小麥未減數配子基因的連鎖標記及染色體區段檢測

寇春蘭　趙來賓　劉　夢　郝　明　甯順腙　袁中偉　劉登才　張連全

四川農業大學小麥研究所 四川成都 611130

小麥未減數配子基因的連鎖標記及染色體區段檢測

寇春蘭趙來賓劉夢郝明甯順腙袁中偉劉登才張連全*

四川農業大學小麥研究所 四川成都 611130

六倍體普通小麥（Triticum aestivum L.， AABBDD， 2n = 42）由四倍體小麥（T. turgidum， AABB， 2n = 28）與節節麥（Aegilops tauschii Cosson， DD， 2n=14）天然雜交， 然后通過染色體自動加倍形成。加倍過程主要受四倍體小麥未減數配子基因控制， 且不同四倍體小麥存在不同的遺傳效應。本研究利用位于3B染色體上未減數配子基因QTug.sau-3B的連鎖SSR標記Xgpw1146和高通量DArTseq分子標記， 篩選出可能轉入四倍體小麥未減數配子基因的人工合成小麥改良后代。在105份改良材料中檢測出17份具有四倍體小麥的Xgpw1146等位位點， 表明四倍體小麥的未減數配子基因可能轉入了這17份材料。利用DArTseq高通量標記技術分析人工合成小麥SHW-L1的88份改良后代， 發現含四倍體小麥Xgpw1146等位位點的材料均具有來自SHW-L1、且可能包含Xgpw1146的一個染色體區段，表明未減數配子基因臨近區域以一個區段傳遞到改良后代。這些人工合成小麥改良材料在加倍單倍體育種中有重要的應用潛力。

異源多倍體； 人工合成小麥； 未減數配子

許多重要作物是異源多倍體。異源多倍體的產生通常包括兩個關鍵過程， 一是不同物種的遠緣雜交， 即異源過程； 二是遠緣雜種的染色體自然加倍，即多倍化過程。遠緣雜種產生的未減數配子在染色體組自然加倍過程中發揮了重要作用［1-3］。未減數的雌雄配子結合， 能夠實現染色體自然加倍。未減數配子不僅在多倍體物種起源過程中發揮了重要作用，而且在加倍單倍體育種和創制新雙二倍體的遺傳育種方面有重要應用價值［3-7］。未減數配子能夠讓單倍體自動加倍， 從而克服了用秋水仙堿溶液等藥品人工加倍存在的處理程序繁瑣、成功率低、污染環境且導致加倍植株不正常等不利于大規模批量生產加倍單倍體的缺點［5-6，8］。因而， 通過未減數配子實現染色體自動加倍， 可克服人工染色體加倍過程中的技術瓶頸， 從而大大加快小麥單倍體育種的進程。

普通小麥（Triticum aestivum L.， AABBDD， 2n = 42）是最重要的糧食作物之一。該異源六倍體物種由四倍體小麥（T. turgidum， AABB， 2n = 28）與節節麥（Aegilops tauschii Cosson， DD， 2n = 14）天然雜交和染色體自然加倍形成的［9］。研究表明， 一些四倍體小麥與節節麥的單倍體雜種F1有好的育性， 并自交結實產生具有與正常普通小麥一樣的AABBDD染色體組， 表明染色體發生了自動加倍［10-17］。染色體自然加倍來自于花粉母細胞第一次分裂核再組或單次減數分裂形成的未減數雌雄配子的結合， 因為花粉母細胞僅發生了單次分裂， 因此這樣的減數分裂被稱為“類似有絲分裂的減數分裂”（類有絲分裂）［10］。事實上， 未減數配子的形成在許多小麥族物種的遠緣雜種中是一個比較普遍的現象。因為減數分裂中期染色體不配對是未減數配子形成的一個重要特征［18］，因此該過程也被稱為“univalent-dependent meiotic non-reduction”［19-21］。

四倍體小麥–節節麥雜種的未減數配子的形成主要受四倍體小麥主效基因控制［11-14］， 不同四倍體小麥存在不同的遺傳效應［10，17］?？刂莆礈p數配子形成的基因可能通過延長第一次減數分裂的染色體分離過程促進了未減數配子的形成［20］。四倍體小麥的未減數配子形成基因被導入六倍體小麥后， 仍然發揮作用。一些四倍體小麥–節節麥合成的六倍體小麥與黑麥［22］和Ae. variabilis［23］等物種的遠緣雜種仍然能夠形成未減數配子， 實現染色體自動加倍。最近，Hao等［20］在四倍體小麥3B染色體上定位了一個未減數配子主效QTL， 即QTug.sau-3B。為了在小麥育種中利用QTug.sau-3B， 一項基礎工作就是將該基因導入到普通小麥推廣品種遺傳背景中， 獲得綜合農藝性狀優良的單倍體育種橋梁材料。

研究表明， 四倍體小麥AS2255、LDN和PI94666含有未減數配子基因［17］。我們前期利用這些四倍體小麥與節節麥雜交創制的人工合成小麥，與四川小麥新品種（系）雜交、頂交， 獲得了一批綜合農藝性狀優良的小麥新品系。本試驗利用與QTug.sau-3B緊密連鎖的SSR標記和高通量DArTseq分型技術， 篩選出人工合成小麥衍生系中可能攜帶來自四倍體小麥AS2255、LDN、PI94666的QTug.sau-3B基因的材料， 為下一步的加倍單倍體育種研究提供親本資源。

表1　合成小麥改良品系的分子標記檢測結果Table 1 Molecular marker assay in improved lines of synthetic hexaploid wheat （SHW）

1　材料與方法

1.1植物材料

105份人工合成小麥改良新品系來自11個組合（表1）， 由人工合成小麥與普通小麥品種雜交而來，其親本包括18份普通小麥（SY95-71、700-011689、MY68942、川農16、Pm99915、04103、03-DH1959、南農02Y393、CN04-1、渝98767、ZL-21、川育18、鄭麥9023、SW8188、川麥42、綿麥51、川麥47和川07001）和5份人工合成小麥。這105份人工合成小麥改良新品種（系）是從大量的新品系中挑選得到的綜合農藝性狀優良、豐產性狀突出的優良品系。這5份人工合成小麥分別是SHW-L1 （系譜AS22 55/ AS60）、Syn-SAU-14 （系譜AS2255/AS2393）、Syn-SAU-7 （系譜LDN/AS77）、Syn-SAU-11 （系譜LDN/ AS2407）和Syn-SAU-39 （系譜PI94666/AS2407）［17］。上述所有改良品系、人工合成小麥及其四倍體小麥親本AS2255 （T. turgidum ssp. turgidum）、LDN （T. turgidum ssp. durum）和PI94666 （T. turgidum ssp. dicoccon）均由四川農業大學小麥研究所提供。

1.2SSR標記檢測

取新鮮葉片， 采用改良2×CTAB法提取基因組DNA［24］， 選用3個緊密連鎖的SSR標記Xgwm285、Xcfp1012和Xgpw1146篩選未減數配子形成基因QTug.sau-3B［20］。按Zhang等［25］描述的反應體系和程序進行PCR擴增和產物電泳鑒定。

1.3高通量DArTseq分型技術

將DNA樣品提供給澳大利亞Diversity Arrays Technology Pty Ltd. 公司（Canberra， Australia， http:// www.Triticarte.com.au）進行基于基因組簡化和第二代測序技術的DArTseq分析， 人工合成小麥改良材料和親本材料的基因型鑒定。從DArTseq獲得的silicoDArTs標記為顯性標記， 其結果分別賦值“1”（有）、“0” （無）和“–”（不確定）。SilicoDArTs標記在3B染色體上的位置信息由Diversity Arrays Technology Pty Ltd. 公司提供。

圖1　SSR分子標記檢測Fig. 1 PCR profiles of SSR markersA: SSR標記Xgwm285、Xcfp1012和Xgpw1146 （每份材料從左到右的3個泳道）在四倍體小麥、人工合成小麥及普通小麥的擴增結果。M: Marker； 1: 04103； 2: Pm99915； 3: 川農16； 4: AS2255；5: SHW-L1。箭頭示目標擴增片段。B: Xgpw1146在普通小麥、人工合成小麥及合成小麥改良品系的擴增結果。M: marker；1: LDN； 2: Syn-SAU-39 （PI94666/AS2407）； 3: Syn-SAU-7（LDN/AS77）； 4: Syn-SAU-11 （LDN/AS2407）； 5: 綿麥51； 6: 川麥47； 7: 川07001； 8～13: 人工合成小麥改良品系， 其中12泳道為L14-6。箭頭示目標片段。A: Amplification profile of SSR markers Xgwm285， Xcfp1012， and Xgpw1146 （from left to right in each line） in tetraploid wheat， synthetic hexaploid wheat （SHW）， and common wheat. M: marker；1: 04103； 2: Pm99915； 3: Chuannong 16； 4: AS2255； 5: SHW-L1. Arrows show the target band. B: Xgpw1146 amplification profile in common wheat， SHW， and improved lines of SHW， M: marker；1: LDN； 2: Syn-SAU-39 （PI94666/AS2407）； 3: Syn-SAU-7（LDN/AS77）； 4: Syn-SAU-11 （LDN/AS2407）； 5: Mianmai 51；6: Chuanmai 47； 7: Chuan 07001； 8–13: SHW lines， in which lane 12 is L14-6. The arrow shows the target band.

2　結果與分析

利用3個與QTug.sau-3B緊密連鎖SSR標記檢測表明， 只有Xgpw1146在四倍體小麥AS2255及合成小麥SHW-L1的擴增產物大小相同， 且擴增產物小于在普通小麥親本04103、Pm99915、川農16中的擴增片段（圖1-A）。以前的研究表明， Xgpw1146可作為跟蹤QTug.sau-3B的理想標記［26］， 因此，Xgpw1146標記被進一步用于篩選人工合成小麥改良品系（圖1-B）。

利用標記Xgpw1146檢測105份人工合成小麥改良材料， 共檢測到17份材料存在與人工合成小麥（或四倍體小麥）相同的等位位點（表1）， 占所篩選后代的9.1%。其中， 源于四倍體小麥AS2255的改良新品系有16份， 占所篩選后代的17%， 涉及LDN的合成小麥改良后代僅有L14-6品系（圖1-B）。由于該品系的人工合成小麥親本涉及兩個四倍體小麥（LDN和PI94666）， 且這2個四倍體材料在Xgpw1146位點沒有差異， 因此， 不能判斷該材料導入的該位點來自哪個四倍體小麥。

選擇人工合成小麥SHW-L1改良品系88個進行DArTseq分析， 其中10份材料含有SHW-L1的Xgpw1146標記等位位點（表1）。DArTseq分析獲得815個位于3B染色體上且具有位置信息的SilicoDArTs標記?？紤]到可能存在假陽性標記， 以1 cM為步長， 分別計算每個品系在這1 cM內與其對應親本間的相同標記占標記總數的百分率， 并根據百分率的高低來判斷該區段來源于哪個親本。如果一個品系在該1 cM區段內大于90%的標記與其中一個親本相同， 且和其他親本相同的標記數小于90%， 則認為該區段來源于大于90%相同標記的親本材料； 如果一個品系相鄰的1 cM區段來源于同一個親本， 則合并這些區段為一個更大的區段， 并重新計算該區段內分子標記和該品系各個親本之間的相同率。根據已構建的遺傳圖譜， 與未減數配子基因QTug.sau-3B連鎖的SSR標記Xgpw1146與DArT標記wPt-7152的遺傳距離為4.66 cM［20］（圖2-A）， 而DArTseq圖譜上標記wPt-7152位于101.69 cM處（圖2-B）。因此， 對包含wPt-7152標記的染色體區段101.67～107.37 cM和臨近wPt-7152的93.78～98.97 cM區段重點分析， 因為QTug.sau-3B可能位于這2個區段之間。根據標記分布情況， 已檢測到含有SHW-L1分子標記Xgpw1146等位位點的10個品系全部含有這2個染色體區段（圖2-B）， 表明這些品系可能具有源于四倍體小麥未減數配子基因QTug. sau-3B的染色體區段。另外， 雖然L13-336、L13-376和L13-71的93.78～98.97 cM區段可能也來源于SHW-L1， 但是包含wPt-7152標記的染色體區段101.67～107.37 cM及其Xgpw1146標記等位位點均不來自SHW-L1親本。因此推測， 四倍體小麥的未減數配子基因可能沒有導入這3個品系。

圖2　小麥基因QTug.sau-3B遺傳連鎖圖（A）、DArTseq連鎖標記wPt-7152的鄰近區段 （B）及合成小麥改良品系中QTug.sau-3B鄰近區段檢測（C）Fig. 2 Linkage map of gene QTug.sau-3B （A）， linked DArTseq marker wPt-7152 and its adjacent regions （B）， and detection of adjacent regions harboring QTug.sau-3B in improved lines of synthetic hexaploid wheatA: QTug.sau-3B連鎖圖譜來自Hao等［20］； B: 可能含有與QTug.sau-3B相鄰的2個染色體區段101.67–107.37 cM （紅色矩形區域）和93.78–98.97 cM （綠色矩形區域）區段在DArTseq-3B圖譜（由Diversity Arrays Technology Pty Ltd. 公司提供）上的位置。C: 2個染色體區段中任何一個和人工合成小麥親本該區段相同標記數大于90%的株系， 其中， 藍色橫線表示檢測含有SHW-L1的Xgpw1146等位位點的株系， 株系L13-81、L13-316、L13-326、L13-331、L13-341和L13-366中P1、P2、P3分別代表它們的小麥親本川農16、Pm99915-1、04103； 株系L13-461、L13-466和L13-471中P1代表川農16， P2代表Pm99915-1， P3代表03-DH1959。A: Linkage map of QTug.sau-3B according to Hao et al.［20］； B: Location information of two chromosome segments nearby QTug.sau-3B on linking map of DArTseq-3B （provided by Diversity Arrays Technology Pty Ltd.）， covering 101.67–107.37 cM （red rectangular region） and 93.78–98.97 cM （green rectangular region）； C: The elite lines showed same markers more than 90%， compared to one of the two segments in synthetic hexaploid wheat. The blue lines represent the elite lines with the Xgpw1146 allele from SHW-L1. P1， P2， and P3 represent Chuannong16， Pm99915-1， and 04103， respectively， which are their common wheat parents of lines L13-81， L13-316， L13-326， L13-331， L13-341，and L13-366. P1， P2， and P3 represent Chuannong16， Pm99915-1 and 03-DH1959， respectively， the parents of lines L13-461， L13-466， and L13-471.

3　討論

加倍單倍體在遺傳和育種研究中有重要的應用價值。產生加倍單倍體包括兩個關鍵步驟， 一是產生單倍體， 目前已經有產生小麥單倍體的比較成熟和可靠的方法， 如小麥–玉米雜交法； 二是對獲得的單倍體進行染色體加倍， 目前常見的加倍方法是用秋水仙堿等藥品， 處理， 但是該方法存在處理程序繁瑣、工作量大、條件不易控制、成功率低、藥品對植株有毒害作用、誘導遺傳變異等缺點， 而且秋水仙堿等藥品對人畜有毒， 容易造成環境污染。因此， 人工加倍方法不利于大規模的批量生產加倍單倍體， 從而限制了加倍單倍體在遺傳育種中的實際應用效率。利用普通小麥單倍體自身具有的染色體自動加倍功能， 可以解決上述問題。本研究篩選出的可能具有未減數配子基因QTug.sau-3B、且綜合農藝性狀優良的新材料， 是單倍體育種潛在的育種親本。下一個階段的任務是將這些材料誘導成單倍體，評價其實際加倍效果， 同時利用它們構建育種群體評估在加倍單倍體育種中的實際應用價值。

4　結論

在人工合成小麥改良后代中篩選出17個具有未減數配子基因連鎖標記的品系， 這些材料在小麥加倍單倍體育種中有非常重要的應用價值。

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Detection of the Molecular Marker and Chromosomal Segment linked to Unreduced Gamete Gene in Common Wheat

KOU Chun-Lan， ZHAO Lai-Bin，*LIU Meng， HAO Ming， NING Shun-Zong， YUAN Zhong-Wei， LIU Deng-Cai， and ZHANG Lian-Quan
Triticeae Research Institute， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China

Hexaploid common wheat （Triticum aestivum L.， AABBDD， 2n = 42） arose from spontaneous chromosome doubling of the hybrid between T. turgidum and Aegilops tauschii Cosson. The process of chromosomes doubling is mainly determined by unreduced gametes （UG） genes in T. turgidum. The genetic effects on the UG production may vary among T. turgidum lines. In this study， a SSR marker close to the UG gene QTug.sau-3B （Xgpw1146） and high throughput DArTseq genotyping technique were used to screen the UG gene in common wheat lines transferred from T. turgidum via synthetic hexaploid wheat （SHW） as a bridge. Out of the analyzed 105 SHW-derived elite lines， 17 had the Xgpw1146 allele from T. turgidum， indicating that the UG gene was probably transferred into these wheat lines. According to the DArTseq genotyping data on 88 lines derived from the synthetic hexaploid wheat SHW-L1， all these lines with the T. turgidum Xgpw1146 allele contained a chromosomal segment of SHW-L1，probably covering the Xgpw1146 locus. This indicates that the adjacent region of the UG gene as a chromosomal segment was transferred into wheat lines. These SHW-derived lines have important application potential on wheat doubled haploid breeding.

Allohexaploid； Synthetic wheat； Unreduced gamete

10.3724/SP.J.1006.2016.00984

本研究由國家自然科學基金項目（31271723， 31201210）， 四川省杰出青年基金項目（2011JQ0016）和四川省教育廳科研項目（14ZA0012）資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China （31271723， 31201210）， Sichuan Provincial Youth Fund（2011JQ0016）， and the Scientific Research Foundation of the Education Department of Sichuan Province （14ZA0012）.

（Corresponding author）: 張連全， E-mail: zhanglianquan1977@126.com， Tel: 028-82650313

聯系方式: E-mail: 510531588@qq.com

Received（）: 2015-11-04； Accepted（接受日期）: 2016-03-14； Published online（網絡出版日期）: 2016-03-28.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160328.1116.004.html