水稻斑馬葉突變體zebra1349的表型鑒定及基因精細定位

郭國強　孫學武　孫平勇　尹建英　何　強　袁定陽，*　鄧華鳳1，，*　袁隆平1，，*

1湖南農業大學農學院， 湖南長沙 410128；2湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國家重點實驗室， 湖南長沙 410125；3衡陽市農業科學研究所， 湖南衡陽 421001

水稻斑馬葉突變體zebra1349的表型鑒定及基因精細定位

郭國強1，2，3孫學武2孫平勇2尹建英3何強2袁定陽2，*鄧華鳳1，2，*袁隆平1，2，*

1湖南農業大學農學院， 湖南長沙 410128；2湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國家重點實驗室， 湖南長沙 410125；3衡陽市農業科學研究所， 湖南衡陽 421001

從恢復系育種材料［R128//（R318/R1025）F1］ F6中獲得一個新的斑馬葉突變體zebra1349， 突變體秧苗期如果不移栽， 與野生型一樣表現綠色， 移栽后5 d新抽出的葉片包括葉鞘會呈現出與葉脈垂直的黃綠相間的條紋， 移栽后30 d抽出的葉片又表現正常綠色， 成熟期主要農藝性狀與野生型無明顯差異。與野生型相比， 突變體六葉期斑馬葉黃區部位的總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量分別下降了55.86%、61.02%、39.34%和47.03%。透射電鏡（TEM）觀察表明， 突變體斑馬葉綠區部位葉綠體發育正常； 黃區部位葉肉細胞中葉綠體結構異常， 類囊體膜退化和分解嚴重， 類囊體基粒片層數量明顯減少， 片層間距拉大， 排列疏松。對zebra1349與正常葉色品種雜交F1、F2代的遺傳分析表明該性狀受1對隱性核基因調控。利用1192株zebra1349/02428 F2隱性定位群體， 最終把ZEBRA1349基因定位在水稻第12染色體InDel標記indel39和indel44之間， 其遺傳距離分別為0.04 cM和0.17 cM， 根據日本晴基因組序列推測， 兩標記之間的物理距離約為89 kb。本研究為ZEBRA1349基因的圖位克隆和功能研究以及分子標記輔助育種奠定了基礎。

水稻（Oryza sativa L.）； 斑馬葉突變體； 葉綠體； 基因精細定位

葉色突變是一種表型比較明顯、易于鑒別、相對容易獲得的突變性狀， 有關葉色突變的研究早在20世紀30年代就有報道， 迄今已在水稻、擬南芥、小麥、大豆、大麥、玉米、番茄、煙草、油菜等多種植物中被報道。葉色突變通常在苗期表達， 根據苗期葉色表型可分為白化、黃化、淺綠、綠白、白翠、黃綠、綠黃、條紋8種類型［1］。而其中的條紋突變體又可分為兩類， 一類為與葉脈平行的條紋葉，另一類為與葉脈垂直的條紋， 俗稱“斑馬葉”。葉色突變體如今已廣泛應用于葉綠素生物合成途徑［2］、光合作用［3］、光形態建成［4］、激素生理［5］、質-核基因互作及信號傳導途徑［6］等光合系統結構、功能及其調控機制的研究。另外把葉色標記應用到水稻不育系中， 對保證水稻不育系繁殖和雜交制種純度具有重要的意義［7］。

對水稻葉色突變體的遺傳分析和基因定位， 國內外已有較多報道， 目前已發現近134個水稻葉色突變體， 這些突變基因分布在水稻所有12條染色體上［8］。水稻葉色突變體性狀大多受1對隱性核基因控制［9］， 而由細胞質基因或顯性基因控制的葉色突變體很少［10-11］。葉色突變的機制主要有: （1）葉綠素生物合成途徑相關基因突變； （2）血紅素生物合成途徑中的基因突變； （3）編碼其它葉綠體蛋白的基因突變； （4）與光合系統無直接關系的基因突變等。目前被子植物中擬南芥的葉綠素生物合成從谷氨酰-tRNA到葉綠素a， 葉綠素a再經葉綠素酸酯a加氧酶氧化形成葉綠素b， 整個反應過程需要15步， 所有控制這15步反應的酶基因都已被成功克隆。水稻中也成功克隆了一些葉色相關基因， 如編碼Mg2+-螯合酶3個亞基的OsChlH、OsChlD和OsChlI基因［12-13］， 編碼葉綠素合酶的YGL1基因［14］， 編碼葉綠素酸酯a加氧酶的OsCAO1和OsCAO2基因［15］，編碼鳥苷酸激酶的基因virescent2［16］， 編碼核糖核苷酸還原酶大亞基蛋白RNRL1和小亞基蛋白RNRS1的基因Virescent3和Stripe1［17］， 三角狀五肽重復蛋白基因OsPPR1［18］， 持綠突變體基因SGR［19］， 葉綠素b還原酶基因NYC1［20］及其同源基因NYC1-LIKE［21］，以及編碼聯乙烯還原酶的OsDVR基因［22］， 但這些基因主要是集中在編碼葉綠素合成與降解途徑中的酶基因， 水稻葉色變化過程和調控機制還遠未闡明。因此有必要發掘、鑒定一些新的水稻葉色突變體， 進行基因定位、克隆和功能分析等方面的研究，對于補充和完善葉綠體發育機理及葉綠素合成代謝途徑具有重要的意義。

本課題組從恢復系育種材料［R128//（R318/ R1025）F1］F6中獲得一個斑馬葉突變體zebra1349，該突變體秧苗期如果不移栽， 葉色和正常的秧苗一樣表現綠色， 移栽后5 d， 新出的葉片包括葉鞘出現與葉脈垂直的黃綠相間斑馬葉性狀， 以后又逐漸轉綠， 其突變性狀與目前已報道的葉色突變體性狀均不相同， 是一份新的葉色突變材料。本研究對其主要農藝性狀、葉綠素含量和葉綠體超微結構等進行了研究， 同時構建了zebra1349×02428 F2群體， 對突變基因進行遺傳分析和利用分子標記對突變基因進行精細定位， 旨在為相關基因的克隆、基因功能研究及育種應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料

斑馬葉突變體zebra1349經10代連續自交觀察，其斑馬葉表型性狀在湖南衡陽、湖南長沙、海南三地都能穩定遺傳。以野生型親本R1349為對照。

1.2zebra1349表型特征及主要農藝性狀調查

2014年在湖南省衡陽市農業科學研究所試驗田種植斑馬葉突變體zebra1349和野生型親本R1349。5月10日播種， 四葉期移栽， 單本植， 株行距20 cm× 20 cm， 采用隨機區組設計， 田間種植3次重復， 每個小區5行， 每行12株， 按育種小材料田進行田間肥水管理， 及時防治病蟲害。觀察實驗材料在不同時期的葉色變化， 成熟期分別取斑馬葉突變體和野生型親本各10株， 考察生育期、株高、劍葉長、單株有效穗數、穗長、每穗總粒數、千粒重、結實率等主要農藝性狀。以t測驗分析突變型與野生型的相關性狀是否存在顯著差異。

1.3 zebra1349不同時期葉綠素含量分析

從斑馬葉突變體zebra1349與其野生型親本R1349群體中， 分別取三葉期（未移栽前）、六葉期（移栽后斑馬葉典型期）、九葉期（復綠后）植株的第一葉，去中脈， 分別剪碎混勻， 參照Lichtenthaler［23］的方法測定光合色素含量。

1.4zebra1349葉綠體超微結構觀察

取自然條件下突變體zebra1349斑馬葉黃區部位和綠區部位葉片及復綠葉片， 先用3%的戊二醛和1%的四氧化鋨雙重固定， 接著用0.2 mol L–1的磷酸緩沖液漂洗， 再用50%、70%、80%、95%和100%的乙醇梯度脫水， 最后用環氧化樹脂包埋， 超薄切片， 經醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色后， 在透射電子顯微鏡下觀察葉綠體超微結構， 并拍照。

1.5zebra1349的遺傳分析

2013年夏用斑馬葉突變體zebra1349分別與正常葉色野生型親本R1349、粳型廣親和材料02428正反交得到F1， 其中R1349/zebra1349、zebra 1349/02428兩個組合同年冬季在海南三亞加代獲得F2， 2014年在衡陽市農業科學研究所試驗基地同時種植F1、F2， 5月10日播種， 5月30日移栽， 單本植，移栽后， 當植株長至五至六葉期， 觀察各植株的葉色， 同時統計兩個組合F2群體中突變表型和正常表型的植株數， 計算分離比， 根據孟德爾遺傳規律，進行遺傳分析， 并進行χ2測驗， 推斷zebra1349的遺傳模式。

1.6zebra1349的基因定位

用zebra1349與粳型廣親和材料02428雜交產生的F2作為定位群體， CTAB法［24］提取親本及F2群體中葉色突變單株的基因組DNA。先用實驗室均勻分布于水稻12條染色體上的550對分子標記（引物由上海生工生物工程有限公司合成）進行親本多態性分析， 然后采用Michelmore等［25］提出的近等基因池分析法， 將F2群體中10株正常綠葉和10株斑馬葉單株DNA等量混合， 構建正常池和突變池。用在兩親本間具有多態性的標記分別對親本和突變體DNA混池進行電泳分析， 根據多態性引物在親本和突變池的基因型， 初步找到目的基因所在的連鎖群， 再用179株F2群體中的斑馬葉單株進行重組分析和連鎖驗證， 確定目的基因在染色體上的大概區段， 最后在目標基因附近開發新的SSR標記和InDel標記進行進一步精細定位。

PCR擴增總體系為10 μL， 包括1.0 μL模板DNA， 5.0 μL 2×Easy Taq PCR SuperMix （TRAN SGEN， 中國）， 3.0 μL ddH2O， 1.0 μL引物。PCR程序為94℃預變性3 min； 94℃變性30 s， 53～60℃退火35s， 72℃延伸1 min， 35個循環； 最后再72℃后延伸5 min。擴增產物經8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色后觀察。

圖1　突變體zebra1349與其野生型親本R1349在不同時期的表型Fig. 1 Phenotype of the zebra1349 mutant and its wild-type parent R1349 at the different stagesA: 苗期， 移栽前； B: 移栽后5 d， 斑馬葉出現； C: 移栽后30 d，斑馬葉復綠； D: 成熟期； WT: 野生型； M: 突變體。A: seedling stage， before transplanting； B: at five days （d） after transplanting， zebra leaves appeared； C: at thirty days （d） after transplanting zebra leaves disappeared； D: mature stage. WT: wild type； M: mutant.

2　結果與分析

2.1zebra1349的表型特征及主要的農藝性狀

通過對zebra1349的葉色觀察， 發現其葉色轉變過程為正常綠色—斑馬葉色—正常綠色。秧苗期，如果不移栽， zebra1349與野生型一樣表現綠色， 不會出現葉色的變化（圖1-A）； 移栽后5 d左右， 新出的葉片包括葉鞘會呈現出與葉脈垂直的黃綠相間條紋（圖1-B）， 這種性狀在六葉期表現最為明顯， 以后斑馬葉片上的黃色條紋逐漸消失， 移栽后30 d， 從第九葉開始及以后抽出的葉片表現正常綠色（圖1-C）。突變體zebra1349成熟后（圖1-D）， 與野生型相比在株高、劍葉長度、穗長、每穗總粒數上略有減少， 而生育期、有效穗數、結實率、千粒重有不同程度的增加（表1）， 但t測驗表明， 突變體zebra1349與野生型親本R1349在所有調查的主要農藝性狀上差異不顯著。由上可知， zebra1349移栽后出現的斑馬葉表型對其后期的主要農藝性狀幾乎沒有影響。

表1　突變體zebra1349與野生型（WT）親本主要農藝性狀比較Table 1 Comparison of major agronomic traits between the zebra1349 mutant and its wild-type （WT） parent

2.2突變體與野生型葉綠素含量的差異

三葉期zebra1349葉綠素和類胡蘿卜素的含量與野生型差異均不顯著， 六葉期zebra1349斑馬葉黃區部位的色素含量極顯著低于野生型， 其總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量分別下降了55.86%、61.02%、39.34%和47.03%。而zebra1 349轉綠后， 其葉綠素和類胡蘿卜素的含量與野生型差異又均不顯著， 說明zebra1349轉綠后， 葉片的色素合成也隨之恢復正常。

圖2　zebra1349和野生型（WT）不同發育時期葉片中色素含量分析Fig. 2 Pigment content in leaves of zebra1349 mutant and wild type （WT） at different growth stages**表示野生型與突變體在0.01水平上差異顯著。**Represent significant difference between zebra1349 mutant and the wild type at the 0.01 probability level.

2.3突變體葉綠體超微結構觀察

超微結構觀察顯示， 野生型葉肉細胞中葉綠體數目多， 形狀呈橢圓型， 基質濃厚， 基粒豐富， 片層垛疊排列緊密、厚實（圖3-A）。zebra1349斑馬葉片綠區部位葉肉細胞中葉綠體發育正常（圖3-B）； 黃區部位葉肉細胞中葉綠體類囊體膜系統退化和分解嚴重， 類囊體基粒片層數量明顯減少， 片層間距拉大，排列疏松（圖3-C）。復綠后的葉片葉肉細胞中葉綠體結構恢復正常， 類囊體膜系統重建（圖3-D）。說明zebra1349的葉色變異與類囊體結構發育異常有關。

圖3　突變體zebra1349和野生型葉肉細胞中葉綠體顯微結構Fig. 3 Ultrastructures of chloroplasts in the mesophyll cell of the zebra1349 mutant and WTA、B、C、D分別為野生型、zebra1349斑馬葉綠區部位和黃區部位及復綠葉片的葉綠體結構。P: 原片層體； G: 基粒；O: 嗜鋨粒。A， B， C， D represent chloroplasts of the wild type， the green parts，the yellow parts and green leaves of the zebra1349 mutant， respectively. P: prolamellar body； G: granum； O: osmiophilic globule.

2.4zebra1349的遺傳模式

zebra1349分別與正常葉色野生型親本R1349、粳型廣親和材料02428正反交， 4個F1雜交植株葉片均表現為正常綠色， R1349/zebra1349、zebra1349/ 02428 F2群體中正常綠苗植株與斑馬葉突變植株分離十分明顯， 經χ2檢驗均符合3∶1的理論比（表2），表明zebra1349的斑馬葉性狀由1對隱性核基因控制。

2.5zebra1349的基因精細定位

利用550對分子標記對親本zebra1349和02428的基因組進行多態性分析， 共篩選到225對在兩親本間呈現多態性的引物， 多態性檢出率為39.57%。選取186對擴增效果好、均勻分布于水稻12條染色體的多態性引物分別擴增2個親本和2個基因池，發現第12染色體上的RM3103、RM1986、RM235、RM17和SFP-12-3標記與目標基因是連鎖的， 隨后用第12染色體上的6個多態性標記IRO5399、RM27 809、RM101、Zm12-5、CS1215和RIO5415進一步對F2群體中179個具斑馬葉表型的單株進行驗證，發現這6個標記的交換單株數依次為22、15、1、0、11和36， 進一步說明該基因位于第12染色體上， 遺傳連鎖分析表明， 斑馬葉基因位于RM101和CS1215之間， 遺傳距離分別為0.3 cM和2.9 cM， 而介于這2個標記之間的Zm12-5沒有檢測出交換單株，推斷目標基因在Zm12-5標記附近。

為進一步精細定位該斑馬葉基因， 在Zm12-5標記附近設計了一系列SSR、InDel標記（表3）， 利用這些標記對F2群體的1192株突變單株進行連鎖分析， 發現indel39有1個交換株， indel44有4個交換株， indel40標記與目標基因共分離， 因此將目標基因定位在indel39和indel44之間， 遺傳距離分別為0.04 cM和0.17 cM。根據日本晴序列， 兩標記之間的物理距離約為89 kb， 位于一個BAC克隆OJ1194_E11上（圖4）。MSU （http://rice.plantb iology.m su.edu/）網站提供的基因注釋信息， 在定位區域內包含12個預測基因（表4）。

表2　zebra1349與野生型親本R1349和02428雜交F2斑馬葉分離情況Table 2 Segregation of F2population in the crosses of R1349 and 02428 with zebra1349

3　討論

有關水稻斑馬葉突變體， 早在20世紀80年代Iwata等［26］就報道過， 迄今為止國內外發現的水稻斑馬葉突變體至少有34個［8］， 己定位到染色體上的有15個（z1～z15） （http://www.shigen.nig.ac.jp/rice /oryzabase/）， 精細定位的2個（z15［27］和zebra524［28］），克隆的2個（zn［29］和z2［30］）。它們分別位于水稻第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8和第11染色體上。目前在ZEBRA1349所定位的第12染色體上只定位了3個葉色突變基因（http://www.grame ne.org/rice_mutant）， 即ETL2［31］（已克?。?、TCML2［32］和YGL6［33］， ETL2和YGL6為控制水稻黃化的葉綠素缺乏突變基因， ETL2位于水稻第12染色體短臂147 kb和209 kb的范圍內， etl2全生育期葉片呈黃色；YGL6位于水稻第12染色體著絲粒區域Indel標記Ind23和Ind37之間143 kb范圍內， ygl6在苗期葉片為黃綠色， 到拔節期葉色變成淡綠色。TCML2為一個控制水稻溫敏感失綠的基因， 位于水稻第12染色體長臂上分子標記ID21199和ID21436之間的237 kb區域內， tcml2在20℃條件下第2、第3幼葉失綠， 第4葉開始完全轉綠， 而24℃以上條件其表型與野生型一致， 呈正常綠色。本研究所鑒定的葉色突變體zebra1349秧苗期如果不移栽， 與野生型一樣表現綠色， 移栽后5 d新出的葉片包括葉鞘會呈現出與葉脈垂直的黃綠相間條紋， 移栽后30 d抽出的葉片又表現正常綠色， 其葉色變異特征和以往報道的斑馬葉色突變體完全不同， 并且其基因位于水稻第12染色體短臂靠近著絲粒InDel標記indel39和indel44之間，因此無論是從葉色的表型上還是基因在染色體的位置上都可推斷ZEBRA1349是一個新的葉色基因。

表3　ZEBRA1349基因的連鎖標記Table 3 Sequence of markers linked with ZEBRA1349

圖4　ZEBRA1349基因在第12染色體上的精細定位Fig. 4 Fine mapping of ZEBRA1349 on chromosome 12A: ZEBRA1349被定位到第12染色體RM101與CS1215之間； B: ZEBRA1349被精細定位在InDel標記indel39與indel44之間；C: ZEBRA1349被定位在BAC克隆OJ1194_E11 89 kb范圍內； D: 定位區間預測的基因。A: ZEBRA1349 was positioned between RM101 and CS1215 on chromosome 12； B: ZEBRA1349 was fine mapped between two InDel markers indel39 and indel44； C: ZEBRA1349 was located in a BAC of OJ1194_E11 within 89 kb； D: putative genes in the target interval.

葉綠體是光合作用的場所， 其發育調控機制一直是植物生理和分子生物學研究的熱點。Kusumi等［34］將水稻葉綠體發育在分子水平上分為3個時期: （1）與葉綠體發育和分裂相關的基因（如OsPOLP1和FtsZ）大量表達； （2）依賴核基因編碼的RNA聚合酶（NEP）轉錄的質體編碼的RNA聚合酶（PEP）基因， 如OsRpoTp、v2、rpoA等基因大量表達； （3）與光合作用相關的核編碼和質體編碼的基因大量表達。zebra1349是一個由移栽等機械損傷引起葉色變異的新材料，其調控葉色變異的分子機制可能不同于以往葉色突變體， 該突變體的發現可能會成為研究高等植物葉綠體發育機理的理想材料。本研究將ZEBRA1349基因定位在水稻第12染色體短臂靠近著絲粒InDel標記indel39和indel44之間， 分別距其0.04 cM和0.17 cM， 根據日本晴序列可知物理距離約為89 kb。利用MSU網站對該區域內的12個預測基因分析， 發現2個與葉色有關的基因， 1個是LOC_Os12g18630， 該基因表達蛋白與質體發育有關； 另一個是LOC_ Os12g18640， 該基因編碼一個三角狀五肽蛋白（pentatricopeptide repeat protein）。近年來的研究表明，PPR基因在植物中大量存在， 水稻基因組中有650個， PPR蛋白基因由細胞核控制， 亞細胞定位大多數定位在葉綠體或線粒體上， PPR蛋白基因對這些細胞器基因的表達具有重要的調控作用［35］， 許多植物失綠突變體與PPR蛋白有關［36］， 生物信息學方法分析表明PPR的基因結構有一個顯著特點， 其基因序列幾乎不含內含子［35］， 而據水稻基因組信息， LOC_ Os12g18640只有一個內含子， 其轉錄子全長2028 bp，說明LOC_Os12g18640編碼典型的PPR蛋白。但要最終確定哪個基因是ZEBRA1349， 還需對野生型和突變體全長基因進行克隆、測序， 并對候選基因進行互補驗證， 相關研究正在進行當中。

表4　水稻第12染色體定位區間內基因及其推測功能Table 4 Gene names and their putative functions in the target interval

近年來， 葉色標記在育種中的應用愈來愈受到關注， Shu等［37］經多年研究認為， 作為葉色標記應具備以下4個條件: （1）標記性狀明顯， 易鑒別； （2）標記性狀穩定， 不易受環境因素影響； （3）標記性狀無顯著負效應； （4）標記性狀受隱性核基因控制。由于葉色突變往往直接或者間接影響葉綠素的合成降解， 導致光合效率下降， 造成植株生長發育不正常而減產，在迄今發現的水稻葉色突變體中， 絕大多數由于農藝性狀欠佳難以在育種上利用。zebra1349遺傳行為簡單、由1對隱性核基因控制， 葉色標記明顯、易于識別， 同時成熟期主要農藝性狀與野生型相比差異均不顯著， 說明突變性狀對植株的生長發育沒有產生不利影響， 因此ZEBRA1349作為葉色標記基因在水稻遺傳育種中具有更大的應用前景。

4　結論

從恢復系育種材料［R128//（R318/R1025）F1］F6中獲得一個斑馬葉突變體zebra1349， 該突變體秧苗期如果不移栽， 葉色和正常的秧苗一樣表現綠色， 移栽后5 d， 新出的葉片包括葉鞘會出現斑馬葉性狀，從第九葉開始及以后抽出的葉片表現正常綠色， 成熟期主要農藝性狀與野生型相比沒有明顯的差異。斑馬葉片黃區部位中的葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著下降， 葉綠體結構異常， 綠區部位葉綠體結構正常。突變性狀由1對隱性核基因控制， 該基因位于第12染色體短臂靠近著絲粒InDel標記indel39和indel44之間， 遺傳距離分別為0.04 cM和0.17 cM，物理距離約為89 kb， 尚未見該區段內有葉色突變體的報道。zebra1349是一個新的水稻葉色突變體， 為水稻葉色變異機制的研究提供了理想材料， 本研究為下一步該基因的克隆和功能分析奠定了基礎。

References

［1］ Awan M A， Konzak C F， Rutger J N， Nilan R A. Mutagenic effects of sodium azide in rice. Crop Sci， 1980， 20: 663-668

［2］ 黃曉群， 趙海新， 董春林， 孫業盈， 王平榮， 鄧曉建. 水稻葉綠素合成缺陷突變體及其生物學研究進展. 西北植物學報，2005， 25: 1685-1691 Huang X Q， Zhao H X， Dong C L， Sun Y Y， Wang P R， Deng X J. Chlorophyll-deficit rice mutants and their research advances in biology. Acta Bot Boreali-Occident Sin， 2005， 25: 1685-1691 （in Chinese with English abstract）

［3］ Fambrini M， Castagna A， Dalla Vecchia F， Degl’innocenti E，Ranieri A， Vernieri P， Pardossi A， Guidi L， Rascio N， Pugliesi C. Characterization of a pigment-deficient mutant of sunflower（Helianthus annuus L.） with abnormal chloroplast biogenesis，reduced PSII activity and low endogenous level of abscisic acid. Plant Sci， 2004， 167: 79-89

［4］ Parks B M， Quail P H. Phytochrome-deficient hy1 and hy2 long hypocotyl mutants of Arabidopsis are defective in phytochrome chromophore biologysynthesis. Plant Cell， 1991， 3: 1177-1186

［5］ Agrawal G K， Yamazaki M， Kobayashi M， Hirochika R， Miyao A，Hirochika H. Screening of the rice viviparous mutants generated by endogenous retrotransposon tos17 insertion. Tagging of a zeaxanthin epoxidase gene and a novel OsTATC gene. Plant Physiol，2001， 125: 1248-1257

［6］ Stern D B， Hanson M R， Barkan A. Genetics and genomics of chloroplast biogenesis: maize as a model system. Trends Plant Sci， 2004， 9: 293-301

［7］ 沈圣泉， 舒慶堯， 吳殿星， 陳善福， 夏英武. 白化轉綠型水稻三系不育系白豐A的選育. 雜交水稻， 2005， 20（5）: 10-11 Shen S Q， Shu Q Y， Wu D X， Chen S F， Xia Y W. Breeding of new rice CMS line Baifeng A with a green-revertible albino leaf color marker. Hybrid Rice， 2005， 20（5）: 10-11 （in Chinese with English abstract）

［8］ 鄧曉娟， 張海清， 王悅， 舒志芬， 王國槐， 王國梁. 水稻葉色突變基因研究進展. 雜交水稻， 2012， 27（5）: 9-14 Deng X J， Zhang H Q， Wang Y， Shu Z F， Wang G H， Wang G L. Research advances on rice leaf-color mutant genes. Hybrid Rice，2012， 27（5）: 9-14 （in Chinese with English abstract）

［9］ 譚炎寧， 孫學武， 袁定陽， 孫志忠， 余東， 何強， 段美娟， 鄧華鳳， 袁隆平. 水稻單葉獨立轉綠型黃化突變體grc2的鑒定與基因精細定位. 作物學報， 2015， 41: 831-837 Tan Y N， Sun X W， Yuan D Y， Sun Z Z， Yu D， He Q， Duan M J，Deng H F， Yuan L P. Identification and fine mapping of green-revertible chlorina gene grc2 in rice （Oryza sativa L.）. Acta Agron Sin， 2015， 41: 831-837 （in Chinese with English abstract）

［10］ 錢前， 朱旭東， 曾大力， 張小惠， 嚴學強， 熊振民. 細胞質基因控制的新特異材料白綠苗的研究. 作物品種資源， 1996， （4）: 11-12 Qian Q， Zhu X D， Zeng D L， Zhang X H， Yan X Q， Xiong Z M. The study on a new special material， white-green rice which controlled by plasma gene. J Crop Resour， 1996， （4）: 11-12 （in Chinese）

［11］ 李賢勇， 王楚桃， 李順武， 何永歆， 陳世全. 一個水稻高葉綠素含量基因的發現. 西南農業學報， 2002， 15（4）: 122-123 Li X Y， Wang C T， Li S W， He Y Y， Chen S Q. The discovery of a high chlorophyll content gene in rice. Southwest China J Agric Sci， 2002， 15（4）: 122-123 （in Chinese）

［12］ Jung K H， Hur J， Ryu C H， Choi Y， Chung Y Y， Miyao A， Hirochika H， An G. Characterization of a rice chlorophyll-deficient mutant using the T-DNA gene-trap system. Plant Cell Physiol，2003， 44: 463-472

［13］ Zhang H T， Li J J， Yoo J H， Yoo S C， Cho S H， Koh H J， Seo H S，Paek N C. Rice chlorina-1 and chlorina-9 encode ChlD and ChlI subunits of Mg-chelatase， a key enzyme for chlorophyll synthesis and chloroplast development. Plant Mol Biol， 2006， 62: 325-337［14］ Wu Z M， Zhang X， He B， Diao L P， Sheng S L， Wang J L， Guo X P， Su N， Wang L F， Jiang L， Wang C M， Zhai H Q， Wan J M. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis. Plant Physiol， 2007，145: 29-40

［15］ Lee S， Kim J H， Yoo E S， Lee C H， Hirohika H， An G. Differential regulation of chlorophyll a oxygenase genes in rice. Plant Mol Biol， 2005， 57: 805-818

［16］ Sugimoto H， Kusumi K， Tozawa Y， Yazaki J， Kishimoto N， Kikuchi S， Iba K. The virescent-2 mutation inhibits translation of plastid transcripts for the plastid genetic system at an early stage of chloroplast differentiation. Plant Cell Physiol， 2004， 45:985-996

［17］ Yoo S C， Cho S H， Sugimoto H， Li J， Kusumi K， Koh H J， Koh I，Paek N C. Rice virescent3 and stripe1 encoding the large and small subunits of ribonucleotide reductase are required for chloroplast biogenesis during early leaf development. Plant Physiol， 2009， 150: 388-401

［18］ Gothandam K M， Kim E S， Cho H J， Chung Y Y. OsPPR1， a pentatricopeptide repeat protein of rice is essential for the chloroplast biogenesis. Plant Mol Biol， 2005， 58: 421-433

［19］ Park S Y， Yu J W， Park J S， Li J， Yoo S C， Lee N Y， Lee S K，Jeong S W， Seo H S， Koh H J， Jeon J S， Park Y I， Paek N C. The senescence-induced stay green protein regulates chlorophyll degradation. Plant Cell， 2007， 19: 1649-1664

［20］ Kusaba M， Ito H， Morita R， Iida S， Sato Y， Fujimoto M， Kawasaki S， Tanaka R， Hirochika H， Nishimura M， Tanaka A. Rice NON-YELLOW COLORING1 is involved in light-harvesting complex II and grana degradation during leaf senescence. Plant Cell， 2007， 19: 1362-1375

［21］ Yutaka S， Ryouhei M， Susumu K， Minoru N， Ayumi T， Makoto K. Two short-chain dehydrogenase/reductases， NON-YELLOW COLORING 1 and NYC1-LIKE， are required for chlorophyll b and light-harvesting complex II degradation during senescence in rice. Plant J， 2009， 57: 120-131

［22］ Wang P R， Gao J X， Wan C M， Zhang F T， Xu Z J， Huang X Q，Sun X Q， Deng X J. Divinyl chlorophyll（ide） a can be converted to monovinyl chlorophyll（ide） a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol， 2010， 153: 994-1003

［23］ Lichtenthaler H K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol， 1987， 148: 350–382

［24］ Murray M G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucl Acids Res， 1980， 8: 4321–4326

［25］ Michelmore R W， Paran I， Kesseli R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc Natl Acad Sci USA， 1991， 88: 9828–9832

［26］ Iwata N， Omura T， Sato H. Linkage studies in rice （Oryza sativa L.） on some mutants for physiological leaf spots. Fac Agric Kushu Univ， 1978， 22: 243–251

［27］ Wang Q S， S C， Ling Y H， Zhao F M， Yang Z L， Li Y F， He G H. Genetic analysis and molecular mapping of a novel gene for zebra mutation in rice （Oryza sativa L.）. J Genet Genomics， 2009，36: 679–684

［28］ 李燕群， 鐘萍， 高志艷， 朱柏羊， 陳丹， 孫昌輝， 王平榮， 鄧曉建. 水稻斑馬葉突變體zebra524的表型鑒定及候選基因分析.中國農業科學， 2014， 47: 2907–2915 Li Y Q， Zhong P， Gao Z Y， Zhu B Y， Chen D， Sun C H， Wang P R，Deng X J. Morphological characterization and candidate gene analysis of zebra leaf mutant zebra524 in rice. Sci Agric Sin，2014， 47: 2907–2915

［29］ Li J J， Pandeya D， Nath K， Zulfugarov I S， Yoo S C， Zhang H T，Yoo J H， Cho S H， Koh H Jon， Kim D S， Seo H S， Kang B C， Lee C H， Paek N C. ZEBRA-NECROSIS， a thylakoid-bound protein，is critical for the photoprotection of developing chloroplasts during early leaf development. Plant J， 2010， 62: 713–725

［30］ Chai C L， Fang J， Liu Y， Tong H N， Gong Y Q， Wang Y Q， Liu M，Wang Y P， Qian Q， Cheng Z K， Chu C C. ZEBRA2， encoding a carotenoid isomerase， is involved in photo protection in rice. Plant Mol Biol， 2011， 75: 211–221

［31］ Mao D H， Yu H H， Liu T M， Yang G Y， Xing Y Z. Two complementary recessive genes in duplicated segments control etiolation in rice. Theor Appl Genet， 2011， 122: 373–383

［32］ Dong Y J， Lin D Z， Mei J， Su Q Q， Zhang J H， Ye S H， Zhang X M. Genetic analysis and molecular mapping of a thermo-sensitive chlorosis mutant in rice. Mol Plant Breed， 2013， 11: 1–7

［33］ Shi J Q， Wang Y Q， Guo S， Ma L， Wang Z W， Zhu X Y， Sang X C，Ling Y H， Wang N， Zhao F M， He G H. Molecular mapping and candidate gene analysis of a yellow-green leaf 6 （ygl6）. Crop Sci，2014， 55: 669-680

［34］ Kusumi K， Chono Y， Shimada H， Gotoh E， Tsuyama M， Iba K. Chloroplast biogenesis during the early stage of leaf development in rice. Plant Biotechnol， 2010， 27: 85–90

［35］ Lurin C， Andres C， Aubourg S， Bellaoui M， Bitton F， Bruyere C，Caboche M， Debast C， Gualberto J， Hoffmann B， Lecharny A，Ret M L， Martin-Magniette M L， Mireau H， Peeters N， Renou J P，Szurek Boris， Taconnat L， Small I. Genome-wide analysis of arabidopsis pentatricopeptide repeat proteins reveals their essential role in organelle biogenesis. Plant Cell， 2004， 16: 2089–2103［36］ Su N， Hu M L， Wu D X， Wu F Q， Fei G L， Lan Y， Chen X L， Shu X L，Zhang X， Guo X P， Cheng Z J， Lei C L， Qi C K， Jiang L，Wang H Y， Wan J M. Disruption of a rice pentatricopeptide repeat protein causes a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhance seed purity in hybrid rice production. Plant Physiol， 2012， 159: 227–238

［37］ 舒慶堯， 夏英武， 左曉旭， 劉貴付. 二系雜交水稻制繁種中利用標記輔助去雜技術. 浙江農業大學學報， 1996， 22（1）: 56–60 Shu Q Y， Xia Y W， Zuo X X， Liu G F. Maker-assisted elimination of contamination on two-line hybrid rice seed production and multiplication. J Zhejiang Agric Univ， 1996， 22（1）: 56–60 （in Chinese）

Morphological Characterization and Fine Mapping of Zebra Leaf Mutant zebra1349 in Rice （Oryza sativa L.）

GUO Guo-Qiang1，2，3， SUN Xue-Wu2， SUN Ping-Yong2， YIN Jian-Ying3， HE Qiang2， YUAN Ding-Yang2，*，DENG Hua-Feng1，2，*， and YUAN Long-Ping1，2，*

1College of Agronomy， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；2State Key Laboratory of Hybrid Rice， Hunan Hybrid Rice Research Center， Changsha 410125， China；3Hengyang Agricultural Science Research Institute， Hengyang 421001， China

A new zebra leaf mutant zebra1349 was attained in a restorer line crossing population of ［R128//（R318/R1025） F1］ F6in Hengyang Agricultural Science Research Institute of Hunan province. This mutant showed normal green leaves at seedlings stage， but a zebra leaf phenotype with green-yellow bands in penpendicular to leaf vein appeared at five days after transplanting，which was most obvious at sixth-leaf stage， and recovered normal green leaves around 30 days （ninth-leaf stage） after transplanting. Until the mature stage， the zebra1349 mutant showed insignificant difference with the wild type in major agronomic traits. The contents of total chlorophyll， chlorophyll a， chlorophyll b and carotenoid in yellow parts of the mutant leaf at sixth-leaf stage decreased by 55.86%， 61.02%， 39.34%， and 47.03%， respectively. Transmission Electron Microscopic （TEM） results indicated that the chloroplast of the mutant yellow leaf showed a serious thylakoid membrane degradation and decomposition， and the number of thylakoid grana lamella decreased significantly with larger gap and looser arrangement. Genetic analysis using F1and F2of the reciprocal crosses between zebra1349 and normal green rice varieties revealed that the zebra-leaf trait was controlled byone pair of recessive nuclear genes. With 1192 recessive plants in a F2population from the cross between zebra1349 mutant and normal green variety 02428， the ZEBRA1349 gene was finely mapped between two InDel markers indel39 and indel44 on chromosome 12 with a genetic distance of 0.04 cM and 0.17 cM respectively， and the physical distance was 89 kb based on comparing with the reference genome of Japonica rice Nipponbare. These results provide a foundation for further map-based cloning of ZEBRA1349 and molecular marker-assisted breeding.

Rice （Oryza sativa L.）； Zebra leaf mutant； Chloroplast； Gene fine mapping

10.3724/SP.J.1006.2016.00957

本研究由國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目“強優勢水稻雜交種的創制與應用”（2011AA10A101）和衡陽市科技局重點項目“黃色帶狀標記基因在兩用核不育系中的利用” （2011KZ15）資助。

The study was supported by the grants from National High-tech R&D Program of China （863 Program）（2011AA10A101） and the Key Project Funded by the Hengyang Science and Technology Bureau （2011KZ15）.

（Corresponding authors）: 袁隆平， E-mail: lpyuan@hhrrc.ac.cn， Tel: 0731-89733455； 鄧華鳳， E-mail: dhf@hhrrc.ac.cn； 袁定陽，E-mail: yuandingyang@hhrrc.ac.cn

聯系方式: E-mail: hnggq2008@163.com， Tel: 0734-2405130

Received（）: 2015-12-28； Accepted（接受日期）: 2016-03-14； Published online（網絡出版日期）: 2016-03-28.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160328.1116.014.html