DFMG調節TLR-4抑制損傷內皮細胞對平滑肌細胞增殖和遷移促進作用

黃 荷，張 勇，楊舒婷，符曉華

（湖南師范大學醫學院心血管疾病研究室，長沙 410113）

DFMG調節TLR-4抑制損傷內皮細胞對平滑肌細胞增殖和遷移促進作用

黃 荷，張 勇，楊舒婷，符曉華

（湖南師范大學醫學院心血管疾病研究室，長沙 410113）

目的：觀察7 -二氟亞甲基- 5，4-二甲氧基異黃酮（DFMG）是否能干預損傷內皮細胞對平滑肌細胞增殖和遷移的促進作用，且其干預過程是否與TLR4信號通路相關。方法：采用CCK-8法和Transwell遷移法測定LPC誘導的內皮細胞的損傷對平滑肌細胞的增殖和遷移的影響。采用Western blot和熒光定量PCR測定損傷共培養體系中的內皮細胞TLR4在蛋白水平和基因水平的表達。運用TLR4特異性激動劑（LPS）和特異性的抑制劑（CLI095），采用CCK8法和Transwell遷移法測定損傷共培養體系中平滑肌細胞的增殖能力和遷移能力。結果：①隨著LPC濃度的增加，LPC誘導的內皮細胞損傷引起平滑肌細胞的增殖和遷移的效應增強，并且選取30 μM的LPC作用于內皮細胞并與平滑肌細胞共培養作為實驗的損傷共培養模型。②經光密度值分析，LPC組的內皮細胞TLR4的表達量是對照組的2倍；經熒光定量PCR分析，LPC組的內皮細胞TLR4的表達量是對照組的2.414倍。③相比，損傷組和LPS組的平滑肌細胞的增殖和遷移能力較對照組更強；相比，CLI095組和DFMG組的平滑肌細胞的增殖和遷移能力較損傷組更弱。結論：LPC誘導的內皮細胞的損傷可以引起平滑肌細胞的增殖和遷移，而DFMG可能是通過抑制TLR4信號阻礙損傷的內皮細胞對平滑肌細胞增殖和遷移的促進作用。

內皮細胞；平滑肌細胞；增殖；遷移；共培養；DFMG、TLR4

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種炎癥性疾?。?-3］，是心血管病中常見的最重要的病理過程。而血管內皮的損傷被認為是AS的“始發因素”。血管內皮損傷可引起血管壁通透性增加，減少NO、內皮素-1的分泌并促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移以及巨噬細胞活化成為泡沫細胞，進而引起AS［4-6］。研究表明，TLR4參與了動脈粥樣硬化的發生與發展［7-10］。7-二氟甲氧基-5，4’-二甲氧基金雀異黃素（7-difluoromethoxy-5，4’- dimethoxygenistein，DFMG），是本課題組自主合成的新型活性化學實體（專利申請號：2007101043894；公開號：CN 101225081A）［11］。前期試驗證實DFMG有抗動脈粥樣硬化的作用。那么，DFMG是否可能是通過抑制TLR4信號來拮抗損傷內皮細胞對平滑肌細胞增殖和遷移的促進作用？

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人血管內皮細胞（VECs）和人血管平滑肌細胞（VSMCs）由本實驗室保存；7-二氟甲氧基-5，4’-二甲氧基金雀異黃素，即DFMG，由本實驗室合成并保存；溶血性磷脂酰膽堿（LPC）購自美國Sigma公司；實時定量PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自中國唯贊公司；DAB顯影試劑盒購自以色列Bioind公司；TLR4一抗購自美國ABGENT公司；GAPDH一抗購自中國康為世紀公司；二抗購自中國康為世紀公司；Transwell共培養板購自美國康寧公司。

1.2 氧化損傷內皮細胞-平滑肌細胞共培養模型的制備 按照以下方法進行損傷共培養模型的建立。血管內皮細胞和血管平滑肌細胞分別稀釋成細胞懸液1× 105/mL。血管內皮細胞種于下室，并用LPC進行預處理。然后，平滑肌細胞種于上室。細胞之間內沒有直接的物理連接，但能通過分泌可溶性因子通過聚碳酸酯膜進行相互作用。其模型的最佳濃度用LPC設置的濃度梯度（0，10，20，30，40和50 μM）經統計學分析最終獲取。

1.3 CCK-8法檢測平滑肌細胞活力 血管內皮細胞生長至80%融合時，接種到Transwell下室，并與1 μM 的DFMG、1 μM的LPS或者1 μM的CLI095進行預孵育，再進行損傷共培養模型的建立。24h后進行CCK-8的測定。加 CCK-8之前更換新鮮培養基，去掉藥物的影響。每孔加入20 μL的CCK-8 試劑（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 O.D值的讀數）。將培養板在培養箱內孵育2小時后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。 最后根據O.D值計算細胞活力值。

1.4 Transwell遷移實驗測定平滑肌細胞的遷移能力

血管內皮細胞生長至80%融合時，接種到Transwell下室，并與1 μM的DFMG、1 μM的LPS或者1 μM的CLI095進行預孵育，再進行損傷共培養模型的建立。24 h后，取出Transwell小室（孔徑8 μm），棄去孔中培養液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當風干。0.1%結晶紫染色或者PI染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗3遍。隨機四個高倍視野計數。

1.5 Western blot實驗測定TLR4蛋白水平的表達30 μM 的LPC作用于內皮細胞，并與平滑肌細胞共培養，24小時收集內皮細胞的蛋白樣品，使用裂解液，反復凍融法提取蛋白。收集完蛋白樣品后，測定每個蛋白樣品的蛋白濃度（BCA法）。按照參考文獻資料配制SDS-PAGE凝膠。并在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）。100℃變性 10 min，每孔蛋白上樣量約為 50 μg。開始電泳。待溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，隨即轉膜并4℃ 封閉過夜。隨后，參照抗體說明書進行一抗（TLR4稀釋比例1∶1000；GAPDH稀釋比例1∶5000）和二抗（稀釋比例 1∶10000）的孵育。最后用ECL類試劑和顯影儀來檢測蛋白。結果用Image J軟件進行光密度值測定TLR4的相對表達量。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測TLR4 mRNA的表達情況 采用Trizol法提取內皮細胞的總RNA。提取完畢后，采用紫外吸收測定法，即取少量液體用TE稀釋（一般1∶100稀釋）后，讀取其在分光光度計260 nm和280 nm處的吸收值，可以測定RNA溶液濃度和純度。并按照中國唯贊公司提供的操作說明進行反轉錄聚合酶鏈反應（Reverse Transcription-PCR，RT-PCR），得到比較穩定的cDNA。然后，根據NCBI中公布的TLR4基因序列（NM_138554），使用DNAMAN軟件，設計擴增TLR4基因的引物，引物設計好后交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用PAGE純化。引物序列為：TLR4-UP：5'- CCGAGGCCATTATGCTATGT -3'；TLR4-DN：5'- TCCCTTCCTCCTTTTCCCTA -3'。按照中國唯贊公司提供的操作說明進行實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）。得到的數據用于計算TLR4 mRNA 的相對表達量（以GAPDH基因為內參照）。

1.7 統計學分析 實驗數據采用SPSS13.0 統計軟件對數據進行方差齊性檢驗、單因素方差分析的統計學分析。若方差齊，則使用SNK法進行多樣本之間的兩兩比較，若方差不齊，則使用Dunnett-t進行多樣本之間的兩兩比較。當P＜0.05則認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LPC誘導的內皮細胞的損傷促進平滑肌細胞的增殖 不同濃度的LPC（0，10，20，30，40和50 μm）作用于內皮細胞，并與平滑肌細胞共培養，24小時后收集平滑肌細胞，用CCK-8法測定平滑肌細胞的增殖，結果如圖所示（圖1）。由結果可知，從30 μm開始，隨著LPC濃度的增加，平滑肌細胞的增殖能力也增加。

圖1 損傷VECs對VSMCs增殖的影響

2.2 LPC誘導的內皮細胞的損傷促進平滑肌細胞的遷移

不同濃度的LPC（0，10，20，30，40和50 μm）作用于內皮細胞，并與平滑肌細胞共培養，24小時后收集平滑肌細胞，用PI染色，在熒光顯微鏡下計數遷移的細胞數，結果如圖所示（圖2）。由結果可知，從30 μm開始，隨著LPC濃度的增加，平滑肌細胞的增殖能力也增加。并且選取30 μm的LPC作用于內皮細胞并與平滑肌細胞共培養作為實驗的損傷共培養模型。

圖2 損傷VECs對VSMCs遷移的影響

根據LPC濃度分為六組：（A）Control組/0 μM組，（B）10 μM組，（C）20 μM組，（D）30 μ組，（E）40 μM組，（F）50 μM組；采用PI染色計數遷移的平滑肌細胞（200×）

2.3 損傷共培養模型中內皮細胞的TLR4的表達將30 μm 的LPC作用于內皮細胞后與平滑肌細胞共培養，作為本實驗的LPC組，而正常內皮細胞與平滑肌細胞共培養作為對照組。24小時后收集LPC組和對照組中的內皮細胞，提蛋白和RNA，Western Blot（圖3A）和實時熒光定量PCR（圖3B）的結果如圖所示。經光密度值分析結果可知，LPC組內皮細胞TLR4的表達量約為對照組的2.3倍；經實時定量PCR相對定量分析可知，LPC組內皮細胞TLR4的表達量約為對照組的2.4倍。

圖3（A） 損傷共培養體系中損傷VECs的TLR4蛋白水平的表達

圖3（B） 損傷共培養體系中損傷VECs的TLR4基因水平的表達

2.4 DFMG通過TLR4抑制損傷內皮細胞對平滑肌細胞增殖的促進作用 實驗分為五組：對照組（正常內皮細胞與平滑肌細胞共培養組）、損傷組（即LPC組或損傷共培養模型組，用30 μm的LPC損傷內皮細胞再與平滑肌細胞共培養）、TLR4激動劑組（即LPS組，內皮細胞提前與LPS進行預孵育，再進行損傷共培養模型的建立）、TLR4抑制劑組（即CLI095組，內皮細胞提前與CLI095進行預孵育，再進行損傷共培養模型的建立）和DFMG組（內皮細胞提前與DFMG進行預孵育，再進行損傷共培養模型的建立）。采用CCK-8法測量以上各組中平滑肌細胞的增殖，結果如圖所示（圖4）。由結果可知，與對照組相比，損傷組和LPS組的平滑肌細胞增殖能力增強；與損傷組相比，CLI095組和DFMG組的平滑肌細胞的增殖能力減弱。

2.5 DFMG通過TLR4抑制損傷內皮細胞對平滑肌細胞遷移的促進作用 實驗分組如下（同3.4）：對照組、損傷（LPC）組、TLR4激動劑（LPS）組、TLR4抑制劑（CLI095）組和DFMG組，采用結晶紫染色計數遷移的平滑肌細胞，結果如圖所示（圖5）。由結果可知，與對照組相比，損傷組和LPS組的平滑肌細胞的遷移能力增強；與損傷組相比，CLI095組和DFMG組的平滑肌細胞的遷移能力減弱。

圖4 DFMG通過TLR4抑制損傷VECs對VSMCs增殖的促進作用

圖5 DFMG通過TLR4抑制損傷VECs對VSMCs遷移的促進作用

3 討論

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）始于血管內皮細胞的損傷。內皮細胞是位于血流與血管平滑肌之間一層表面光滑的細胞。它不但是一道生理屏障，而且能分泌合成多種血管活性物質、細胞因子、趨化因子和粘附因子等，從而調節細胞與血管功能。血管內皮損傷可引起血管壁通透性增加，減少NO、內皮素-1的分泌并促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移以及巨噬細胞活化成為泡沫細胞，最后引起AS［4-6］。所以拮抗內皮細胞損傷對于防止AS十分重要。但內皮細胞并不是參與AS的唯一細胞，血管平滑肌細胞、巨噬細胞等都參與其中。這些因素相互作用，最終導致疾病的發生。其中，內皮細胞和平滑肌細胞又是構成血管壁最主要的細胞成分，兩種細胞間的相互調節、相互影響和相互作用是血管壁自身結構穩定性得以維持的關鍵。因此研究內皮細胞與平滑肌細胞之間的相互作用尤為關鍵。近來興起的Transwell共培養技術使得研究兩種細胞之間的相互作用成為可能。本研究運用Transwell共培養技術建立的損傷內皮細胞-平滑肌細胞的共培養模型，將內皮細胞的損傷設為起始因素，觀察其對平滑肌細胞的作用。結果（圖1和圖2）發現在損傷共培養體系中，平滑肌細胞的增殖能力和遷移能力均增強。

許多研究表明，動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾?。?-10］。而TLR4在AS的炎癥反應和免疫反應中有重要作用。Medzhito V［12］等于1997年首次發現并命名TLR4。Masakazu Shinohara［13］等指出TLRs以固有免疫和適應性免疫的方式參與了動脈粥樣硬化的發生發展，并且起著關鍵的作用。S Gargiulo［7］等指出人和動物的動脈粥樣硬化瘢塊中，TLR4表達增多，并且TLR4的活化能上調多種細胞因子、趨化因子和粘附分子（IL-6，IL-1β，TNF-α，MMP-9等），這些因子和分子參與細胞募集和增殖，進而觸發炎性反應，促進內膜下泡沫細胞集聚。在本研究中，我們用Western Blot和熒光定量PCR驗證了在損傷共培養體系中內皮細胞TLR4的總蛋白與基因表達量增多（圖3）。這些已有的研究成果以及我們的前期抗體芯片的結果均提示TLR4可能成為預防和治療AS的重要靶點。

金雀異黃素（genistein，GEN），化學名為5，7，4’-三羥基異黃酮，是一種來源于豆類植物的異黃酮。已有研究證明金雀異黃素（Genistein，GEN）可通過TLR4及其信號轉導通路抑制動脈粥樣硬化的發生與發展［14，15］。7-二氟甲氧基-5，4’-二甲氧基金雀異黃素（7-difluoromethoxy-5，4’- dimethoxygenistein，DFMG），是本課題組針對GEN的缺點進行改造得到的新型活性化學實體［11，16］。我們的前期試驗證實DFMG具有抗動脈粥樣硬化的作用。但是，在內皮細胞與平滑肌細胞共同存在的情況下，DFMG的作用及其機制還不十分明確。本研究通過建立損傷內皮細胞-平滑肌細胞共

培養體系，模擬DFMG對內皮細胞和平滑肌細胞的作用方式，觀察DFMG對損傷共培養體系中平滑肌增生遷移的影響。同時，運用TLR4激動劑（LPS）和TLR4拮抗劑（CLI095）驗證DFMG的作用機制。結果（圖4和圖5）發現，與對照組的平滑肌細胞的增殖和遷移能力相比，損傷組和LPS組的平滑肌細胞的增殖和遷移能力增強；與損傷組的平滑肌細胞的增殖和遷移能力相比，CLI095組和DFMG組的平滑肌細胞的增殖和遷移能力減弱。也就是說，損傷的內皮細胞和TLR4激動劑（LPS）刺激的內皮細胞均能引起平滑肌細胞的增殖和遷移能力增強，而DFMG和TLR4拮抗劑（CLI095）的處理后的內皮細胞均能抑制損傷共培養模型中平滑肌細胞的增殖。一方面表明DFMG能抑制損傷共培養體系中平滑肌細胞的增殖和遷移；另一方面揭示了DFMG的這一抑制作用可能跟TLR4信號密切相關。但是在損傷共培養體系中，DFMG是如何發揮作用的，還有賴于更多的直接實驗進行證實。本研究為進一步探討DFMG 拮抗內皮細胞與平滑肌細胞的相互作用機制提供了理論和實驗基礎。

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DFMG Inhibited Proliferation and Migration of Smooth Muscle Cells Stimulated by LPCInduced Injured Endothelial Cells through Depressing TLR4

Huang He， Zhang Yong， Yang Shu-ting， Fu Xiao-hua
（Department of Cardiovascular disease， Medicine College， Hunan Normal University， Changsha 410006， China）

Objective To observe the effect of 7-Difluoromethyl-5，4’-dimethoxygenistein （DFMG） on the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells（VSMCs） stimulated by LPC-induced injured vascular endothelial cells（VECs），and whether the intervention process of DFMG is related to the TLR4. Methods The proliferation and migration of VSMCs was detected by CCK-8 assay and Transwell-migration method. The TLR4 protein and gene expression of VECs was detected by western blot and fluorescence quantitative PCR. Using TLR4 specific agonist （LPS） and specific inhibitor （CLI095）， the proliferation and migration ability of VSMCs was analysed by CCK-8 assay and Transwell-migration method. Results The injured VECs induced by LPC caused the proliferation and migration of VSMCs， and VSMCs cocultured with VECs induced by 30 μM LPC became the injured coculture model of the following experiment. TLR4 protein expression of the injured VECs in the injured coculture model was 2.3 times as much as that of the normal VECs in the normal coculture model； TLR4 gene expression of the injured VECs in the injured coculture model was 2.4 times as much as that of the normal VECs in the normal coculture model. The proliferation and migration capacity of the injured group and the agonist group were stronger than that of the normal group. In addition， the proliferation and migration capacity of the inhibitor group and the DFMG-treated group were weaker than that of the injured group. Conclusion The injured VECs induced by LPC caused the proliferation and migration of VSMCs， and DFMG inhibited proliferation and migration of VSMCs in the LPC-induced injured VECs-VSMCs cocultured model by depressing TLR4.

TLR4； DFMG； VECs； VSMCs； Proliferation； Migration； Co-culture

R363

A

1673-016X（2016）01-0001-05

2015-11-13

國家自然科學基金資助項目（81370382）；湖南省自然科學基金項目（14JJ2059）

符曉華，E-mail：fuxh1@126.com