京北方醫院檢驗科,北京 100089；3.解放軍總醫院西院檢驗科，北京 100853)

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血小板聚集功能檢測方法及參數的探索與研究

楚杜武1，任軍偉2，叢玉隆3△

(1.北京世紀壇醫院檢驗科100038；2.兵器工業北京北方醫院檢驗科,北京 100089；3.解放軍總醫院西院檢驗科，北京 100853)

目的采用5種血小板聚集功能分析儀探討研究血小板聚集功能檢測的可靠方法與準確參數。方法利用二磷酸腺苷(ADP)誘導光比濁血小板聚集儀(LTA)實驗，流式細胞儀(FC)血小板膜糖蛋白分子PAC-1(Fg、Ca2+、GPⅡb/Ⅲa形成復合物的受體)、CD62p(P選擇素)活化百分率檢測實驗，英諾華PL-11血小板分析儀實驗，VerifyNow抗血小板治療監測系統實驗(VerifyNow)與血栓彈力圖實驗(TEG)同時檢測對照組與單服用氯吡格雷組的血小板聚集功能。結果(1)對照組與患者組ADP%，ADP激活的PAC-1、CD62p受體活化百分率，MAR%，INHI%，TEG測得ADP誘導的MA(mm)值6個參數差異有統計學意義(P<0.05)；BASE、P2Y12受體的PRU，凝血酶誘導的MA(mm)值3個參數差異無統計學意義(P>0.05)。(2)ADP%與(100-INHI)%，MAR%，ADP激活的CD62p、PAC-1受體活化百分率呈正相關(r分別是0.565、0.939、0.769和0.583，P<0.05)；與TEG測得ADP誘導的血小板聚集率值(%Agg)無相關性(r=0.127，P>0.05)。結論(1)氯吡格雷有抗血小板聚集的效果。(2)LTA操作便捷、廉價、結果穩定，在醫院普及率高，是臨床監測血小板聚集功能的首選方法。

血小板；流式細胞儀；血小板膜糖蛋白；二磷酸腺苷

目前，我國心血管疾病患者人數已超過2.7億，按全國人口14億計算，近5個中國人中就有1人罹患心血管疾病。氯吡格雷現在已經成為心血管病患者最常用的抗血小板藥物之一，如何更有效、更準確掌握個體患者的服藥效果，科學施治，就要求有更好的臨床檢驗監測手段。當前，主要方法包括：光比濁法血小板聚集儀(LTA)實驗是觀察氯吡格雷藥效的金標準[1]；流式細胞儀(FC)血小板膜糖蛋白分子檢測是一種在分子水平觀察血小板聚集功能的新方法；VerifyNow抗血小板治療監測系統(VerifyNow)是近幾年在國際上逐漸推廣應用的新型比濁法抗血小板藥物治療監測系統；血栓彈力圖(TEG)最早應用于輸血的監測，目前經過改良后作為凝血監測方案已經在全世界40多個國家使用[2]。阻抗法連續監測血小板聚集的新型儀器包括英諾華PL-11分析儀等。這些方法各有怎樣的優勢和缺陷？本文通過對其功能與參數的對比、探討，希望能夠得出穩定、準確的測試方法及參數，使臨床工作者選擇準確、經濟、有效、直接、快速的實驗方法服務于患者。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑CHRONO-LOG MODEL700血小板聚集分析儀及其配套試劑(美國CHRONO-LOG公司)；BD FACSCalibur流式細胞儀(FC)及其配套原裝試劑(美國BD公司)；VerifyNow抗血小板治療監測系統(香港新儀儀器有限公司引進)及其配套光路質控板，試劑質控物，P2Y12阻斷劑檢測板，枸櫞酸鈉真空采血管；Thrombelastograph分析儀、配套高嶺土試劑瓶及一次性測試杯(美國Haemoscope公司)；PL-11血小板聚集分析儀及配套試劑(南京神州英諾華醫療科技有限公司)；Thermo IEC CL40離心機(美國Thermo公司)；Sysmex XE-2100血細胞分析儀及其配套試劑(日本Sysmex公司)；枸櫞酸鈉抗凝管(美國BD公司)。

1.2觀察對象及標本采集(1)使用隨機數字法選取從2011年7～10月在解放軍總醫院健康體檢的17例健康志愿者，其中男15例，女2例，年齡最大者69歲，最小者46歲，平均59歲；使用隨機數字法選取2011年7～11月在解放軍總醫院心血管內科就診的單獨服用氯吡格雷(75 mg/d)10 d以上的心腦血管病患者10例，年齡最大者74歲，最小者49歲，平均61歲。(2)用5支3.8%枸櫞酸鈉抗凝和1支肝素抗凝真空采血管采集靜脈血：5支3 mL，1支2 mL。其中1支3 mL枸櫞酸鈉抗凝血樣在離心前先取出混勻全血5 μL用于FC血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p受體檢測，然后進行英諾華PL-11血小板分析儀實驗；2支3 mL血樣進行LTA實驗；1支2 mL血樣進行VerifyNow實驗；1支3 mL枸櫞酸鈉抗凝和1支3 mL肝素抗凝血樣進行TEG實驗。

1.3方法(1)二磷酸腺苷(ADP)激活FC血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p受體活化百分率檢測：在室溫24～28 ℃[3]，熒光素標記的抗血小板單克隆免疫熒光染色，在陰性對照管中加鼠IgG1-FITC、CD61-PE各20 μL，測定管中加入CD62P-FITC、PAC-1-FITC各20 μL，再分別加入5 μL全血。置室溫避光反應15 min，立即加入110 mL1%多聚甲醛(2～6 ℃)混勻，2～8 ℃陰暗處放置30 min，立即上機獲取數據，檢測血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p受體活化百分數。(2)加入10 μmol/L ADP誘導劑進行LTA實驗，用血細胞分析儀測定富血小板血漿(PRP)的血小板濃度，用貧血小板血漿(PPP)調整PRP血小板濃度為(200～300)×109/L[3]，檢測ADP誘導血小板聚集率。(3)VerifyNow實驗：先做光路質控，然后取2 mL的Verifynow專用枸櫞酸鈉抗凝真空采血管標本，于24～28 ℃穩定10 min[3]，上下顛倒混勻10次，倒插入分析儀中，3 min后打印結果。(4)TEG實驗：運行ADP血小板圖檢測需采用3個通道，嚴格按照儀器說明書操作。第1個通道：枸櫞酸化高嶺土激活全血測試；第2個通道：A激活劑激活的樣品測試；第3個通道：ADP激活樣品測試，合成3個測試圖得出血小板的氯吡格雷(ADP受體抑制藥物)抑制率。(5)英諾華PL-11實驗：將標本置于儀器的待測試位置，按“檢測”鍵，直至儀器提示“加入誘聚劑”，用移液器抽取40 μL的誘聚劑加入標本中即可，等待測試完畢，打印結果。

1.4觀察指標ADP誘導LTA測得血小板聚集率(ADP%)；FC測得ADP激活血小板膜糖蛋白PAC-1和CD62p受體活化百分率；VerifyNow測得血小板聚集基線(BASE)、P2Y12受體的Reaction Units值(PRU)，血小板聚集抑制百分數(INHI%)；TEG測得ADP誘導最大幅度(MA)(mm)值，凝血酶誘導MA(mm)值；英諾華PL-11測得最大聚集率(MAR%)。

2　結　　果

2.1對照組與患者組觀察指標對比兩組檢測的ADP%，ADP激活的PAC-1、CD62p受體活化百分率， BASE、P2Y12受體的PRU，INHI%，TEG測得ADP誘導的MA(mm)值，凝血酶誘導的MA(mm)值，MAR%結果見表1。

表1　　各儀器測得對照組與單服氯吡格雷組參數對比

2.2LTA、FC、VerifyNow、TEG、PL-11測得所有觀察對象相關性本實驗觀察對象的ADP%，ADP激活的PAC-1、CD62p受體活化百分率，INHI%，TEG測得ADP誘導的血小板聚集率值(TEGADP%)，MAR%統計學雙變量相關性參數見表2。

表2　　LTA、FC、VerifyNow、TEG、PL-11測得所有觀察對象相關性

注：*P>0.05，表示相關性差，且單變量方差分析斜率差異性檢驗P<0.05，即直線斜率、截距有差異；其他參數P<0.05，相關性良好，且單變量方差分析斜率差異性檢驗P>0.05，即直線斜率、截距無差異。

3　討　　論

血小板活化后，顆粒膜蛋白CD62p、PAC-1活性顯著性改變[4]。PAC-1與血小板表面的GPⅡb/Ⅲa和纖維蛋白原(Fg)結合[5]，在Ca2+的協助下發生血小板聚集[2]。所以，檢測血小板聚集功能對于早期血栓形成的風險評估，闡明疾病的病理機制及臨床治療方案的選擇有重要意義。

本實驗中，5個儀器測得的健康對照組與單服氯吡格雷組參數對比，發現VerifyNow測得的PRU、BASE與TEG測得的MA(凝血酶)(mm)3個參數之間差異無統計學意義?？赡茉颍築ASE是凝血酶通路的血小板聚集率，MA(凝血酶)(mm)也是凝血酶激活的血小板聚集幅度值，這兩個參數無差異。這說明本次實驗健康對照組與患者組在凝血酶引起的凝血功能方面差異沒有統計學意義，但并不能下結論：凝血酶誘導的血小板聚集功能無差別。原因有二：(1)凝血酶是人體凝血系統最主要的節點，它不僅與血小板功能相關性強，與凝血因子的功能相關性也很強。此結果的產生很可能是兩者共同合力的作用，本研究并未分析凝血因子方面的狀況。(2)本實驗中，觀察例數還不足，普遍性有待進一步的研究。其他ADP%、ADP激活的PAC-1、CD62p受體活化百分率，INHI%，TEG測得ADP誘導的MA(mm)值6個參數有差異，證明氯吡格雷有一定的抗血小板聚集功能，但是抑制強度不強?？赡苁瞧渌幮П容^溫和，或者是與遺傳變異性、患者依從性差、氯吡格雷劑量不足以及CYP3A4相關的藥物間相互作用等因素有關[8]。從表2的結果可以看出其中相關性最好的是ADP%和MAR%。同時，ADP%與其他參數(TEG測得的%Agg除外)相關性都較好，說明了LTA是檢查血小板聚集功能的良好方法。而其他儀器參數之間相關性一般，說明 VerifyNow、FC兩種方法與LTA比較起來，優點并不明顯。TEG結果和其他4種儀器的分析結果基本無相關性，原因有：(1)本實驗的檢測例數較少，偶然性較大；(2)此方法學存在缺憾。具體原因需要同行們進行更深入的研究。

綜上所述，PL-11有一定的準確性與可靠性，可供臨床選擇；FC特異性好、靈敏度高，但費用昂貴，對操作技能要求高，可作為常規結果的輔助性確認；VerifyNow操作簡便，適用于急診、床邊檢驗(POCT)；TEG展示凝血全過程，其中可發現各環節的缺陷與異常，適于凝血系統異常的觀察判斷。LTA操作便捷、廉價、結果穩定，在醫院普及率高，是臨床監測血小板聚集功能的首選方法。

[1]Jeong YH，Kim IS，Choi BR，et al.The optimal threshold of high post-treatment platelet reactivity could be defined by a point-of-care VerifyNow P2Y12 assay[J].Eur Heart J，2008，29(17):2186-2187.

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Investigation of detection methods for aggregation function of platelets

CHUDuwu1,RENJunwei2,CONGYulong3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingShijitanHospital,Beijing100038,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingNorthHospitalofChinaNorthIndustriesGroupCorporation(CNGC),Beijing100089,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,WestBranchHospital,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853,China)

ObjectiveTo adopt 5 kinds of platelets aggregation function analyzer to explore and study the reliable method for detecting the platelets aggregation function and accurate parameters.MethodsThe platelets aggregation function in the control group and the single clopidogrel group was simultaneously detected by utilizing the ADP induced light turbidimetric platelet aggregation analyzer (LTA) test,flow cytometry for PAC-1(receptor of Fg,Ca2+,GPⅡb/Ⅲa forming complex) and CD62p(P selectin) activation percentage detection test,Innova PL-11 for platelets analysis test,VerifyNow anti-platelet therapy monitoring system and thrombelastogram(TEG).Results(1)The 6-parameter differences of ADP%,PAC-1 and CD62p receptor activation percentage activated by ADP，MAR%，INHI%， ADP induced MA value(mm) detected by TEG had statistical differences between the control group and the case group(P<0.05);PRU of BASE and P2Y12 receptor,thrombin induced MA value (mm) had no statistical differences between these two groups(P>0.05).(2)ADP% was positively correlated with (100-INHI)%,MAR%,ADP activated CD62p and PAC-1 receptor activation percentage(r=0.565,0.939,0.769,0.583，P<0.05 );while which had no correlation with ADP induced platelets aggregation value(%Agg) detected by TEG(r=0.794,0.715,0.889).Conclusion(1)Clopidogre has the anti-platelets effect.(2)LTA is easily operating,cheap and stable in detection results,has high popularizing rate in hospitals and is the first option method for clinically monitoring the platelets aggregation function.

platelet;flow cytometry;PAC-1;CD62p;ADP

楚杜武,男,主管技師,主要從事醫學檢驗工作?！?/p>

，E-mail：yulongc@263.net。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.025

A

1673-4130(2016)16-2270-03

2016-02-28

2016-06-27)