牛血清白蛋白-5-磺基水楊酸體系的熒光共振能量轉移研究

張　娟，劉建平，朱彥姝

(寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏 銀川 750004)

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牛血清白蛋白-5-磺基水楊酸體系的熒光共振能量轉移研究

張娟，劉建平，朱彥姝

(寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏 銀川 750004)

采用熒光發射光譜和紫外吸收光譜研究了牛血清白蛋白(BSA)-5-磺基水楊酸(SSA)體系的熒光共振能量轉移。結果表明，SSA可以猝滅BSA的熒光且使BSA熒光發射峰藍移，但峰形未改變；隨SSA濃度的增大，BSA紫外吸收光譜的最大吸收峰紅移且強度逐漸增強；根據F?rster非輻射能量轉移原理計算得到BSA-SSA體系中供體(BSA)與受體分子(SSA)間距離為2.42 nm。

牛血清白蛋白(BSA)；5-磺基水楊酸(SSA)；熒光猝滅；能量轉移

5-磺基水楊酸(SSA)是水楊酸(salicylicacid,SA)衍生物，屬于芳香族含氧酸，具有內源性熒光[1]。與SA及其它衍生物相比，SSA具有較好的水溶性，因而在水體研究[2]、工業[3]、醫藥[4]等眾多領域應用廣泛。血清白蛋白是有機體循環系統中大量存在的一種可溶性蛋白，其重要生理功能之一是與體內外不同配體(血漿中的脂肪酸、藥物、生物活性小分子和金屬離子等[5-6])發生可逆性鍵合，這種鍵合將影響配體在體內的吸收、分配、代謝、排泄等[7-8]。因此，有關蛋白與配體相互作用的研究十分重要，受到廣泛關注[9-10]，但有關牛血清白蛋白(BSA)與SSA相互作用的研究卻少見報道。鑒于此，作者研究了BSA-SSA體系的熒光發射光譜和紫外吸收光譜，并利用F?rster非輻射能量轉移原理計算了BSA與SSA之間距離，擬為相關研究提供參考。

1　實驗

1.1試劑與儀器

SSA，美國Fluka公司，以二次蒸餾水配制成原溶液，使用時適當稀釋；BSA(全組分)，美國Sigma公司，直接溶解于二次蒸餾水中配成原溶液；三羥甲基氨基甲烷(Tris，含量≥99%)，上?；瘜W試劑公司分裝廠，配制成pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液；NaCl(分析純)，上?；瘜W試劑公司，以二次蒸餾水配制成濃度為0.5mol·L-1的NaCl溶液。所有原溶液均于0～4 ℃暗處儲存。

F-4600型熒光光譜儀(配置150W氙燈和恒溫水浴槽)、U-3310型紫外可見分光光度計，日本日立公司。

1.2方法

1.2.1BSA-SSA體系的配制

取一定量的BSA和SSA溶液、2.0mLTris-HCl緩沖溶液、2.0mLNaCl溶液置于10mL比色管中，用二次蒸餾水稀釋至10mL，攪拌均勻，即得BSA-SSA體系。

1.2.2BSA-SSA體系的光譜測定

熒光發射光譜于恒溫294 K測定，激發波長280 nm，激發和發射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度 1 200 nm·min-1；紫外吸收光譜于室溫測定，狹縫寬度2 nm。

2　結果與討論

2.1BSA-SSA體系的熒光發射光譜

熒光猝滅是指熒光量子產率降低(即熒光強度減弱)。不同的分子間相互作用均可導致熒光猝滅，包括分子重排、能量轉移、基態復合物形成、碰撞猝滅等[11]。

固定BSA濃度、改變SSA濃度，研究SSA對BSA熒光發射光譜的影響，結果見圖1。

cBSA=8.96×10-6 mol·L-1　a～e，cSSA(×10-6 mol·L-1)：0、0.41、0.83、1.24、1.65

由圖1可知，當λex=280 nm時，BSA在338 nm處有強熒光峰，主要由色氨酸殘基引起；隨SSA濃度的增大，BSA位于338 nm處的熒光峰強度逐漸減弱，401 nm處的熒光峰強度逐漸增強。表明SSA對BSA的熒光具有猝滅作用。另外，隨SSA濃度的增大，BSA熒光發射峰發生藍移，表明熒光猝滅可能是由BSA與SSA形成復合物引起的[12]。

2.2BSA-SSA體系的紫外吸收光譜

固定BSA濃度、改變SSA濃度，研究SSA對BSA紫外吸收光譜的影響，結果見圖2。

cBSA=9.07×10-6 mol·L-1　a～e，cSSA(×10-5 mol·L-1)：0、2.06、4.12、6.18、8.24

由圖2可知，隨SSA濃度的增大，BSA位于278.5 nm處的最大吸收峰發生紅移，且吸收峰強度逐漸增強。表明BSA與SSA形成了復合物[13]。

2.3BSA-SSA體系的熒光共振能量轉移

熒光共振能量轉移(FRET)可分為輻射能量轉移和非輻射能量轉移，供體分子熒光發射光譜發生畸變時發生輻射能量轉移。由2.1可知，SSA可有效猝滅BSA的熒光，說明BSA-SSA體系存在能量轉移。當加入SSA時，BSA熒光發射光譜并未發生畸變，可認為BSA-SSA體系的熒光共振能量轉移屬于非輻射能量轉移。根據F?rster非輻射能量轉移原理[14]，發生能量轉移必須滿足以下條件：(1)供體可發射熒光；(2)供體分子的熒光發射光譜與受體分子的紫外吸收光譜有足夠的重疊；(3)供體與受體足夠接近，最大距離不超過7 nm。

非輻射能量轉移效率(E)、供體和受體之間距離(r)與臨界能量轉移(E=50%)距離(R0)的關系[14]如下：

(1)

(2)

(3)

式中：F、F0分別為有無猝滅劑時供體的熒光強度；K2為偶極空間取向因子，取供體和受體各向隨機分布的平均值2/3；n為介質折射系數，一般取水和有機物折射指數的平均值1.336；φ為供體熒光量子產率，對于BSA為0.13[15]；J為供體熒光發射光譜與受體紫外吸收光譜的重疊積分(圖3)；F(λ)為供體在波長為λ處的熒光強度；ε(λ)為受體在波長λ處的摩爾吸光系數。

cBSA=8.96×10-6 mol·L-1　cSSA=5.16×10-5 mol·L-1

根據式(1)～(3)，可計算得到以下參數：J=7.67×10-16cm3·L·mol-1，R0=1.52 nm，E=0.0573，r=2.42 nm。BSA的內源性熒光主要由色氨酸殘基引起。BSA分子含有2個色氨酸殘基，Trp-212殘基位于子域ⅡA，而Trp-134殘基位于子域ⅠB。Trp-134殘基不易與水溶性配體接近，因此SSA僅與Trp-212殘基相互作用，其相互作用距離為2.42 nm。供體和受體之間距離r<7 nm且0.5R0

3　結論

采用熒光發射光譜和紫外吸收光譜研究了牛血清白蛋白(BSA)-5-磺基水楊酸(SSA)體系的熒光共振能量轉移。結果表明，SSA可以猝滅BSA的熒光且使BSA熒光發射峰藍移，但峰形未改變；隨SSA濃度的增大，BSA紫外吸收光譜的最大吸收峰紅移且強度逐漸增強；根據F?rster非輻射能量轉移原理計算得到BSA-SSA體系中供體與受體分子間距離為2.42 nm。

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Fluorescence Resonance Energy Transfer of Bovine Serum Albumin-5-Sulfosalicyclic Acid System

ZHANG Juan,LIU Jian-ping,ZHU Yan-shu

(SchoolofBasicMedicalSciences,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Fluorescenceresonanceenergytransferofbovineserumalbumin(BSA)-5-sulfosalicyclicacid(SSA)systemwasstudiedbyfluorescenceemissionandUVabsorptionspectra.Resultsshowedthat,thefluorescenceemissionspectrumofBSAwasquenchedbyadditionofSSAsolutionandthefluorescenceemissionpeakofBSAemergedablueshift,butthepeakshapeofBSAfluorescencespectrumwasunchanged.ThemaximumUVabsorptionpeakofBSAemergedaredshiftanditsabsorbanceintensityincreasedobviouslywiththeincreasingofSSAconcentration.AccordingtoF?rstertheoryofnon-radiationenergytransfer,thedistancebetweenthedonor(BSA)andtheacceptor(SSA)inBSA-SSAsystemwascalculatedas2.42nm.

bovineserumalbumin(BSA);5-sulfosalicyclicacid(SSA);fluorescencequenching;energytransfer

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.010

寧夏衛生計生委(寧夏衛生廳)科研項目(2012051)

2016-03-24

張娟(1976-)，女，寧夏銀川人，副教授，研究方向：電化學及光化學，E-mail:zhangjuano13@126.com。

O 657.39

A

1672-5425(2016)08-0042-03

張娟，劉建平，朱彥姝.牛血清白蛋白-5-磺基水楊酸體系的熒光共振能量轉移研究[J].化學與生物工程，2016，33(8)：42-44.