木通與川木通及關木通的快速PCR鑒別△

崔占虎，袁媛，胡峻

(1.南陽市第一人民醫院，河南 南陽 473010；2.道地藥材國家重點實驗室培育基地 中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700)

木通與川木通及關木通的快速PCR鑒別△

崔占虎1，袁媛2*，胡峻2

(1.南陽市第一人民醫院，河南 南陽 473010；2.道地藥材國家重點實驗室培育基地 中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700)

目的：建立一種準確、快速、高效鑒別木通、川木通及關木通的分子鑒別方法。方法：采集不同產地的木通、川木通及關木通基原植物，所有樣品進行總DNA的提取，通過對木通、川木通及關木通樣品trnL-trnF片段進行擴增、測序，進行同源比對后根據其變異位點設計特異性鑒別引物，采用2步法進行PCR擴增，從而對木通、川木通及關木通進行鑒別。結果：通過對影響PCR反應時間的退火溫度、變性溫度、退火時間、變性時間、循環次數等因素進行優化，并對不同型號PCR儀進行考察，分別獲得木通、川木通及關木通快速PCR反應程序。在PCR產物中加入SYBR Green I染料，正品顯示出明亮綠色熒光，而混淆品不顯示熒光。結論：快速PCR方法可以簡單快速鑒別木通、川木通及關木通，為實現藥材分子鑒別的現場運用提供技術支撐。

快速PCR；木通；分子鑒定；熒光檢測

木通為木通科植物木通Akebiaquinata(Thunb.) Decne、三葉木通A.trifoliata(Thunb.) Koidz.或白木通A.trifoliata(Thunb.) Koidz.var.australis(Diels) Rehd.的干燥藤莖。有利尿通淋、清心除煩、通經下乳的功能，可用于淋證、水腫、心煩尿赤、口舌生瘡、經閉乳少、濕熱痹痛[1]。

據文獻考證，古代所用木通正品是木通科的木通。清代《植物名實圖考》提出毛茛科木通，即川木通，來源包括毛茛科植物小木通ClematisarmandiiFranch.或繡球藤ClematisMontanaBuch.-Ham.的干燥藤莖。然而歷代中本草中未見有“關木通”的記載。直到1954年，任仁安等通過調查發現我國商品木通主要為馬兜鈴科植物東北馬兜鈴AristolochiamamshuriensisKom.的干燥藤莖[2]。其后，《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)1963年版收錄了關木通，其基原為馬兜鈴科植物東北馬兜鈴；同時分別收錄了木通、川木通。但因藥源短缺，自1977年版至2000年版《中國藥典》則將木通刪去，僅收錄了川木通和關木通，而醫師處方和藥物制劑的實用名則仍為木通，同名異物現象甚為嚴重。在中醫藥科技工作者的努力下，對木通類商品進行了系統的研究工作，《中國藥典》2005年版收載木通科植物木通、三葉木通或白木通的藤莖為木通。由于歷史變遷、本草記述中異物同名、同名異物和地區習慣用藥等原因，商品木通存在嚴重的品種混亂情況。2005年版《中國藥典》將木通正名后，商品木通的市場大有好轉，但部分地區仍存在混淆使用的情況，必須引起充分的注意[2]。3種不同來源的商品多加工為薄片，外觀上區別不大，很容易混淆不清，因此，建立一種鑒別木通、川木通和關木通的方法至關重要。

近年來，不同研究學者分別采用高效液相色譜法、近紅外光譜法、紫外光譜法以及DNA條形碼方法等對3種不同來源的木通進行鑒定研究[3-6]，但這些方法操作比較繁瑣，用時較長，不利于推廣，難以適應當前中藥分子鑒定技術現場運用的需要[7]。PCR作為分子生物學中應用最廣泛的技術之一，隨著研究和應用領域的不斷增長，存在著相當巨大的改進空間。自Millus等[8]發明PCR技術以來，一些學者不斷調整PCR條件對PCR技術進行改良，并提出了快速PCR概念[9-11]。

快速、準確、高通量鑒別是現代中藥分子鑒別的核心需要，目前快速PCR方法已成功用于部分中藥材鑒定方面的研究，如金銀花、蛇類藥材等中藥材的真偽鑒別[12-13]，本文基于位點特異性PCR技術建立了木通、川木通及關木通快速PCR鑒別方法，并引入了熒光染料法對真偽鑒別結果進行檢測，可明顯縮短反應時間，提高鑒別效率，為實現藥材分子鑒別的現場運用提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料﹑儀器與試劑

表1 樣品材料信息表

1.1.2 儀器 GeneAmp 9700型PCR擴增儀(Applied Biosystem公司)；TC-512梯度PCR儀(TECHNE公司)；VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀(Applied Biosystems公司)；5810 R 型高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；VORTEX-2 GENIE漩渦震蕩儀(Scientific industries 公司)；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠)；HE99X-15-1.5型電泳槽(Hoefer公司)；SYNGENE凝膠成像系統(GENE公司)；ZF-7A型手持式紫外燈(上海谷村電子光學儀器廠)。

1.1.3 試劑 瓊脂糖(Promega公司)；溴化乙啶(Fluka公司)；EXTaqDNA聚合酶、SpeedStar HSTaqDNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；10 000× SYBR Green I(Invitrogen公司)；其他試劑均為國產分析純。

1.2基因組總DNA的提取及PCR擴增、測序 取適量的樣品(約0.03 g)，研磨成細粉后，采用改良的CTAB法提取總DNA，獲得的DNA于-20 ℃保存備用。選擇通用引物trnL-trnF對木通、川木通和關木通樣品進行擴增，反應程序見表2。反應體系總體積為20 μL，包括10×buffer緩沖液2 μL，dNTP 1.6 μL，引物各0.5 μL，EXTaq0.2 μL，DNA 0.5 μL，滅菌蒸餾水14.7 μL。PCR反應條件見表2。反應結束后在PCR體系中加入5 μL 6×loading buffer，混勻后于EB染色的1.5 %濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統觀察、成像。選擇陽性PCR產物樣品進行雙向測序。

1.3 基于葉綠體序列的木通、川木通及關木通鑒別引物設計

將測序所得序列去除引物序列，去除引物后的序列使用BioEdit分析軟件進行分析、校對處理后，找出具有穩定差異的變異位點，進而篩選出木通、川木通及關木通的特有變異位點，根據Newton等建立的擴增阻滯突變系統原理[14]，主要是由于DNA聚合酶缺乏3′-5′外切酶活性，引物的3′末端堿基不能與靶DNA正確互補配對，那么靶DNA就不能被有效地擴增，因此，依據此原理及設計引物原則，利用Primer premier 5 軟件根據每種藥材特有的變異位點設計3對位點特異PCR引物，設計的3對特異引物MT-F1/R1、CMT-F1/R1、GMT-F1/R1擴增后片段大小分別為456、479、463 bp，引物序列見表2。

1.4 PCR擴增條件的確定

取樣品DNA用于確定快速PCR反應條件。20 μL PCR反應體系，2.0 μL 10×buffer緩沖液，1.6 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，0.5 μL上游及下游引物(5 μmmol·L-1)，0.5 μL鑒別引物F2(5 μmol·L-1)，0.2 μL SpeedStar HSTaqDNA聚合酶(Takara公司)，0.5 μL模板DNA，14.7 μL無菌雙蒸水。PCR反應在GeneAmp 9700型PCR擴增儀上進行，初始反應程序見表2。反應結束后取PCR反應產物5 μL，加入2 μL 6× Loading buffer (Takara 公司) 混勻后于EB染色的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統觀察、成像。

表2 實驗中的引物及反應條件

1.5 條件優化

在學科促進方面，他舉例，比如甲狀腺手術，由于初診等因素的影響，這項手術在普外科、耳鼻咽喉頭頸外科、甲狀腺?？凭虚_展，而病種數據分析則能從效率、質量、效益等方面直觀反映出各科開展情況的差異，“如果某一個科室開展這項手術，各方面都不占優勢，那理應考慮轉攻別的方面，夯實學科優勢?！狈鈬硎?，正是通過這樣的精細化分析，實現病種結構、成本結構的“騰籠換鳥”，真正凸顯三甲綜合醫院的功能定位，將常見病、多發病分流到基層醫療機構。

分別利用木通、川木通及關木通特異性鑒別引物對 MT-F1/R1、CMT-F1/R1、GMT-F1/R1進行PCR反應，并考察：①退火溫度：52、54、56、58、60 ℃；②PCR循環數：30、28、26、24、22個循環；③變性溫度：94、92、90、88 ℃；④變性和退火時間：20、10、5、3、1 s；⑤不同PCR儀：9700型PCR儀(ABI公司)，VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀(Applied Biosystems公司)，TC-512型PCR儀(TECHNE公司)。

1.6 PCR產物檢測

在PCR擴增產物中加入1 μL 100× SYBR Green I于365 nm紫外波長下檢測熒光，出現綠色熒光則表明存在陽性擴增產物。

2 結果分析

2.1 鑒別引物設計及驗證

選擇通用引物trnL-trnF對木通、川木通及關木通樣品進行PCR擴增，然后通過Clustal W軟件進行序列比對，根據其變異區設計3對特異引物。利用位點特異性PCR方法對特異引物進行驗證，PCR結果發現通過利用木通位點特異PCR引物對木通、川木通及關木通進行擴增，木通可以擴增出一條帶，而川木通及關木通則擴增不出條帶。使用川木通位點特異PCR引物，川木通可以擴增出一條帶，而木通及關木通則擴增不出條帶。使用關木通位點特異PCR引物，關木通可以擴增出一條帶，而木通及川木通則擴增不出條帶。結果表明設計的3對特異引物可以用作木通、川木通及關木通之間的鑒別引物。

2.2 快速PCR反應條件的優化

由于Yap等研究表明，低溫預變性(92 ℃ 1 min)即可實現PCR有效擴增[9]，且本課題組前期證實94 ℃預變性1 min可以實現PCR產物的有效擴增[12-13]，因此本文把PCR初始程序設計為94 ℃預變性1 min，從94 ℃變性開始，兩步法，30個循環，并開展PCR反應條件的優化。在此基礎上進一步依次對PCR反應過程中退火溫度、PCR循環數、變性溫度、變性和退火時間5個因素進行優化，并分析了不同的PCR儀對改良后PCR反應穩定性的影響。

2.2.1 木通特異引物快速PCR條件優化 凝膠電泳結果表明，對于木通特異引物，退火溫度分別為54、56、58、60 ℃時，木通樣品均能夠擴增出目的條帶，但由于60 ℃時條帶較弱，因此選擇58 ℃為最適退火溫度；退火最適時間為10 s。大于26個循環時，木通樣品均出現明顯條帶，但26個循環時條帶較弱，因此選擇28個循環為最適循環數。當變性溫度高于88 ℃時，木通能夠擴增出明顯條帶，而川木通和關木通則均不能擴增出條帶，因此選擇88 ℃為最適變性溫度。變性時間在5 s和3 s時木通樣品均有條帶，3 s時條帶亮度明顯減弱，因此選擇5 s為最適變性時間(見表3)。

2.2.2 川木通特異引物快速PCR條件優化 對于川木通特異引物，退火溫度分別為54、56、58、60 ℃時，川木通樣品均能夠擴增出目的條帶，但由于60 ℃時條帶較弱，因此選擇了58 ℃為最適退火溫度；最適退火時間為5 s。大于24個循環時，川木通樣品均出現明顯條帶，但24個循環時條帶較弱，因此選擇26個循環為最適循環數。當變性溫度高于88 ℃時，川木通能夠擴增出明顯條帶，而木通和關木通則均不能擴增出條帶，因此選擇88 ℃為最適變性溫度。變性時間在5 s和3 s時川木通樣品均有條帶，3 s時條帶亮度明顯減弱，因此選擇5 s為最適變性時間(見表3)。

2.2.3 關木通特異引物快速PCR條件優化 對于關木通特異引物，退火溫度分別為54、56、58、60 ℃時，關木通樣品均能夠擴增出目的條帶，但由于58 ℃時條帶最亮，因此選擇了58 ℃為最適退火溫度；最適退火時間為10 s。大于26個循環時，關木通樣品均能夠擴增出條帶，但26個循環時關木通條帶較弱，因此選擇28個循環為最適循環數。當變性溫度高于88 ℃時，關木通能夠擴增出明顯條帶，而木通和川木通則均不能擴增出條帶，因此選擇88 ℃為最適變性溫度。變性時間在5 s和3 s時關木通樣品均有條帶，3 s時條帶亮度明顯減弱，因此選擇5 s為最適變性時間(見表3)。

綜合以上優化結果可以得出，木通、川木通及關木通快速PCR反應的反應參數基本相同，因此，為了能夠在同一時間、同一臺PCR儀中完成PCR擴增過程，達到快速檢測的目的，本實驗最終確定的木通、川木通及關木通快速PCR反應的反應參數均為88 ℃預變性1 min后，88 ℃ 5 s，58 ℃ 10 s，28個循環，并對該反應條件使用不同PCR儀對木通、川木通及關木通樣品進行快速PCR擴增，結果表明：最終優化得到的木通、川木通及關木通快速PCR反應反應參數使用GeneAmp 9700型PCR擴增儀、VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀、TC-512梯度PCR儀擴增、電泳檢測后均可獲得樣品的特異性目的條帶，其中木通特異性引物PCR擴增結果見圖1A，川木通特異性引物PCR擴增結果見圖1B，關木通特異性引物PCR擴增結果見圖1C。

2.3 快速PCR反應熒光檢測

分別選擇優化的木通、川木通及關木通快速PCR反應參數，在確保3種藥材的所有樣品DNA均無降解情況下，對3種藥材進行快速PCR擴增，在擴增產物中加入1 μL 100× SYBR Green I，在365 nm紫外波長下進行熒光檢測。結果表明，使用木通特異鑒別引物擴增，所有木通樣品顯示出明亮綠色熒光，而川木通、關木通均不發出熒光；使用川木通特異鑒別引物擴增，川木通樣品顯示出明亮綠色熒光，而木通、關木通均不發出熒光，同樣，使用關木通特異鑒別引物擴增，關木通樣品顯示出明亮綠色熒光，而木通、川木通均不發出熒光，見圖2。

表3 PCR條件優化

注：+表示亮帶，△表示暗帶，-表示無帶。

注：A.木通快速PCR產物凝膠電泳及熒光檢測結果，M.DL 2000 Marker，1.陰性對照，2.三葉木通(湖南衡東)，3.三葉木通(湖南臨澧)，4.三葉木通(重慶梁平)，5.三葉木通(甘肅徽縣)，6.木通(重慶萬州)，7.木通(安徽含山)，8.木通(重慶彭水)，9.木通(安徽鳳陽)，10.木通(安徽梅山)，11.白木通(重慶黔江)，12～14.白木通(湖南株洲)，15～18.白木通(湖南慈利)；B.川木通快速PCR產物凝膠電泳及熒光檢測結果，M.DL 2000 Marker，1.陰性對照，2.川木通(重慶綦江)，3.川木通(重慶南川)，4.川木通(重慶江津)，5.川木通(重慶石柱)，6.川木通(重慶渾平)，7.川木通(重慶黔江區)；C.關木通快速PCR產物凝膠電泳及熒光檢測結果，M.DL 2000 Marker，1.陰性對照，2～6.東北馬兜鈴(吉林撫松)，7～11.東北馬兜鈴(吉林靖宇)。圖1 木通、川木通及關木通快速PCR產物凝膠電泳及熒光檢測結果

注：1.木通，2.三葉木通，3.白木通，4.川木通，5.東北馬兜鈴，6.陰性對照。圖2 木通、川木通及關木通快速PCR熒光檢測結果

3 討論

本實驗主要針對木通、川木通及關木通3種藥材，建立快速PCR鑒別方法，經DNA提取、PCR擴增、熒光檢測3個步驟，在同一臺PCR儀內可同一時間完成3種藥材真實性快速鑒別，有利于實現中藥材分子鑒別的現場運用。針對木通、川木通及關木通三者之間的快速鑒別，本文建立的位點特異性PCR方法，具有易于檢測且快速的特點，相比劉美子等使用的DNA條形碼鑒定方法而言[4]，該方法無需測序，通過凝膠電泳膠圖可直接、快速地反應出檢測結果。而使用熒光染色快速檢測技術，則無需凝膠電泳檢測，通過加入熒光染料在紫外燈下觀察是否有熒光便可快速鑒別藥材真偽，因此，將傳統的凝膠電泳檢測結果方法改為熒光染料快速染色的方法，可最終縮短檢測時間，提高檢測效率[15]，該鑒別方法對于木通、川木通及關木通3種藥材之間的鑒別顯示出較大的優勢。

經典PCR鑒定技術雖然擁有準確、專屬性強、重現性好等特點，但由于其自身操作相對復雜、單次反應耗時較長，難以用于中藥材現場鑒別。常規PCR反應時間大約為2～3 h，而本文采用的2步法快速PCR技術，即預變性與變性同一溫度，退火與延伸同一溫度，因此要求特異引物的Tm值盡可能接近常規PCR延伸溫度72 ℃，2步反應的溫度值相差越小，則PCR反應越短，檢測時間越短。同時，可在確保PCR反應靈敏度和特異性的前提下，盡可能大地縮短PCR過程中變性、退火和延伸時間，提高檢測效率。目前快速PCR方法已在一些臨床檢驗和司法檢測中得到廣泛應用[16-21]。因此，快速PCR技術可以通過對經典PCR反應進行條件優化，結合熒光檢測技術，操作簡單、檢測結果準確，在中藥材的鑒定中具有很強優勢，也適用于中藥材快速檢測試劑盒的開發，有助于實現中藥材現場準確、快速鑒定。

然而，傳統鑒別藥材真偽或質量評價的檢測方法大多較為單一。近來，Wu等研究通過將DNA 條形碼、實時熒光定量PCR及UHPLC-HR-MS 3種檢測方法相結合，分析了來自46個物種的158份馬兜鈴科樣品和來自33個物種的131份容易與馬兜鈴科物種混淆的樣品，證實來自馬兜鈴科的大多數樣本中都含有有毒的馬兜鈴酸[22]。此次研究者提出的整合鑒定系統可以為中草藥產品提供高效可靠的檢測系統，值得今后中藥鑒定學者們的借鑒。同時，在此基礎上，如何達到中藥材的現場準確、快速鑒定，今后仍有待進一步研究。

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AuthenticationofMutong，Chuan-MutongandGuan-MutongbyRapidPCR

CUI Zhanhu1，YUANYuan2*，HUJun2

(1.NanyangFirstPeople'sHospital，Nanyang473010，China；2.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbsBreedingBase，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：To establish an accurate，rapid and efficient method for authenticating Mutong，Chuan-Mutong and Guan-Mutong by using PCR amplification of specific alleles.Methods：The samples of Mutong，Chuan-Mutong and Guan-Mutong were collected.The total DNA of the samples has been extracted，andtrnL-trnFsequence from Mutong，Chuan-Mutong and Guan-Mutong was amplified by PCR and sequenced directionally.These sequences were aligned by using Clustal W.specific primers were designed and amplified by two-steps PCR amplification method.Results：The rapid PCR methods for authenticating Mutong，Chuan-Mutong and Guan-Mutong were established by optimizing the denatured and annealing temperature，cycle numbers，and etc.When 100×SYBR Green I was added in the PCR product，strong green fluorescence was visualized under 365 nm UV lamp whereas adulterants without.Conclusion：The results indicated that the rapid PCR method can identify Mutong，Chuan-Mutong and Guan-Mutong rapidly.This study provides the technical support for authentication of Chinese medicinal materials.

Rapid PCR；Akebiae Caulis；molecular authentication；fluorescence

2016-05-23)

中醫藥行業專項(201407003)

*

袁媛，副研究員，研究方向：中藥功能基因組及中藥分子鑒定；Tel：(010)64014411-2847，E-mail：y_yuan0732@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.006