金雀異黃素對肺泡Ⅱ型上皮細胞發生上皮-間質轉化的影響

王玲，劉輝國

武漢大學醫院，湖北 武漢 430071

金雀異黃素對肺泡Ⅱ型上皮細胞發生上皮-間質轉化的影響

王玲，劉輝國

武漢大學醫院，湖北 武漢 430071

目的觀察金雀異黃素對轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導人肺腺癌A549細胞發生上皮-間質轉化（EMT）的影響，探討其改善肺纖維化的作用機制。方法CCK-8法檢測不同濃度GEN和/或TGF-β1干預細胞72 h后的活性；RT-PCR檢測上皮及間質標記物的轉變以及在轉變過程中發揮關鍵調節作用的轉錄因子；Western blot檢測p38及JNK信號通路的變化。結果TGF-β1連續刺激A549細胞72 h可誘導其轉化為成纖維細胞表型，表現出更多間質標記物升高，內皮標記物降低；RT-PCR檢測結果顯示，金雀異黃素可呈濃度依賴性逆轉這種現象；Western blot檢測結果顯示，金雀異黃素與TGF-β1協同刺激A549細胞24 h可顯著抑制TGF-β1誘導p38及JNK信號通路的磷酸化水平。結論金雀異黃素可抑制TGF-β1誘導A549細胞發生EMT而發揮抗纖維化的作用。

金雀異黃素；上皮-間質轉化；A549；肺纖維化；轉化生長因子-β1

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種以進行性肺纖維化為主要臨床特點的疾病，其主要表現為肺間質成纖維細胞的大量聚集，破壞肺泡結構導致肺功能下降最終導致死亡。有研究表明，從IPF患者中分離出的成纖維細胞具有異質性，多種細胞如骨髓和肺泡上皮細胞在條件刺激下可轉變為成纖維細胞［1-2］。其中肺泡上皮細胞在轉化生長因子-β1（TGF-β1）刺激下發生上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而形成的成纖維細胞在IPF中占據一定比例，對肺纖維化的進展發揮重要作用，抑制EMT可顯著改善肺纖維化，繼而改善肺功能，但目前臨床尚缺乏特異性的抗纖維化治療藥物。

金雀異黃素（genistein，GEN）是一種存在于豆科植物和齒狀植物中的天然異黃酮化合物，體外實驗研究顯示，其具有抑制腫瘤細胞增殖的作用［3］。張氏等［4］研究顯示，GEN具有抑制大鼠成纖維樣滑膜細胞增殖的作用；顧氏等［5］研究顯示，GEN對 D-半乳糖損傷的乳鼠皮膚細胞成纖維細胞增殖亦具有抑制作用。但GEN是否影響肺纖維化中成纖維細胞的增殖以及EMT現象尚未見研究報道。因此，本實驗觀察GEN對肺泡Ⅱ型上皮細胞在 TGF-β1誘導下發生EMT的影響，探討其改善肺纖維化的作用機制，為進一步臨床治療肺纖維化提供可靠的實驗依據。

1　實驗材料

1.1藥物和細胞

GEN，上海融禾醫藥科技發展有限公司，純度≥98%，貨號446-72-0。A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞株，中國科學院上海細胞庫，細胞培養和干預刺激均在獨立的細胞房中進行，培養環境為37 ℃、5.0%CO2培養箱中。待細胞生長達次融合狀態時以0.25%胰蛋白酶消化，根據實驗需要接種于不同的培養皿中。分組誘導前以無血清培養基饑餓24 h，減少血清對刺激因素的影響，同時饑餓處理可使細胞同步化。

1.2主要試劑與儀器

高糖DMEM basic（1×）培養基、新生小牛血清（NBS）、胰酶，Gibco；TGF-β1，PEPROTECH公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學研究所；RT-PCR試劑盒，Roche；p-p38 MAPK、P38、p-JNK、JNK、GAPDH，Cell Signaling Technology公司。多功能微孔板檢測系統Synergy HT，美國BioTek公司；恒溫培養箱，日本 SANYO公司；紫外分光光度計 NANODROP 2000c，Thermo scientific；RT反轉錄儀器Veriti 96 well Thermal Lycler，Applied Biosystems公司；實時定量PCR儀Light Lycler 480，Roche公司；倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS。

2　實驗方法

2.1細胞處理和分組

待A549細胞貼壁融合達60%～70%時，棄去培養基，PBS清洗，加入饑餓液，置于溫箱4 h后置換為含 TGF-β1（10 ng/mL）饑餓液（DMEM+ 0.2%NBS），重新置于溫箱中培養，24 h換液1次，72 h后取出蛋白質和RNA樣本。實驗分為對照組、TGF-β1組、TGF-β1+GEN 1 μmol/L組、TGF-β1+ GEN 5 μmol/L組、TGF-β1+GEN 10 μmol/L組和GEN 10 μmol/L組。

2.2CCK-8法檢測

細胞被接種至96孔板中，每孔100 μL，接種密度大約在2×105個/mL，置于溫箱繼續培養24 h，將培養基更換為無血清的培養基饑餓24 h，采用不同處理因素干預72 h后，將96孔板培養基換為含有10 μL CCK-8的無血清培養基100 μL，繼續在溫箱中孵育2～2.5 h后于酶標儀波長450 nm處檢測。嚴格按照試劑說明進行操作。

2.3Western blot檢測

冰上裂解細胞10 min，置于1.5 mL離心管，超聲裂解儀5 kHz裂解10～15 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將上清液移至新的離心管，采用BCA定量法檢測蛋白濃度并將蛋白濃度調整一致后置于煮沸儀上將其變性。每組樣本混勻后取10 μL行10% SDS-PAGE凝膠電泳，檢測內參指標GAPDH，根據各個樣本的光密度（OD）值調整上樣劑量，使用調整后的上樣劑量再行凝膠電泳，使其GAPDH的OD值保持一致，后每組以校正后的上樣劑量進行凝膠電泳，將蛋白以100 V、90 min移至PVDF膜，用一抗封閉液（1.5 g牛血清白蛋白溶解于50 mL TBST中）封閉12 h，一抗包括p-p38、p38、p-JNK、JNK，然后用TBST（1 L TBS溶液+1 mL Tween20）洗膜3次，將其放入對應的加有二抗的二抗稀釋液（脫脂奶粉溶解于TBST緩沖液中配成2%～5%的液體）中避光孵育1 h，二抗為Alexa Fluor?488 goat anti- Rabbit IgG，再用 TBST洗滌 3次，檢測目的條帶，應用Odyssey圖像分析軟件檢測各組蛋白的OD值。

2.4RT-PCR檢測

細胞以不同因素處理后，棄去培養基，以Trizol法提取細胞總 RNA，采用紫外分光光度法測定其含量與純度。根據樣本所測濃度，取適當劑量將各個樣本濃度調整一致后反轉錄為cDNA。以GAPDH為內參照，采用20 μL體系進行PCR擴增。反應條件：94 ℃、2 min；1個循環，94 ℃、40 ；25～35個循環；50 ℃～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，1個循環。引物序列見表1。

表1　RT-PCR引物序列

3　統計學方法

4　結果

4.1金雀異黃素對A549細胞活性的影響

GEN干預72 h后，與對照組比較，GEN組、GEN 和TGF-β1的混合液組A549細胞不同濃度細胞的活性均無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

4.2金雀異黃素對轉化生長因子-β1誘導 A549細胞發生上皮-間質轉化的影響

與TGF-β1組比較，GEN組與TGF-β1協同刺激A549細胞 72 h可抑制間質標記物 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、Vimentin、Fibronectin的基因表達，促進E-cadherin的基因表達，呈濃度依賴性，見表3。對照組鏡下細胞連接緊密，相互黏附性較強，表現為鋪路石樣；TGF-β1刺激72 h后細胞間緊密連接消失，間隙變大，形態轉化為狹長形、紡錘形；TGF-β1與GEN（10 μmol/L）共同刺激72 h后，細胞形態又重新保持上皮細胞特有的形狀；單用GEN（10 μmol/L）刺激72 h細胞形態與對照組形態相似。見圖1。

表2　各組A549細胞不同濃度細胞活性比較（±s）

表2　各組A549細胞不同濃度細胞活性比較（±s）

組別　n　0 μmol/L　1 μmol/L　5 μmol/L　10 μmol/L GEN組　5　1.00±0.13　1.01±0.12　0.99±0.05　0.99±0.11 TGF-β1+GEN組　5　1.00±0.19　1.00±0.07　1.06±0.12　1.09±0.12對照組　5　1.00±0.00　1.00±0.00　1.00±0.00　1.00±0.00

表3　各組A549細胞上皮及間質標記物mRNA表達比較（±s）

表3　各組A549細胞上皮及間質標記物mRNA表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，##P＜0.01

組別　n　劑量/（μmol/L）　Collagen Ⅰ　Collagen Ⅲ　Vimentin　Fibronectin　E-cadherin對照組　9　1.00±0.09　1.00±0.10　1.00±0.10　1.00±0.07　1.00±0.08 TGF-β1　9　3.56±0.46**　3.21±0.45**　2.12±0.14**　3.42±0.32**　0.21±0.06**TGF-β1+GEN組　9　1　2.56±0.34##　2.75±0.43##　1.74±0.19##　2.69±0.29##　0.45±0.09##TGF-β1+GEN組　9　5　2.01±0.34##　1.96±0.18##　1.41±0.18##　2.11±0.16##　0.55±0.08##TGF-β1+GEN組　9　10　1.43±0.09##　1.45±0.18##　1.26±0.19##　1.36±0.11##　0.89±0.09##GEN組　9　10　1.03±0.07　1.05±0.09　1.04±0.05　1.07±0.07　0.99±0.05

圖1　各組A549細胞病理形態（×100）

4.3金雀異黃素對轉化生長因子-β1誘導的 A549細胞p38、JNK信號通路磷酸化水平的影響

GEN與TGF-β1協同刺激A549細胞24 h可顯著抑制TGF-β1誘導p38及JNK信號通路的磷酸化水平。結果見圖2、表4。

圖2　各組A549細胞蛋白表達免疫印跡電泳圖

表4　各組A549細胞p-p38、p-JNK蛋白表達比較（±s，OD值）

表4　各組A549細胞p-p38、p-JNK蛋白表達比較（±s，OD值）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，##P＜0.01

組別　n　劑量/（μmol/L）p-p38　p-JNK對照組　3　1.00±0.07　1.00±0.08 TGF-β1組　3　2.78±0.36**　2.10±0.24**TGF-β1+GEN組　3　10　1.66±0.19##　1.39±0.18##GEN組　3　10　1.04±0.07　0.99±0.05

4.4金雀異黃素對轉化生長因子-β1誘導 A549細胞轉錄因子snail1、snail2、twist1、twist2基因表達的影響

TGF-β1干預A549細胞24 h，snail1、snail2、 twist1、twist2基因表達較對照組明顯升高（P＜0.01）；GEN與TGF-β1協同作用則可顯著下調上述4種轉錄因子（P＜0.01）；GEN組對以上信號通路及轉錄因子則無明顯影響（P＞0.05）。結果見表5。

表5　各組A549細胞snail1、snail2、twist1、twist2 mRNA表達比較（±s）

表5　各組A549細胞snail1、snail2、twist1、twist2 mRNA表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，##P＜0.01

組別　n 劑量/（μmol/L）　snail1　snail2　twist1　twist2對照組　9　1.00±0.10　1.00±0.11　1.00±0.08　1.00±0.09 TGF-β1組　9　2.38±0.48**　2.11±0.35**　3.29±0.36**　1.92±0.37**TGF-β1+GEN組 9　10　1.41±0.18##　1.36±0.21##　1.89±0.25##　1.37±0.19##GEN組　9　10　1.03±0.03　1.04±0.02　0.98±0.08　0.99±0.13

5　討論

肺泡上皮細胞通過EMT機制轉化而來的成纖維細胞在肺纖維化中發揮著重要作用。本實驗結果顯示，TGF-β1連續刺激A549細胞72 h可誘導其轉化為成纖維細胞表型，表現出更多的間質標記物升高，而上皮標記物降低。RT-PCR檢測結果表明，GEN可呈濃度依賴性逆轉這種現象；Western blot檢測結果顯示，GEN與TGF-β1協同刺激A549細胞24 h可顯著抑制TGF-β1誘導p38及JNK信號通路的磷酸化水平。以上結果均提示GEN可抑制TGF-β1誘導的A549細胞發生EMT而發揮抗纖維化的作用。

近年來，隨著對人體器官纖維化研究的逐步深入，上皮細胞在某些病理情況發生的EMT現象也逐漸得到研究者的關注。上皮細胞在病理因素如TGF-β1的長期慢性刺激下可以失去其原有的極性，細胞間的緊密連接逐漸消失，最終獲得一定的遷移和游走能力，具有間質細胞的表型，對肺纖維化起到一定的促進作用，抑制 EMT則可顯著改善肺功能［6］。本實驗結果顯示，TGF-β1（10 ng/mL）連續刺激A549細胞72 h后，細胞形態由連接緊湊的鋪路石樣轉化為松散狹長的成纖維細胞形狀。RT-PCR檢測結果表明，間質標記物 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、Vimentin、Fibronectin表達均上調，而上皮細胞標記物E-cadherin表達則下調，由此可以判斷 TGF-β1可以誘導 A549細胞發生EMT，而TGF-β1與GEN同時干預A549細胞72 h則可呈濃度依賴性逆轉EMT，上調上皮細胞標記物，下調間質標記物。

無論是永生化的大鼠肺泡型上皮細胞；還是從大鼠分離、培養的肺泡Ⅱ型上皮細胞，以及人肺泡Ⅱ型上皮細胞均可通過TGF-β1誘導上皮細胞EMT，出現成肌纖維細胞的表型［7］。TGF-β1在肺纖維化EMT過程中發揮重要的調節作用。本研究檢測了p38及JNK信號通路以及其下游的靶分子的表達，包括 snail1、 snail2、twist1、twist2，結果發現，TGF-β1刺激A549細胞24 h可顯著升高p38及JNK信號通路的磷酸化水平，其下游靶分子snail1、snail2、twist1、twist2表達均上調，而TGF-β1與GEN聯合作用時，則可顯著降低p38及JNK信號通路的磷酸化水平以及抑制其下游的靶分子。因此，我們認為GEN可能通過抑制p38及JNK信號通路以及其下游的靶分子的表達抑制A549細胞發生EMT。

本研究結果表明，GEN可明顯抑制TGF-β1誘導的A549細胞發生EMT，為GEN的大體研究提供了實驗依據，但本研究未能闡明其具體的作用機制，這有待于進一步完善相關實驗。

［1］ KIM K K， KUGLER M C， WOLTERS P J， et al. Alveolar epithelial cell mesenchymal transition develops in vivo during pulmonary fibrosis and is regulated by the extracellular matrix［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（35）：13180-13185.

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Effects of Genistein on Epithelium-Mesenchyme Transition of Alveolar Type Ⅱ Cells

WANG Ling， LIU Hui-guo
（The Hospital of Wuhan University， Wuhan 430071， China）

Objective To investigate the effects of genistein on the epithelium-mesenchyme transition of alveolar type II cells； To discuss its mechanism of improving pulmonary fibrosis. Methods The activity of genistein with different concentrations and TGF-β1 intervention cells after 72 h were determined by CCK-8 method； epithelial and mesenchymal markers as well as the key regulatory factors in the transformation process were determined by RT-PCR； changes of p38 and JNK signaling pathways were determined by Western blot. Results The A549 cells were transformed into fibroblast phenotype stimulated by TGF-β1 for 72 h； mesenchymal markers increased and endothelial marker decreased. The results of RT-PCR indicated that genistein inhibited this phenomenon in a concentration-dependent manner. The results of Western blot showed that， genistein possibly inhibited the epithelial-mesenchymal transition through inhibiting the phosphorylation of p38 and JNK signaling pathways and its downstream transcription factors. Conclusion Genistein has anti-fibrosis effects through inhibiting A549 cells undergoing epithelial-mesenchymal transition.

genistein； epithelial-mesenchymal transition； A549； pulmonary fibrosis； TGF-β1

R285.5

A

1005-5304（2016）10-0063-04

2016-02-23；編輯：華強）

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.015