大豆鹽脅迫相關GmNAC基因的鑒定、表達及變異分析

張彥威　張禮鳳　李　偉　王彩潔　張　軍　徐　冉，*

1山東省農業科學院作物研究所， 山東濟南 250131；2東北農業大學大豆生物學教育部重點實驗室， 黑龍江哈爾濱 150001

大豆鹽脅迫相關GmNAC基因的鑒定、表達及變異分析

張彥威1，2張禮鳳1李偉1王彩潔1張軍1徐冉1，*

1山東省農業科學院作物研究所， 山東濟南 250131；2東北農業大學大豆生物學教育部重點實驗室， 黑龍江哈爾濱 150001

NAC基因在植物的逆境脅迫中發揮著重要作用。本研究參照水稻和擬南芥的逆境相關NAC基因， 采用生物信息學方法鑒定了大豆逆境相關GmNAC基因， 利用熒光定量PCR技術分析了GmNAC基因在耐鹽差異的大豆品種根部、葉片的表達及其對NaCl脅迫的應答， 采用反轉錄PCR技術克隆了表達差異顯著的GmNAC基因。結果表明， 大豆GmNAC基因家族包含175個基因， 其中11個基因所編碼的GmNAC蛋白與水稻和擬南芥的逆境相關NAC蛋白位于同一進化分支， 這些蛋白具有高度保守的NAC結構域； 這11個GmNAC基因在大豆根部的表達均高于在葉片，而且在葉片和根部均受NaCl誘導， 部分基因在根部和葉片以及品種間表現出不同的表達規律； 在大豆品種齊黃34、徐豆10和汾豆95中， Glyma06g11970.1存在3個同義突變和1個非同義突變， Glyma06g16440.2存在1個同義突變。

大豆； GmNAC； 進化樹； NaCl處理； 表達分析； 序列變異

高溫、低溫、干旱和鹽堿等非生物逆境脅迫嚴重影響作物的生長， 造成作物大幅度減產［1］。NAC蛋白是一類植物特異的參與多種植物生理生化過程的轉錄因子［2］， 廣泛參與植物生長發育以及逆境應答。NAC （NAM， ATAF1-2， CUC2）最初起源于NAM（no apical meristem）， ATAF1-2和CUC2 （cup-shaped cotyledon）［3］。NAC蛋白包含一個保守的N-端DNA結合域和一個多樣化的轉錄調控域［4］。NAC家族成員能夠激活植物的逆境應答基因， 提高植物對逆境的耐受性。AtNAC072和AtNAC019是擬南芥的ABA信號通路的關鍵基因， AtNAC072的表達受高鹽、脫落酸（ABA）、生長素、乙烯、茉莉酸（JA）、脫水、損傷等多種因素誘導并參與植物的信號傳導［5］， AtNAC019的表達 受ABA、熱、高鹽、JA、干旱應答等因素誘導， 并調節植物生長發育［6-8］。AtNAC055是擬南芥JA信號通路的關鍵基因， 調控JA的生物合成， 并能對高鹽、真菌等多種逆境應答［7-8］。AtNAC102能夠參與擬南芥的洪澇脅迫應答［9］。OsNAC002［10-13］、OsNAC048［14-15］和OsNAC068［16］參與水稻的耐旱、耐鹽等多種逆境脅迫。

隨著對大豆NAC基因家族研究的深入， 越來越多的大豆NAC類轉錄因子得到了鑒定。孟慶長等首次在大豆中克隆得到6個GmNAC基因［17-18］； 韓巧玲等［19］利用NTT （核蛋白篩選系統）從大豆耐鹽品種鐵豐8號中克隆得到GmNAC2a基因， 該基因對干旱、高溫、低溫、高鹽、ABA、乙烯等多種途徑均有響應； 金杭霞等［20］發現GmNAC2參與逆境調控，GmNAC5參與大豆發育調控； 才華等［21］利用酵母單雜交的方法從野生大豆中克隆得到能與耐逆相關順式元件MYB1AT特異結合的GsNAC20基因， 該基因能夠響應高鹽、干旱和低溫脅迫， 并且在根和葉中具有不同的表達模式， 超量表達GsNAC20的擬南芥提高鹽脅迫的敏感性； Tran等［22］在大豆中克隆了31個GmNAC基因， 發現9個NAC基因能同時響應干旱、高鹽、冷、ABA等脅迫應答， 聚類分析發現9個GmNAC基因與前人報道的逆境相關NAC基因位于同一分支； Le等［23-24］利用大豆基因組數據庫預測得到152個GmNAC基因， 發現58個基因可能參與逆境脅迫應答， 經定量分析發現25個和6個基因在干旱脅迫時分別上調和下調2倍以上； 王洋等［25］利用大豆基因組數據庫預測得到152個GmNAC基因，并將其劃分為10個亞家族； Hao等［26-27］研究發現，GmNAC11、GmNAC20通過調節DREB1A等相關基因增強植物高鹽脅迫耐性， 進一步研究表明GmNAC20既可以調控生長素信號相關基因促進植株側根形成， 又可以激活DREB/CBF-COR途徑增強植物的高鹽脅迫和冷脅迫耐性。

本研究在前期大豆品種耐鹽性鑒定的基礎上，利用生物信息學手段挖掘大豆中逆境相關的GmNAC基因， 采用熒光定量PCR技術分析其在不同耐鹽性大豆品種中的表達規律， 探索GmNAC基因對鹽脅迫的應答， 克隆鹽脅迫相關基因， 分析候選基因序列變異， 為抗逆轉基因品種的培育提供基因材料及理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

選用本課題組前期鑒定的耐鹽品種徐豆10、齊黃34和鹽敏感品種汾豆95。

1.2NAC蛋白質序列的獲得

從植物轉錄因子數據庫PlantTFDB （http:// planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下載大豆NAC轉錄因子序列， 對去冗余后的蛋白序列根據Phytozome （http:// phytozome.org/）的功能注釋并利用SMART （http:// smart.embl-heidelberg.de/）分析氨基酸結構域， 獲得具有NAC保守結構域的候選基因； 查詢文獻獲得擬南芥和水稻逆境脅迫相關的NAC蛋白質序列。

1.3NAC蛋白家族系統進化樹分析

利用MEGA 5.05軟件內置的Clustal W程序對獲得的NAC蛋白進行序列比對； 根據多重序列比對結果， 使用MEGA 5.05軟件采用最大似然法（maximum likelihood， ML）構建系統進化樹。

1.4大豆GmNAC基因的表達分析

選取與擬南芥和水稻的逆境脅迫相關NAC蛋白位于同一進化分支的大豆GmNAC蛋白， 查詢文獻或利用Primer 5設計引物進行熒光定量分析（表1）。將大豆種子播種于裝有細沙的育苗盤中， 用1/4 MS培養液澆灌至大豆第一片三出復葉全展， TRIzol法提取大豆根部和葉片RNA， 利用Roche Lightcycler 480II進行熒光定量PCR， 利用2–ΔΔCt數據分析該基因在根葉中的表達情況； 將大豆種子播種于細沙的育苗盤中， 用1/4 MS培養液澆灌至大豆第1片三出復葉全展， 移至水培， 添加150 mmol L–1NaCl的1/4 MS培養液處理， 1/4 MS培養液處理作為空白處理， 分別采集處理1、3、6和12 h的葉片和根提取RNA并定量分析表達情況。

1.5基因克隆及序列分析

根據GmNAC的表達結果， 選取相關基因進行克隆。根據基因的5' UTR和3' UTR序列設計引物（表2）， 分別以徐豆10、齊黃34和汾豆95的cDNA為模板進行基因克隆。利用DNAMAN對測序成功的基因進行序列比對， 分析變異位點。

2　結果與分析

2.1NAC蛋白系統進化樹分析

從PlantTFDB下載大豆NAC轉錄因子序列247個， 去冗余后根據Phytozome的功能注釋并利用SMART進行氨基酸結構域分析獲得175條含有保守結構域的大豆GmNAC序列。通過文獻檢索（表3）分別獲得擬南芥逆境相關NAC蛋白4條， 即AtNAC019、AtNAC055、AtNAC072和AtNAC102；水稻逆境相關NAC蛋白3條， 即OsNAC002（SNAC1）、OsNAC048 （OsNAC6）和OsNAC068 （Os-NAC4）。將其與175條大豆GmNAC家族蛋白進行進化樹分析（圖1）， 有11條大豆GmNAC蛋白與擬南芥和水稻逆境脅迫相關NAC蛋白處于同一分支， 分別為Glyma12g35000.1 （GmNAC092）、Glyma06g38410.1（GmNAC043）、Glyma13g35550.1 （GmNAC101）、Glyma12g22880.1 （GmNAC085）、Glyma04g42800.1（GmNAC022）、Glyma02g26480.1 （GmNAC011，GmNAC20）、Glyma14g24220.1 （GmNAC109）、Glyma06g16440.2、Glyma06g11970.1、Glyma04g 38560.1和Glyma05g32850.1， 其中7個基因GmNAC011、GmNAC022、GmNAC043、GmNAC085、GmNAC 092、GmNAC 101和GmN AC109受干旱脅迫誘導。

表1　熒光定量引物序列Table 1 Primer sequence for real-time PCR

表2　基因克隆引物序列Table 2 Primer sequence for gene cloning

2.2大豆候選逆境相關NAC氨基酸序列比對

序列比對發現， 11個大豆NAC蛋白與擬南芥和水稻逆境相關的NAC蛋白結構域高度保守， 具有典型的NAC轉錄因子結構特征（圖2）。AtNAC072、AtNAC019、AtNAC055、Glyma12g35000.1、Glyma 06g38410.1、Glyma13g35550.1、Glyma12g2288 0.1具有較高的同源率， AtNAC102、AtNAC002、Glyma04g42800.1、Glyma02g26480.1、Glyma14g242 20.1、Glyma06g16440.2、Glyma06g119 70.1、Glyma0 4g38560.1、Glyma05g32850.1具有較高的同源率， 這與基因的進化樹分析的結果是一致的。

2.3GmNAC在大豆根部的表達

熒光定量分析GmNAC在大豆根部的表達規律（圖3）， 6個GmNAC基因Glyma12g35000.1、Glyma 06g38410.1、Glyma12g22880.1、Glyma06g16440.2、Glyma04g 38560.1、Glyma05g32850.1在耐鹽品種徐豆10和齊黃34根部的表達量均高于鹽敏感品種汾豆95； 2個GmNAC基因Glyma13g35550.1和Glyma14 g24220.1等在耐鹽品種齊黃34根部的表達量高于鹽敏感品種汾豆95； Glyma06g11970.1基因在耐鹽品種徐豆10根部的表達量高于鹽敏感品種汾豆95；Glyma04g42800.1、Glyma02g26480.1等2個GmNAC基因在3個品種根部的表達量差異不大。

表3　水稻和擬南芥逆境相關NAC基因Table 3 Stress related NAC genes in rice and Arabidopsis

圖1　NAC蛋白系統進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of NAC proteins·: 大豆干旱脅迫誘導的GmNAC蛋白； ○: 水稻和擬南芥中逆境相關的NAC蛋白?！? GmNAC proteins induced by drought in soybean； ○: Stress related NAC proteins in rice and Arabidopsis.

150 mmol L–1NaCl水培處理徐豆10、齊黃34和汾豆95， 熒光定量分析GmNAC在其根部的表達量（圖4）。GmNAC在根部的表達呈現品種間差異。在徐豆10根中， Glyma04g42800.1、Glyma06g164 40.2、Glyma06g11970.1、Glyma04g38560.1、Glyma 05g32850.1在NaCl處理1、3和6 h均下調表達， 但在12 h趨于穩定。其他6個基因在不同時刻小幅上調或下調表達， 未表現出明顯規律。在齊黃34根中，除Glyma04g42800.1外， GmNAC均不同程度的上調表達， 其中， Glyma06g16440.2、Glyma06g11970.1、Glyma05g32850.1在3 h達到上調高峰； Glyma 13g35550.1、Glyma14g24220.1在6 h達到上調高峰；Glyma12g35000.1、Glyma06g38410.1、Glyma12g22 880.1、Glyma02g264 80.1、Glym a04g38560.1在12 h達到上調高峰； 除3 h外， Glyma04g42800.1在其他取樣時間均不同程度的下調表達。NaCl處理1 h和3 h時， GmNAC在汾豆95根中不同程度的上調或下調表達， 但在6 h和12 h時， 所有GmNAC基因均持續上調表達， 并在不同時間達到上調高峰。

圖2　候選逆境相關NAC蛋白序列比對Fig. 2 Sequence alignment of candidate stress-related NAC proteins

圖3　GmNAC基因在根部的表達Fig. 3 Expression of GmNAC in root 1: Glyma12g35000.1； 2: Glyma06g38410.1； 3: Glyma13g35550.1； 4: Glyma12g22880.1； 5: Glyma04g42800.1； 6: Glyma02g26480.1；7: Glyma14g24220.1； 8: Glyma06g16440.2； 9: Glyma06g11970.1； 10: Glyma04g38560.1； 11: Glyma05g32850.1.

2.4GmNAC在大豆葉片的表達

熒光定量分析GmNAC在大豆葉片中的表達規律（圖5）， 7個GmNAC基因Glyma12g22880.1、Glyma04g42800.1、Glyma14g24220.1、Glyma06g 16440.1、Glyma06g11970.1、Glyma04g38560.1、Glyma 05g32 850.1在耐鹽品種徐豆10和齊黃34葉片的表達量均高于鹽敏感品種汾豆95； Glyma02g26480.1基因在耐鹽品種徐豆10葉片的表達量高于鹽敏感品種汾豆95； 3個GmNAC基因Glyma12g35000.1、Glyma06g38410.1、Glyma13g355 50.1在耐鹽品種徐豆10和齊黃34葉片的表達量均低于于鹽敏感品種汾豆95。

150 mmol L–1NaCl水培處理徐豆10、齊黃34和汾豆95， 熒光定量分析GmNAC在其葉片的表達量（圖6）。幾乎所有的GmNAC在大豆葉片中均高度上調表達。在徐豆10葉片中， Glyma12g35000.1、Glyma06g38410.1、Glyma13g35550.1、Glyma12g228 80.1、Glyma02g26480.1、Glyma14g24 220.1和Glyma06g16440.2上調表達， 并在6 h后達到高峰；Glyma04g42800.1在6 h達到上調高峰， 但在1 h和12 h均下調表達； Glyma06g11970.1、Glyma04g38 560.1和Glyma05g32850.1均在12 h達到上調高峰，但在3 h下調表達。Glyma12g35000.1、Glyma06g38 410.1、Glyma13g35550.1和Glyma06g11970.1在齊黃34葉片中表達規律與徐豆10相同， 但表達倍數稍有不同； Glyma12g22880.1和Glyma14g24220.1在齊黃34葉片中上調表達， 并在12 h達到高峰；Glyma04g42800.1在1 h、3 h和6 h均下調， 但在12 h上調表達； Glyma02g26480.1在6 h達到上調高峰，但在1 h下調表達； Glyma06g16440.2和Glyma06g11 970.1在12 h達到上調高峰， 但在3 h下調表達；Glyma04g38560.1在12 h達到上調高峰， 但在3 h和6 h均下調； Glyma05g32850.1在1 h達到上調高峰，并在3 h開始下調之后持續上調表達。Glyma12g3 5000.1、Glyma06g38410.1、Glyma13g35550.1和Glyma02g26480.1在汾豆95葉片的表達規律和徐豆10相同， 但表達倍數稍有不同； Glyma04g42800.1在汾豆95中下調表達； Glyma12g22880.1、Glyma14g 24220.1、 Glyma06g16440.2、Glyma06g11970.1、Glyma04g385 60.1 和Gly ma05g 32850.1在汾豆95葉片中均上調表達并在3 h達到上調高峰。

圖4　NaCl處理后GmNAC基因的根部表達Fig. 4 Expression of GmNAC in root treated with NaCl

圖5　GmNAC基因在葉片的表達Fig. 5 Expression of GmNAC in leaf 1: Glyma12g35000.1； 2: Glyma06g38410.1； 3: Glyma13g35550.1； 4: Glyma12g22880.1； 5: Glyma04g42800.1； 6: Glyma02g26480.1；7: Glyma14g24220.1； 8: Glyma06g16440.2； 9: Glyma06g11970.1； 10: Glyma04g38560.1； 11: Glyma05g32850.1.

圖6　NaCl處理后GmNAC基因的葉片表達Fig. 6 Expression of GmNAC in leaf treated with NaCl

圖7　GmNAC基因在大豆品種中的序列變異Fig. 7 Sequence variations of GmNAC in soybean varietiesa: Glyma06g11970.1在大豆品種中的序列變異； b: Glyma06g16440.2在大豆品種中的序列變異。a: Variations of Glyma06g11970.1 in soybean varieties； b: Variations of Glyma06g16440.2 in soybean varieties.

2.5候選耐鹽相關NAC基因的序列變異

表達分析表明， 4個新發現的逆境候選GmNAC基因中， Glyma05g32850.1在大豆葉片和根部的表達量都很低， 雖然受NaCl脅迫誘導， 但在耐鹽差異品種中未表現出特異的規律。選擇其余3個表達差異顯著的新基因（Glyma04g38560.1， Glyma06g11970.1和Glyma06g16440.2）進一步的克隆分析表明，Glyma04g38560.1在徐豆10、齊黃34、齊黃35中序列一致。Glyma06g11970.1 （圖7-a）存在3個同義突變和1個非同義突變， 其中， 距起始密碼子174 bp處發生同義突變， 突變類型為C/T； 距起始密碼子444 bp處發生T/G的非同義突變， 導致所編碼的氨基酸從天冬氨酸轉變到谷氨酸， 但未引起蛋白質疏水性的變化； 距起始密碼子591 bp處發生A/G的同義突變； 距起始密碼子611 bp處發生G/C的同義突變。Glyma06g16440.2 （圖7-b）在距起始密碼子681 bp處存在1個同義突變， 突變類型為G/A。這些變異是否導致基因功能的變異還需進一步的功能分析。

3　討論

3.1逆境相關GmNAC基因的挖掘

高溫、低溫、干旱、鹽堿等非生物逆境脅迫嚴重影響大豆的生長， 造成大豆的大幅度減產甚至絕產。NAC類轉錄因子在水稻、擬南芥等植物的生長發育、衰老、細胞分裂、逆境脅迫等途徑中發揮著重要的作用。前人利用大豆基因組數據庫獲得152個GmNAC基因［23-25］， 本研究利用植物轉錄因子數據庫獲得175個GmNAC基因， 這可能是基于的數據庫不同造成的。李偉等［28］在分析22種NAC蛋白進行時發現非生物逆境相關的NAC蛋白聚成一類。You等［29］利用同源分析鑒定了18個可能參與非生物逆境應答的二穗短柄草NAC基因， 同時分析101個二穗短柄草的NAC基因在非生物逆境脅迫和逆境相關激素處理下的表達模式， 證實這18個基因可能在非生物逆境應答中發揮功能， 進一步證實基于進化樹分析的功能預測在逆境相關NAC基因挖掘上的可行性。Tran等［22］在大豆中克隆了31個GmNAC基因，發現9個NAC基因能同時響應干旱、高鹽、冷、ABA等脅迫應答， 且與前人報道的逆境相關NAC基因聚成一類， 本研究經聚類分析發現11個大豆GmNAC基因與擬南芥和水稻中報道的逆境相關的NAC基因位于同一分支， 推測這11個NAC為大豆逆境相關基因。王洋等［25］將大豆NAC基因分為10個亞家族，其中第6亞家族包含的11個基因與本研究推測的逆境相關候選基因相同。研究表明， 11個基因中，GmNAC011、GmNAC022、GmNAC043、GmNAC085、GmNAC092、GmNAC101和GmNAC109受干旱脅迫誘導［23-24］， 同時過表達GmNAC011的擬南芥能夠提高鹽脅迫和冷脅迫耐性［26-27］， 說明位于同一分支的11個候選基因可能均參與大豆逆境脅迫的應答。本研究同時發現， GmNAC11 （Glyma19g28476）等［26-27］多個逆境誘導基因位于相鄰分支， 可能暗示大豆中存在著更多的逆境相關NAC基因。Glyma12g13710.1等［23-24］干旱誘導基因距離水稻和擬南芥的逆境相關NAC基因較遠， 這些基因參與其他未知的逆境調控途徑。

3.2候選GmNAC基因的鹽脅迫誘導

植物的逆境脅迫應答由多個復雜的網絡通路共同調控， NAC受多種逆境、激素誘導。AtNAC019、AtNAC055、AtNAC072等基因參與高鹽應答反應［5-8］，其在大豆中的同源基因在本研究中均受NaCl誘導。大豆逆境相關候選GmNAC基因的表達在根部高于葉片， 這與前人的結果是一致的。NaCl脅迫下， 候選GmNAC在根部和葉片的表達模式不同， 這可能暗示大豆對鹽脅迫應答存在組織特異性。Glyma12g35000.1、Glyma06g38410.1、Glyma13g35 550.1在耐鹽品種齊黃34和徐豆10中表達量均低于在鹽敏感品種汾豆95中， Glyma14g24220.1、Glyma06g16440.2、Glyma06g11970.1、Glyma04g3856 0.1和Glyma05g32850.1在耐鹽品種齊黃34和徐豆10中表達量均高于在鹽敏感品種汾豆95中， 這可能與大豆品種的耐鹽性差異有關。Hao等［26-27］研究表明，NaCl脅迫下GmNAC011在葉片中的表達量顯著上升， 并在12 h達到表達高峰； 本研究表明， NaCl誘導下GmNAC011在葉片中的表達量顯著上升， 但在6 h時達到表達高峰， 這可能與取樣時間、大豆品種、NaCl處理濃度等多種因素有關， 本研究還發現，GmNAC011在大豆根部受NaCl的誘導程度弱于在葉片。NaCl脅迫下， 除Glyma12g22880.1外， 其他10個基因在葉片中的變化程度遠大于在根部， 且同一個基因在根和葉片中表現出不同的表達規律，這可能與基因參與的代謝通路有關。NaCl脅迫下，數個基因在汾豆95的表達高峰比齊黃34和徐豆10中相對提前可能與品種的鹽敏感程度有關。Glyma06g11970.1 和Glyma06g16440.2在齊黃34、徐豆10和汾豆95中存在序列差異， 這可能與品種的耐鹽性有關， 這些變異位點的作用還需要進一步的功能分析。

4　結論

獲得了3個鹽脅迫相關的GmNAC基因（Glyma04g38560.1、Glyma06g11970.1和Glyma0 6g16440.2）， 其中Glyma06g11970.1和Glyma0 6g16440.2在徐豆10、齊黃34和汾豆95中存在SNP位點。

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自80“魯布革沖擊波”到現在，是中國水利工程建設便真正進入到了一個由行業監管的時代當中。從始至終，該體系的建成帶來很多值得驕傲的經濟效益和很好的社會反響，不過在實踐過程中也發生了很多問題，也逐漸顯露出很多的缺陷，大致表現如下：

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Identification， Expression and Variation Analysis of Salt Tolerance Related GmNAC Genes in Soybean

ZHANG Yan-Wei1，2， ZHANG Li-Feng1， LI Wei1， WANG Cai-Jie1， ZHANG Jun1， and XU Ran1，*1Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250131， China；2Key Laboratory of Soybean Biology of Ministry of Education， Northeast Agricultural University， Harbin 150001， China

NAC genes play an important role in plant stress tolerance. In this study， bioinformatic method was used to identify the stress related GmNAC gene in soybean. The expression of candidated GmNAC genes in root and leaf was analyzed in soybean with NaCl treatment by Real-time PCR. Reverse transcription PCR was performed to clone genes with significant difference in expression. The results showed that there were 175 genes in soybean GmNAC gene family. There were 11 GmNAC proteins with highly conserved NAC located on the same evolutionary branch with the stress related NAC proteins in rice and Arabidopsis. The expression of 11 GmNAC genes in soybean root was higher than that in leaf. The GmNAC genes were all induced by NaCl stress，but part of the GmNAC genes showed different expression levels between root and leaf in soybean varieties with different salt tolerances. There were three synonymous mutations and one non-synonymous mutation on the CDS region of Glyma06g11970.1 and one synonymous mutation on the CDS region of Glyma06g16440.2 in Qihuang 34， Xudou 10， and Fendou 95.

Soybean； GmNAC； Phylogenetic tree； NaCl treatment； Expression analysis； Sequence variation

10.3724/SP.J.1006.2016.00990

本研究由 東北農業大學大豆生物學教育部重點實驗室開放基金項目（SB14A04）， 國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-04-CES18）， 國家自然科學基金項目（31501329）和山東省自然科學基金項目（ZR2015YL070）資助。

The study was supported by the Open Foundation of Key Laboratory of Soybean Biology of Ministry of Education， Northeast Agricultural University （SB14A04）， the China Agriculture Research System （CARS-04-CES18）， the National Natural Science Foundation of China（31501329）， and the Natural Science Foundation of Shandong Province （ZR2015YL070）.

（Corresponding author）: 徐冉， E-mail: soybeanxu@126.com

聯系方式：E-mail: 13854198480@163.com， Tel: 0531-83179348

Received（）: 2015-12-16； Accepted（接受日期）: 2016-03-14； Published online（網絡出版日期）: 2016-03-28.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160328.1116.008.html