甘蔗根系內生真菌

廖楠，張金蓮，汪茜，譚裕模，龍艷艷，李冬萍，陸祖軍，陳廷速*

甘蔗根系內生真菌

廖楠1，3，張金蓮1，汪茜1，譚裕模2，龍艷艷1，李冬萍1，陸祖軍3，陳廷速1*

（1.廣西農業科學院微生物研究所，南寧530007；2.廣西農業科學院農業資源與環境研究所，南寧530007；3.廣西師范大學生命科學學院，桂林541004）

在酸性赤紅壤條件下，通過對大田甘蔗施用不同的化肥量和接種AM菌劑的試驗，分析不同施肥水平對甘蔗根系內生真菌的影響。結果表明：甘蔗根系內同時存在兩種內生真菌，即叢枝菌根（AM）真菌和深色有隔內生真菌（DSE）。通過對甘蔗根系進行染色觀察后發現，凡是施復合肥的處理，在甘蔗根系中除了存在叢枝菌根（AM）真菌，還檢測到較多的深色有隔內生真菌（DSE）的菌絲和微菌核。大田甘蔗施用AM菌劑影響土著AM真菌種群。

甘蔗根系；內生真菌；叢枝菌根真菌；深色有隔內生真菌

我國甘蔗種植區經過長期濫用化肥、農藥和除草劑，土壤退化非常嚴重。許多蔗區土壤貧瘠，種植條件惡化[1]。蔗田土壤養分嚴重失衡，已無法通過增加施肥來提高產量，成為制約目前甘蔗產業持續發展的重要因素。叢枝菌根（arbuscularmycorrhizal，AM）是自然界中最普遍的一種菌根類型，它們能夠促進宿主植物對土壤養分的吸收和利用，增強抗逆性，提高作物產量。甘蔗根際土壤AM真菌資源豐富[2]，AM真菌被譽為“生物化肥”，它不僅能提高土壤pH值，而且增加甘蔗的株高和有效莖數，提高甘蔗產量[3]。深色有隔內生真菌（dark septate endophytes，DSE）也是一類定殖于植物根內的小型土壤真菌，生態學功能與AM真菌類似，在植物的生長過程中發揮著重要作用。因此，研究甘蔗根系內生真菌，利用它們來改善甘蔗土壤生態，提高甘蔗抗逆性和化肥利用率具有重要的應用價值。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試甘蔗品種:新臺糖22號。所用的叢枝菌根真菌菌株為Rhizophagus aggregatus（原聚叢球囊霉），為本課題組分離自甘蔗根際土壤。采用河沙為主要培養基質，以玉米為宿主植物，接種R.aggregatus，生長期間每周噴淋濃度為25%～50%的Hoagland營養液，培養4個月后，將孢子、宿主根系和培養基質一起作為接種物（AM菌劑）。

1.2試驗設計

2013—2014連續兩年分別在廣西隆安縣的國家甘蔗產業技術體系甘蔗試驗基地實施。共設6個處理：A.AM；B.AM+50%復合肥（375 kg/hm2，下同）；C.AM+復合肥（750 kg/hm2，下同）；D.空白對照；E.50%復合肥；F.復合肥。施用AM菌劑（3個處理）與不施AM菌劑（3個處理）之間，設立隔離區30m。每個處理3個小區，采用拉丁方設計。每個小區面積7m×5.5m。其中行距1.1m，共5行。每行7m，下種量50個雙芽苗，共100個芽。復合肥比例為N∶P∶K=15∶5∶15（拉多美復混肥料，廣東拉多美化肥有限公司）。

1.3檢測

1.3.1內生真菌侵染檢測將甘蔗根樣置于20%的KOH溶液中90℃水浴透明90 min～120 min；用清水沖洗3～5次后，加入堿性H2O2（10%H2O210mL，氨水1 mL，蒸餾水189 mL）脫色60 min；用5%的乙酸酸化5 min后，用5%的墨水醋染液（Quink牌純黑墨水）為染液，66℃染色30 min，用清水（至少12 h以上）脫色后即可鏡檢。

1.3.2甘蔗根際土壤AM真菌孢子的檢測孢子的分離采用濕篩傾注-蔗糖離心法，稱取20g土樣放入攪拌機內并加入600mL水，快速攪拌旋轉3～5s，使土塊或根系中的孢子充分散落，靜置1～2s后通過3層不同孔徑（從上往下孔徑依次為：0.8mm，0.25mm，0.055mm）的土壤標準篩即可篩取出孢子，轉置表面皿上，用體視顯微鏡觀察孢子形態，測定孢子密度。每個處理重復3次。

2　結果與分析

2.1甘蔗根系內生真菌

不同處理的甘蔗根系侵染結果如圖1。在甘蔗根系中，除了叢枝菌根真菌，還存在深色有隔真菌（DSE）。DSE的主要特點是菌絲為有隔菌絲，存在微菌核結構。在6個不同的處理中，處理B和C的小區AM真菌的菌絲和泡囊結構較為豐富。此外，在施用復合肥的小區（B，C，E，F）中，DSE的微菌核結構出現頻率較高。AM真菌和DSE可同時存在同一甘蔗根系中，它們之間是否存在相關性（是協同還是拮抗）？有待進一步研究。

圖1　不同施肥水平甘蔗根系內生真菌（AM真菌及DSE真菌）Fig.1 The endophytic(AMF and DSE)in roo ts of sugarcane w ith diffe rent treatm ents

2.2甘蔗根際土壤AM真菌種群結構

對不同處理的甘蔗根際土壤進行AM真菌種群分析。所進行試驗的地塊存在5種不同類型的AM真菌（包括接種的AM菌株）：R.Aggregatus、Acaulospora.sp.1、蜜色無梗囊霉（A.mellea）、地表球囊霉（G. versiforme）和G.sp.5。A、B、C均施用了AM菌劑，土壤中檢測不到G.sp.5，但存在A.sp.1和G.versiforme。此外，在施復合肥的處理中，不管是否施用AM菌劑，都沒有檢測到A.mellea。說明大田甘蔗施用AM菌劑和化肥，影響了甘蔗根際土壤AM種群結構。不同菌株的形態特征如下：

2.2.1A.sp.1的形態特征孢子果未知，孢子椒紅至棕紅色，近球形或橢圓形，50.57～109.00×66.28～147 μm，表面常有無色或淺黃色覆蓋物。孢子壁一層，層狀，外層顏色深，內層棕黃色，壁上常有不規則淺溝和近圓形坑洞，坑洞縱向貫串孢子壁，而淺溝僅在外表面。

2.2.2蜜色無梗囊霉（A.mellea）的形態特征孢子：土壤中單生，側生于產孢子囊菌絲上，淺棕黃色至棕黃色，球形或近球形，有時橢圓形，直徑105～130×142～162μm。孢子壁3層（L1、L2和L3）：L1，易逝壁，無色，厚＜0.5μm，緊貼于L2，在Melzer’s試劑中呈淺黃色；L2，層狀壁，淺黃色至棕黃色，厚3.0～4.8μm，L1消解后表面光滑；L3，膜狀，無色，厚小于1μm。芽壁兩層（GW1，GW2）：GW 1，膜狀，無色，兩層（GWl-L1和GWl-L2），厚約1μm，孢子破裂后易皺。GW 2，兩層（GW 2-L1和GW 2-L2），GW 2-L1，厚約1μm，表面有珠狀紋飾，在Melzer’s試劑中呈淺黃色，GW2-L2，具可塑性，在Melzer’s中染成絳紫色。脫落痕，圓形至橢圓形，直徑8～11μm。

2.2.3聚叢球囊霉（R.Aggregatus）的形態特征孢子：淺灰色、淺黃色至淺棕色，在土壤中叢生或單生，球形或近球形，（30～45）～70μm，或橢圓至不規則形（30～72）×（42～100）μm。孢子壁：一層或兩層，（1.5）～（2.5～3）μm；如果兩層，外層較厚，淺黃色，層狀壁；內壁比外壁薄，亮黃色，輕壓則內外壁可分。連孢菌絲在連點處寬2.5～9μm，連點開放或由細隔封閉，直立或在接近連點處突然彎曲。內含物油滴狀，白色或淡銀灰色。

2.2.4地表球囊霉（G.versiforme）的形態特征孢子：土壤中單生，孢子果未知，孢子球形或近球形，黃至黃棕色，顯微鏡下沿孢壁有一圈深色，大小82～136μm。孢壁3層，L1無色透明易逝壁，約1μm，成熟時常脫落或只剩部分殘屑；L2淺黃至黃棕色層狀壁，厚2～4μm，厚度較均勻；L3單一壁，約1μm，不易與L2分離，亮金黃色。連孢菌絲：無色透明，寬4.3～6.8μm，成熟孢子中常萎縮或脫落。連點寬7.6～12.0μm，直或小喇叭形，開放或由一內壁形成的隔封閉。內含物油滴狀。

2.2.5G.sp.5的形態特征孢子果未知，孢子深棕紅色，近球形，直徑約110μm。孢子壁一層，層狀，厚7.8～8.0μm，至連點處增厚至9.45μm，壁上有縱向裂紋，外層顏色較深，暗棕紅色；內層棕黃色，表面飾有高4.42～6.09μm、基部直徑2.54～4.37μm乳狀突起。連點開放，寬19.10μm。

3　討論

AM真菌是自然界分布最為廣泛的一種植物根系內生菌根真菌，能與絕大多數植物根系形成穩定的共生結構。深色有隔內生真菌（DSE）也是一類定殖于植物根系的小型真菌，其一般特征是菌絲顏色較深、具明顯橫隔，廣泛存在于健康植物根的表皮、皮層甚至維管束組織的細胞內或細胞間隙，能夠在植物細胞內或細胞間隙形成“微菌核（microsclerotia）”。普遍存在于重金屬污染、寒冷或干旱等極端環境中[4]。本研究還發現，施復合肥處理的甘蔗根系能被DSE高度侵染，并能形成有隔菌絲、微菌核。這可能與所種植的地塊土壤理化性質相關。所種植的地塊為強酸性赤紅壤，其pH僅為4.02。種植后期，僅施有AM菌劑的處理A的pH為5.03，而空白對照（D）的pH為4.49。施有AM菌劑且施復合肥的B和C，其pH分別為4.43和4.33，而僅僅施復合肥的E和F，其pH分別為4.06和4.22。在甘蔗根系的內生真菌檢測中，在施用復合肥的小區（B、C、E，F）中，DSE的微菌核結構出現頻率較高，也許與土壤pH過低相關。

關于DSE與AM真菌的相關性。有的研究認為AM定殖結構和DSE存在負相關[5]，也有研究認為DSE有隔菌絲和總定殖率與AM定殖率存在顯著正相關，DSE和AM真菌之間可能存在協同共棲關系，兩者相互協調平衡，相輔相成，共同促進根系吸收土壤礦物元素和水分[6]。有的研究認為DSE的分泌物對AM菌絲的生長具有一定的調節輔助作用[7]。在本研究中，雖然在施用復合肥的處理（B、C、E、F）中，DSE的微菌核結構出現頻率較高，但E和F的微菌核結構要多于施用AM菌劑的處理B和C。施用AM菌劑的處理（A、B、C），其根系內AM泡囊、菌絲和菌絲圈多于對照（D、E、F）。但具體如何影響，有待進一步探討。

甘蔗是旱地連作作物，利用根系內生真菌來改善退化的土壤生態，減少化肥用量都具有很好的應用前景。近年來，我們所開展的AM菌劑在大田甘蔗的應用試驗結果表明，在施用AM菌劑后，能促進甘蔗植株生長，增加有效莖數，提高甘蔗產量。在一些試驗地塊，即使復合肥減少50%，產量并沒有受到影響[3，8-9]。我們國家農業土壤退化嚴重，國家農業部提出了下一個五年計劃的化肥零增長，提高化肥利用率40%以上的目標。利用作物根系內生真菌是很好的選擇。它們不僅能促進植物生長，提高抗逆性，還能降低化肥的施用量，減少化肥對生態環境的污染，促進我國生態農業的可持續發展。

[1]黃紹富，黃杰基.蔗區土壤肥力現狀與甘蔗測土配方施肥[J].廣西蔗糖，2006（4）：10-13.

[2]陳廷速，張金蓮，李松，等.廣西東南沿海蔗區根際土壤AM真菌多樣性研究[J].南方農業學報，2012（1）：57-61.

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[6]張娟，賀學禮，王曉乾，等.干旱環境下羊柴DSE與AM真菌和土壤因子關系研究[J].河北農業大學學報，2015，38（1）：72-77.

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The Endophytic Fungus in Sugarcane Root

LIAO Nan1,3,ZHANG Jin-lian1,WANG Qian1,TAN Yu-mo2,LONG Yan-yan1, LIDong-ping1,LU Zu-jun3,CHEN Ting-su1*
(1.Micobiology Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;2.Resourses and Environment Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;3.College of Life Science,GuangxiNormal University,Guilin 541004,China)

To investigate the influence of fertilizer on endophytic fungus of sugarcane root in acid red soil, sugarcane plants were grown on different level of fertilizer and inoculated with arbuscular mycorrhizal fungus (AMF).The results showed that there are two kinds of endophytic fungus in sugarcane root,the arbuscular mycorrhizal(AM)fungus and dark septate endophytes(DSE).Through the dyeing observation of the root sugarcane,more septate hypha and microsclerotia of DSE were found besides AM fungus in the soil applied complex fertilizer than the others.The communities of soil AMF were affected by AMF inoculants.

sugarcane root;endophytic fungus;arbuscularmycorrhizal fungus;dark septate endophytes

S435.661

A

1007－2624（2016）03－0006－04

10.13570/j.cnki.scc.2016.03.002

2015-10-10

國家自然科學基金項目（31360356）；國家甘蔗產業技術體系（CARS-20-3-5）；廣西農業科學院科技項目（2014YP06，2015YT81，2015YZ10）。

廖楠（1991-），女，碩士研究生，研究方向：土壤AM真菌多樣性。E-mail：454749513@qq.com。

陳廷速（1966-），男，博士，研究員，研究方向：甘蔗根系內生真菌資源。E-mail：chen20409@hotmail.com。