溶藻弧菌實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立

李丹丹，徐義剛，李夢圓，王 昱，邱索平，高會江，高慎陽（.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，海南?？?0；2.東北農業大學動醫學院，黑龍江哈爾濱000；.從化出入境檢驗檢疫局，廣東廣州0900；.重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，重慶000；.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所牛遺傳育種研究室，北京009；.遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧錦州200）

溶藻弧菌實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立

李丹丹1，徐義剛2，*，李夢圓3，王 昱4，邱索平3，高會江5，高慎陽6
（1.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，海南?？?70311；2.東北農業大學動醫學院，黑龍江哈爾濱150001；3.從化出入境檢驗檢疫局，廣東廣州510900；4.重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，重慶404100；5.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所牛遺傳育種研究室，北京100193；6.遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧錦州121001）

為建立溶藻弧菌（VA）的快速檢測方法，本研究以VA Collagenase基因為靶基因設計合成引物及TaqMan探針，建立了實時熒光定量PCR快速檢測VA的方法。結果顯示，對15株實驗菌株進行熒光定量PCR檢測，只有VA菌株檢測為陽性，表明該檢測方法特異性強；該方法的靈敏度為18 cfu/mL；穩定性和重復性實驗結果表明，同一樣品重復檢測4 次Ct值的變異系數均小于2%；利用該檢測方法對采集的165份樣品進行檢測，共計檢出2份VA陽性樣品，與SN/T 2564-2010行標法檢測結果一致，顯示了良好的實用性。該檢測方法靈敏度高、特異性強，具有良好的實用性。

溶藻弧菌，Collagenase基因，實時熒光定量PCR

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus，VA）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，在海水養殖的牡蠣、蝦和蟹等貝類、甲殼類水生動物中分布廣泛，是流行程度、危害程度較高的食源性致病菌之一［1-3］，人類進食被VA污染的食品能夠引起急性胃腸炎，嚴重者還可引起敗血癥［4-6］。因此，建立快速并且準確的檢測方法對防止VA的感染和提高VA的檢測效率具有重要意義。

目前，包括我國在內的絕大多數國家針對溶藻弧菌的檢測仍主要依靠傳統細菌分離鑒定的方法。該方法存在檢測效率低、靈敏度低且耗時長、操作繁瑣等不足。通常情況下，鑒定一種細菌需要一周的時間，而針對一些生化特性復雜的細菌，如單增李斯特氏菌的檢測周期可長達10 d之久［7］，嚴重影響了檢測效率，很難滿足現代化食品安全快速檢測的需要。LAMP法，是近年來剛剛興起的一種檢測方法，在某種程度上提高了檢測效率，降低了檢測成本；PCR技術在病原體核酸檢測方面應用廣泛，靈敏度和特異性都比較高，但是LAMP和PCR這兩種檢測方法都存在著假陽性率比較高的問題［8］。相對而言，實時熒光PCR技術不僅具有靈敏、快速、簡便等優點，與常規PCR方法相比，特異性、靈敏度都更強、自動化程度更高，無需對PCR擴增產物進行后處理，有效地解決了PCR產物易污染造成的假陽性和不能準確定量的問題。該項技術已發展成為一種較成熟的分子生物學快速檢測技術，目前國內的科研和檢測機構都配備了實時熒光PCR檢測儀，并為廣大用戶所接受，應用于實際檢測工作中［9］。

實時熒光定量PCR方法實現了實時在線檢測，精準度、靈敏度和特異性均高于常規PCR檢測方法，同時適用范圍廣泛，目前已經成為一種常用的分子生物學檢測技術［10-12］。本研究利用該技術，建立了VA實時熒光定量PCR快速檢測方法，為快速準確檢測VA提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希菌O157∶H7、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、變形桿菌、阪崎腸桿菌、粘質沙雷菌、創傷弧菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、產腸毒素大腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、腸侵襲性大腸桿菌、霍亂弧菌和溶藻弧菌等標準菌株 購自美國典型菌種保藏中心；165份水產品 來自于水產品養殖場和水產品流通市場，包括20份蝦、15份蟹、15份海水、15份蟶子、15份鮑魚、10份海魚、15份蛤蜊、10份泥螺、10份花蛤、10份海虹、20份海瓜子、10份象拔蚌等水產品。

細菌培養基和增菌培養基BPW 均購自廣東環凱微生物科技有限公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒 購自北京康為世紀生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2均購自寶生物工程大連有限公司；ABI 7500 Real-time PCR儀 美國ABI公司；PRO 200型精密勻漿器 美國PRO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物、探針設計 根據GenBank公布的VA Collagenase基因序列（DQ097161.1）中的保守序列，利用Oligo 6.0軟件設計特異性檢測引物和TaqMan探針各一對，均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

引物序列：F：GAGCTTTCTGTTGAATGTAACGA CAC

R：ACCCACACGCTCCATTGC

探針序列：Fam-TCTCTGCAAACTCAGACGCAA GCGTAGG-TAMRA

1.2.2 DNA模板的制備 1.1節中的菌株分別接種到5 mL增菌培養基BPW中，增菌培養12 h后，取1 mL菌液按照試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，-20℃保存備用。臨床樣品的檢測采用煮沸法提取細菌DNA。

1.2.3 熒光定量PCR反應條件優化 PCR反應體系25 μL：rTaq酶（5 U/μL）用量范圍0.25～1.00 μL，以0.25 μL遞增；Mg2+（25 mmol/μL）用量范圍2.00～5.00 μL，以每0.50 μL遞增；dNTP（2.5 mmol/μL）用量范圍1.00～3.00 μL，以0.50 μL遞增；探針（20 μmol/μL）用量范圍0.10～0.50 μL，以每0.10 μL遞增；引物（10 pmol/μL）的用量范圍0.50～1.00 μL，以0.10 μL遞增。

PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性5 s，60℃退火20 s（此步驟收集熒光信號），進行40個循環，在每個循環的退火延伸階段收集熒光信號，每次實驗均包括陰性對照。

1.2.4 熒光定量PCR特異性檢測實驗 采用試劑盒法對1.1節中的菌株進行基因組DNA的提取，利用建立的實時熒光定量PCR方法進行檢測，驗證方法的特異性。

1.2.5 熒光定量PCR靈敏性檢測實驗 提取VA基因組DNA并測定濃度，10倍倍比稀釋DNA，原液至10-1～10-7，每個濃度梯度設4個平行，根據試劑盒提取每級稀釋度細菌DNA，各取2.00 μL作為模板進行實時熒光定量PCR檢測。

1.2.6 穩定性和重復性實驗 取3個不同濃度的樣品作為模板進行重復性實驗，每個濃度做3個平行，重復4次。收集數據，計算組內、組間變異系數，評價實驗的穩定性和重復性。

1.2.7 熒光定量PCR檢測方法的初步應用 將采集來的165份水產品經過勻漿器處理勻漿后，均用營養肉湯增菌培養6 h，增菌液煮沸法提取DNA并進行實時熒光定量PCR檢測，所得檢測結果用行標法（SN/T 2564-2010）進行復檢，以驗證所建立的實時熒光定量PCR檢測方法的可靠性。

2 結果與分析

2.1 VA實時熒光PCR檢測方法的建立

通過對實時熒光PCR反應體系中各項反應條件的優化，最終確定了VA最佳實時熒光PCR反應模式。在25 μL反應體系中含有：rTaq酶（5 U/μL）0.50 μL，Mg2+（25 mmol/μL）2.50 μL，dNTP（2.5 mmol/μL）2.00 μL，探針（20 μmol/μL）0.30 μL，上、下游引物濃度（10 pm/μL）1.00 μL，DNA模板2.00 μL，去離子水補充至25 μL。利用建立的方法對VA進行檢測，結果如圖1所示，獲得了最低的Ct值和較高的熒光強度增加值，表明所建立的檢測方法能夠應用于對VA的檢測。

圖1 VA實時熒光PCR檢測方法的建立Fig.1 Development of a dual real-time PCR reaction system

2.2 特異性實驗檢測結果

利用建立的實時熒光PCR檢測方法對1.1節中的菌株進行擴增，結果顯示：VA標準菌株擴增后出現了典型的擴增曲線，判定為陽性；而其他菌株和空白對照則出現平直的線或者是不規則曲線，判定為陰性（如圖2）。

圖2 VA實時熒光PCR方法特異性結果Fig.2 Specificity of a dual real-time PCR reaction system

2.3 靈敏度檢測實驗結果

10倍系列稀釋菌液按試劑盒提取每級稀釋度細菌DNA，按2.1優化出的實時熒光PCR反應條件進行檢測，結果表明在25 μL反應體系中，模板DNA加入2 μL，菌體濃度自1.80×107cfu/mL至1.80×101cfu/mL均可出現規則的、典型的擴增曲線，菌體濃度為1.80×100未出現擴增曲線（圖3），表明本研究建立的實時熒光PCR方法檢測VA靈敏度為18 cfu/mL。

2.4 穩定性和重復性實驗

選取1.80×106、1.80×104、1.80×102cfu/mL 3個濃度的陽性模板進行組內和組間重復性實驗，計算出組內和組間Ct值的變異系數分別為0.32%～1.24%、0.29%～0.85%（表1），均小于2%，表明該方法具有很好的穩定性和重復性。

表1 實時熒光PCR的穩定性和重復性實驗Table1 The stability and reproducibility test of real-time PCR

圖3 VA實時熒光PCR檢測靈敏度Fig.3 Sensitivity of a dual real-time PCR reaction system

2.5 實時熒光PCR檢測臨床樣品的實驗結果

利用建立的VA實時熒光定量PCR檢測方法對165份樣本進行了檢測，檢出2份VA陽性樣本，所得檢測結果經行標法［13］進行復檢，兩種方法檢測結果的一致率為100%，顯示該方法具有很好的應用性。

3 結論與討論

針對檢測靶基因的選擇，膠原蛋白酶（Collagenase）是一種胞外酶，可能對VA的毒力有影響，經毒力評價后的VA利用實時熒光定量PCR方法對Collagenase基因的表達量進行了測定，結果顯示其表達量與毒力大小具有相關性［14］。因此本研究選擇VA的Collagenase基因為靶基因，建立了VA實時熒光定量PCR快速檢測方法，確立了實時熒光定量PCR檢測的最佳反應條件。利用建立的檢測方法對15種不同菌株進行檢測，結果只有VA菌株出現典型的擴增曲線，為陽性；而其他菌株未出現擴增曲線，為陰性；說明本研究所建立的檢測方法具有很好的特異性。10倍系列稀釋菌液按試劑盒提取每級稀釋度細菌DNA作為模板進行實時熒光定量PCR檢測，原始菌液稀釋至10-6時仍能檢出，說明本方法具有很高的靈敏度。組內和組間Ct值的變異系數分別為0.32%～1.24%、0.29%～0.85%，均小于2%，表明該方法具有很好的穩定性和重復性；對165份臨床樣本進行了檢測，檢出2份VA陽性樣本，所得檢測結果經行標法［13］進行復檢，兩種方法檢測結果的一致率為100%。

綜上所述，本研究所建立的實時熒光定量PCR檢測方法為VA快速精準的檢測提供了可靠的技術手段，適合在檢驗檢疫系統內、食品安全監管及食品加工等部門推廣應用。

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Development of a dual real-time PCR for the rapid detection of Vibrio alginolyticus

LI Dan-dan1，XU Yi-gang2，*，LI Meng-yuan3，WANG Yu4，QIU Suo-ping3，GAO Hui-jiang5，GAO Shen-yang6
（1.Technical Center of Hainan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Haikou 570311，China；2.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150001，China；3.Conghua Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Guongzhou 510900，China；4.Technical Center of Chongqing Entry-exit Inspection and Quarantine Bure，Chongqing 404100，China；5.Laboratory of Bovine Genetics and Breeding，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；6.Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

To establish a rapid assay for Vibrio alginolyticus（VA）detection，a dual real-time PCR method was developed targeting Collagenase gene of VA.The results showed that the test for 15 bacteria strains of the dual real-time PCR method，only VA test was positive，indicating that the method had high specificity.In addition，the sensitivity of a dual real-time PCR was 18 cfu/mL.Stability and reproducibility of the test results showed that the coefficient of variation of the same sample repeat the test four times Ct values were less than 2%.Furthermore，a total 2 positive samples for VA were detected from 165 clinical samples by the real-time method，which was in accordance with the testing result by SN/T 2564-2010 standard detection protocol.Therefore，the real-time method provides a novel rapid and sensitive detection method for VA infection.

VA；Collagenase gene；real-time PCR

TS207.4

A

1002-0306（2016）08-0069-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.005

2015－09－14

李丹丹（1979-），女，博士，高級獸醫師，研究方向：微生物學與免疫學研究，E-mail：108074182@qq.com。

*通訊作者：徐義剛（1978-），男，博士，教授，研究方向：微生物學與免疫學研究，E-mail：esta123@126.com。

海南省社會發展科技專項（2015SF29）；國家質檢總局科技項目（2013IK031，2013IK051，2015IK089）；重慶市科技計劃項目（cstc2014yykfA80017）；海南省應用技術研究與開發專項項目（ZDXM20130025）；廣東檢驗檢疫局科技計劃項目（2011GDK44，2013GDK04）。