茶葉發酵蒸餾酒生產工藝優化及揮發性成分分析

陳琳琳，胡寶東，邱樹毅，羅小葉，王曉丹，3*

（1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

茶葉發酵蒸餾酒生產工藝優化及揮發性成分分析

陳琳琳1，2，胡寶東1，2，邱樹毅1，2，羅小葉1，2，王曉丹1，2，3*

（1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

選用大葉綠茶為發酵用茶，蔗糖為發酵用糖，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）為發酵酵母，研制茶蒸餾酒。結果表明，茶蒸餾酒的最佳工藝條件為酒茶水比1∶20（g∶mL），浸泡時間20 min，保持微沸，酵母接種量8%，蔗糖添加量200 g/L。發酵原液酒精度為10.44%vol，還原糖含量為（7.69±0.04）g/L，蒸餾之后酒精度為（40±1）%vol。氣質聯用（GC-MS）法共鑒定出茶蒸餾酒中香氣組分27個，其中酯類及醇類物質的相對含量分別為58.93%及34.60%。此條件下生產的茶蒸餾酒，質量指標滿足相關國標要求。

茶酒；發酵；工藝條件；揮發性成分；蒸餾

茶葉起源于我國，根據茶葉制法和品質的不同，參照習慣上的分類，將茶分為綠茶、黃茶、黑茶、白茶、青茶、紅茶六大類［1］。茶葉制成的飲品作為世界三大天然飲料之一，是公認的健康食品。據國際茶葉委員會統計數據，2014年世界茶葉總量502.6 t，其中，中國茶葉產量198萬t，位居首位。茶葉中含有豐富的營養成分，將近500種［2］。主要有茶多酚、氨基酸、生物堿、碳水化合物、色素、酶類、維生素、芳香物質等［3］，而構成上述這些營養成分的基本元素多達50余種［4］，其中含有人體必需的14種微量元素［5］。茶不僅可以除污除異味［6］、醒腦提神［7］，更是有助于提高人體免疫力、降低膽固醇、抑制心血管疾病、預防和抗癌［8-11］等功效。

廣西地跨南亞熱帶和中亞熱帶，是祖國最南部茶區之一，有著優越的自然氣候、環境條件與區位優勢［12］。由于環境高溫多濕，其夏秋季節茶葉葉片生產過快，形成大葉茶。廣西大葉茶因苦澀味較重，品質差，其傳統的飲茶方式缺少市場競爭力，對茶葉進行加工，制成茶飲料、速溶茶、茶酒或是制成超細微茶粉等，將是大葉茶的發展方向。茶酒是以茶為主料釀制或配制而成的各種飲用酒的統稱［13］，按加工工藝主要可分為三類：汽酒型、調配型和發酵型［14］?，F在國內外已開發了茶汽酒、茶啤酒、綠茶酒以及烏龍茶酒等產品，但是上市量并不多，品種較少。國外對茶酒的研究主要以日本居多，靜岡縣茶葉試驗場研制出紅茶酒、烏龍茶酒、花茶酒和綠茶酒等品種［15-17］。韓國成功利用濃茶發酵，研制出綠茶酒。英美等國家主要開發應用配制酒，例如滋補茶酒混飲、果味茶酒、茶酒冷混飲、朗姆茶酒熱混飲、白蘭地茶酒混飲等。國內邱新平等［18］研究了茶酒發酵工藝、澄清劑、穩定劑、兒茶素組分變化和茶酒香氣成分分析。目前市場上以調配型茶酒居多，即用白酒或食用酒精浸泡茶葉而制得，但其香氣和口感遠不如發酵型。本研究在發酵型茶酒的基礎上，對發酵好的茶汁進行蒸餾，成為一種新型的蒸餾酒。茶酒既有茶葉獨特的香味，又能融合酒的特點。

本實驗研究茶葉發酵蒸餾酒的制備，對其生產工藝條件優化，并采用氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法測定茶葉發酵蒸餾酒的揮發性香氣成分。提高了大葉茶的利用價值，開發了一種新型的蒸餾酒，為蒸餾酒的發展開拓了思路。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大葉綠茶、大葉白茶：廣西百色市凌云縣；紅茶、黃糖、赤砂糖、白砂糖：市售；粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）（CICC編號：1360）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（CICC編號：1355）：中國工業微生物菌種保藏中心；扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）：貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室選育酵母（編號：FBKL 2.0229）；麥芽汁培養基：上海博微生物科技有限公司。

1.2儀器與設備

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋、101-1AB電熱鼓風干燥箱、SPX-250B-Z生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；FA2004N電子天平：上海菁海儀器有限公司；Sw-CJ-1F型凈化工作臺：蘇州凈化設備廠；ZHWY-111B落地普通大容量恒溫培養振蕩器：金壇市文化儀器有限公司；C21-SK2105多功能電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司；JH-11-11可見光分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；7890A/5975C氣相色譜質譜聯用儀：美國安捷倫公司。1.3方法

1.3.1茶酒加工工藝流程

操作要點：將茶葉25 g、沸水1 000 mL和紅糖200 g加入鍋中，在電磁爐上小功率加熱（保持微沸）15 min，待發酵液冷卻至室溫，按體積分數8%的接種量接入粟酒裂殖酵母，裝入2 L三角瓶，28℃恒溫培養。前2 d用六層紗布封口，為酵母生長提供氧氣，第3天換用加單向排氣閥的橡膠塞封口，絕對厭氧進行酒精發酵。待發酵液不產氣泡，并測定發酵液殘糖含量＜20 g/L或殘糖含量基本不變時，結束發酵。將發酵液以蒸餾法去除樣品中的不揮發性物質，并收集蒸餾液得茶酒，控制酒精度（40±1）%vol。

1.3.2酵母的活化

酵母均為試管保藏酵母，按麥芽汁培養基使用方法配成酵母液態培養基，121℃滅菌20 min，冷卻接入酵母，控制轉數160～170 r/min，28℃搖瓶培養48 h，并用血球計數板計數，調整酵母濃度為5.0～6.0×108個/mL。

1.3.3檢測分析方法

酒精度的測定：密度計法［19］；還原糖的測定：直接滴定法；茶多酚的測定：GB/T 21733—2008《茶飲料》中的檢測方法；總酸、總酯的測定：GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中檢測方法；茶酒感官評定［18，20］：包括外觀、香氣、口感和整體風格，茶酒感官評分（滿分100分）標準見表1。

表1　茶酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of tea liquor

1.3.4茶酒揮發性成分分析

茶酒揮發性成分分析采用氣質聯用儀進行測定。

（1）茶酒揮發性成分分析樣品前處理

取樣品5 mL置于15 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm、50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在60℃左右頂空萃取40 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口中，熱解析5 min進樣。

（2）色譜條件

氣相色譜條件：色譜柱DB-CP97723A（50 m×0.25 mm× 0.20 μm）；采用程序升溫模式，起始溫度為40℃，保持5 min，以5℃/min升至200℃，保持10 min；進樣口溫度250℃；以氦氣（純度99.99%）為載氣，流速1 mL/min，不分流進樣。

質譜條件：接口溫度為200℃；離子源溫度為200℃；電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；電離能量為70 eV；發射電流為200 μA；掃描范圍50～550 amu。

（3）定性定量方法

定性分析：由GC-MS分析得到的質譜數據運用計算機譜庫在（NIST/WILEY）進行初步檢索，各香氣物質成分的質譜經計算機譜庫檢索，再結合相關報道文獻解析譜圖，確定香氣物質。

定量分析：采用面積歸一化法。

2　結果與分析

2.1原料的選擇

2.1.1茶葉的選擇

選用大葉綠茶、大葉白茶、紅茶分別作為茶蒸餾酒樣品1、2、3所用茶葉，分別將茶葉25 g、沸水1 000 mL和紅糖200g加入鍋中，在電磁爐上小功率加熱（保持微沸）15 min，待發酵液冷卻至室溫，按體積分數8%的接種量接入粟酒裂殖酵母，裝入2 L三角瓶，28℃恒溫培養。結束發酵，將發酵液以蒸餾法去除樣品中的不揮發性物質，并收集蒸餾液得茶蒸餾酒，控制酒精度（40±1）%vol，不同茶葉原料對茶蒸餾酒發酵的影響結果見表2。

表2　不同茶葉對茶酒發酵影響Table 2 Effect of different tea on fermentation of tea liquor

由表2可知，茶蒸餾酒樣品1感官評定結果略高于樣品2，但均明顯高于樣品3。其中3種茶葉制得的茶蒸餾酒樣品，外觀沒差異，但香氣有很大的不同，樣品1所用茶葉為大葉綠茶，茶香味具有綠茶原有的清新；樣品2所用茶葉為大葉白茶，制出來的茶蒸餾酒有白茶獨特的茶味；樣品3所用茶葉為紅茶，其香氣為紅茶特有香味。結果表明，大葉綠茶制出的茶酒香氣最好，更讓人感覺愉悅，白茶其次，紅茶香味最差。從產酒精來說，樣品2較樣品1稍高，樣品3產酒精較低。其中樣品3產酒精度底，說明樣品3的茶湯不適合酵母生長及產酒精，不能為酵母提供一個較好發酵環境，因此樣品3所用茶葉不適合制作茶酒。雖然樣品2產酒精稍高，但其制出的茶酒，香氣風格不及樣品1。因此選用大葉綠茶為茶蒸餾酒發酵用茶。

2.1.2酵母的選擇

選定大葉綠茶為茶原料，將茶葉25 g、沸水1 000 mL和紅糖200 g加入鍋中，在電磁爐上小功率加熱（保持微沸）15 min，待發酵液冷卻至室溫，分別選用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）為樣品1、2、3所用酵母，接種量均為8%，裝入2 L三角瓶，28℃恒溫培養。結束發酵，將發酵液以蒸餾法去除樣品中的不揮發性物質，并收集蒸餾液得茶蒸餾酒，控制酒精度（40±1）%vol，同酵母菌對茶蒸餾酒發酵的影響結果見表3。

表3　不同酵母對茶酒發酵的影響Table 3 Effect of different yeasts on fermentation of tea liquor

由表3可知，3種酵母制的茶蒸餾酒感官評定結果差異較小，其中樣品1稍高，就酒精度來說，樣品2＞樣品1＞樣品3，從還原糖含量上看，進一步說明樣品2、樣品1所用酵母糖利用率較高，更能有效地利用發酵用糖產酒精。但樣品2發酵成的茶蒸餾酒香氣類似啤酒味，回味短，因此選用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）為茶蒸餾酒發酵酵母。

2.1.3發酵用糖的選擇

選定大葉綠茶為茶原料，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）為所用酵母，分別選用黃糖、赤砂糖、蔗糖為樣品1、2、3所用發酵用糖。將茶葉25g、沸水1000mL和糖200 g加入鍋中，將在電磁爐上小功率加熱（保持微沸）15 min，待發酵液冷卻至室溫，接入酵母菌（8%），裝入2 L三角瓶，28℃恒溫培養。結束發酵，將發酵液以蒸餾法去除樣品中的不揮發性物質，并收集蒸餾液得茶蒸餾酒，控制酒精度（40±1）%vol，不同發酵用糖對茶蒸餾酒發酵的影響結果見表4。

表4　不同糖對茶酒發酵的影響Table 4 Effect of different sugar on fermentation of tea liquor

由表4可知，樣品1與樣品3感官評定結果相差很小，但均高于樣品2，說明樣品1、樣品3所用蔗糖較適合制作茶酒。從酒精度來看，樣品3＞樣品2＞樣品1，因此選用蔗糖作為發酵用糖。

2.2發酵工藝參數的確定

2.2.1茶葉形狀及浸泡溫度的確定

將大葉綠茶進行粉碎，過10目篩子得大葉綠茶粉碎葉。稱取大葉綠茶整葉和粉碎葉各5.00 g，分別加入100 mL溫度為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃中，浸泡15 min，對茶湯進行茶多酚含量測定。

圖1　不同茶葉形狀及浸泡溫度對茶湯質量的影響Fig.1 Effect of different tea shapes and soaking temperature on tea quality

由圖1可知，茶湯中茶多酚含量隨溫度的升高而增加，100℃時及煮沸時，茶湯中茶多酚含量最高。并且不經粉碎的茶葉茶湯中，在相同溫度下沒有經粉碎后的茶葉茶多酚含量高。因此選用浸泡溫度100℃進行粉碎后的茶葉浸泡。

2.2.2浸泡時間的確定

將粉碎過的茶葉5.00g，加入100mL溫度為100℃水中，分別浸泡（保持微沸）5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，對茶湯進行茶多酚含量測定，結果見圖2。

圖2　浸泡時間對茶湯質量的影響Fig.2 Effect of soaking time on tea quality

由圖2可知，茶湯中茶多酚含量隨浸泡時間的增加呈上升趨勢。當浸泡時間從15 min增至20 min時，能明顯提高茶湯中的茶多酚含量，但當浸泡時間從20 min增至25 min時，茶湯中的茶多酚含量沒有明顯提高，即以增加浸泡時間來提高茶湯中的茶多酚含量意義不大，因此選定浸泡時間為20 min。

2.2.3茶水比的確定

選用上述確定的茶湯的處理工藝，即大葉綠茶粉碎葉、浸泡溫度100℃、浸泡時間20 min，使較多茶多酚融入茶湯中。分別控制茶水比1∶10、1∶20、1∶40、1∶80（g∶mL），并以不加茶湯作為空白對照，蔗糖添加量200 g/L，接種量8%，置于28℃恒溫培養箱中發酵7 d，發酵結束后，其酒精度和還原糖含量測定結果見圖3。

圖3　茶水比對發酵情況的影響Fig.3 Effect of tea-water ratio on fermentation condition

由圖3可知，隨著茶水比例的增加，酵母對糖的轉化效率是先增加后降低?？瞻字兄患诱崽?，其糖轉化率很低，1∶20、1∶40、1∶80（g∶mL）的茶水比中糖轉化率較高，說明茶湯有利于酵母的生長及轉化酒精，在僅有碳源的糖水里，酵母不能很好的產酒精，而l∶10（g∶mL）的茶水比由于溶液濃度過高，使酵母的生長及轉化酒精受到了抑制，酒精產量較低。其中茶水比為1∶40（g∶mL）酒精度最高，還原糖含量最少，但其原酒茶香偏淡，茶水比＞1∶40（g∶mL）茶味更淡，因此1∶20（g∶mL）茶水比為最佳比例。

2.2.4接種量的確定

控制茶水比1∶20（g∶mL），茶葉為大葉綠茶粉碎葉，蔗糖添加量200 g/L，分別接入體積分數2%、4%、6%、8%、10%的粟酒裂殖酵母，置于28℃恒溫培養箱中發酵7 d，發酵結束后，其酒精度和還原糖含量測定結果見圖4。

圖4　接種量對發酵情況的影響Fig.4 Effect of inoculum on fermentation condition

由圖4可知，接種量為2%時，酒精度很低，還原糖含量較高。隨著接種量的增加，酒精度升高，還原糖含量減少。在實驗過程中接種量越大，發酵速率越大，所以當接種量太大，發酵時間較短，茶酒的風味物質不易形成。因此，選擇最佳的接種量為8%。

2.2.5蔗糖添加量的確定

控制茶水比為1∶20（g∶mL），茶葉為大葉綠茶粉碎葉，分別添加蔗糖140 g/L、160 g/L、180 g/L、200 g/L、220 g/L，酵母接種量8%，置于28℃恒溫培養箱中發酵7 d，發酵結束后，其酒精度和還原糖含量測定結果見圖5。

圖5　蔗糖添加量對發酵情況的影響Fig.5 Effect of sugar addition on fermentation condition

由圖5可知，發酵體系中初始蔗糖添加量的越大，酒精度越高，蔗糖能充分被酵母利用轉化為酒精。蔗糖的添加量達到200 g/L時，酒精度為10.44%vol；蔗糖的添加量達到220 g/L時，酒精度為10.74%vol，但蔗糖的利用率反而下降，使發酵原液的還原糖含量增多。這是因為發酵液初始蔗糖濃度較高，酵母生長受到抑制，糖原料不能有效利用。因此，確定最佳蔗糖添加量為200 g/L。

2.3蒸餾酒茶酒質量分析

將蒸餾出的茶酒進行檢測茶酒質量分析結果見表5。由表5可知，茶蒸餾酒的感官質量、理化指標及衛生指標滿足國標GB 2757—2012《食品安全國家標準蒸餾酒及其配制酒》的要求。

表5　蒸餾酒茶酒質量指標Table 5 Indexes of the tea liquor quality

2.4蒸餾酒茶酒揮發性成分分析

茶酒經過GC-MS分析，各組分質譜數據入數據庫進行分析檢索。初步鑒定出茶酒中各主要香氣組分27個，其GC-MS分析的總離子流色譜圖見圖6，茶酒主要揮發性成份相對含量見表6。

由表6可知，茶酒的揮發性成分主要是酯類、醇類等，其相對含量較高。酯類化合物是白酒中最多的揮發性香成分，并且由于乙醇含量較高，乙酯所占的比例會較高。茶酒的揮發性成分中，酯類化合物總體含量達到58.931%，其中相對含量較高的有己酸乙酯（4.337%）、辛酸乙酯（19.699%）、癸酸乙酯（26.789%）、月桂酸乙酯（5.567%）等，以乙酯類居多。醇類是白酒的醇甜和助香劑的重要來源，茶酒的揮發性成分中除乙醇外，醇類化合物總體含量達到34.602%，其中相對含量較高的是正丙醇（7.279%）、3-甲基-1-丁醇（12.745%）、芳樟醇（3.139%）等。

圖6　茶蒸餾酒揮發性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of volatile components in tea fermented distilled liquor analysis by GC-MS

表6　茶蒸餾酒揮發性成分的GC-MS分析結果Table 6 Analysis results of volatile components in tea fermented distilled liquor by GC-MS

3　結論

本實驗選用大葉綠茶為發酵用茶，蔗糖為發酵用糖，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）為發酵酵母進行茶蒸餾酒研制，確定了茶酒的生產工藝為茶水比1∶20（g∶mL），浸泡時間20 min，保持微沸，酵母接種量8%，蔗糖添加量200 g/L。所得的茶酒色澤無色透明晶亮，酒香濃郁，茶香怡人，口感濃厚，茶味適中，風格完好，其酒精度（40±1）%vol，總酸0.09 g/L，總酯0.63 g/L。氣質聯用（GC-MS）法共鑒定出茶蒸餾酒中香氣組分27個，其中酯類及醇類物質的相對含量分別為58.931%及34.602%。此條件下生產的茶蒸餾酒，質量指標滿足相關國標要求。該產品是一種新型的蒸餾酒，兼具酒香和茶香，并且其生產工藝簡單、操作管理方便、適用于工業化生產，因此具有良好的開發前景。

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CHEN Linlin1，2，HU Baodong1，2，QIU Shuyi1，2，LUO Xiaoye1，2，WANG Xiaodan1，2，3*
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；3.College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Tea-distilled liquor was obtained by choosing large leaf tea，sucrose andSchizosaccharomyces pombeas fermented material.The results showed that the optimal processing conditions of tea-distilled liquor were as follows：tea and water ratio 1∶20（g∶ml），immersion time 20 min，immersion temperature 100℃，yeast inoculum 8%and sucrose addition 200 g/L.The alcohol content of fermentation liquid was 10.44%vol and reducing sugar content was（7.69±0.04）g/L.Alcohol content was up to（40±1）%vol after distillation.27 volatile components were identified by GC-MS from tea-distilled liquor，the relative content of esters and alcohols were 58.93%and 34.60%，respectively.Under these production conditions，the quality indicators of tea-distilled liquor met the relevant national standard.

tea liquor；fermentation；process conditions；volatile components；distillation

TS262.4

0254-5071（2016）06-0040-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.009

2016-03-17

貴州省重大專項項目（黔科合重大專項字［2013］6009號）；貴州省省校合作計劃項目（黔科合LH字［2014］7672）；貴州大學研究生創新基金資助（研理工2015042）

陳琳琳（1992-），女，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

王曉丹（1980-），實驗師，博士研究生，研究方向為應用生物技術。