銅尾礦優勢先鋒植物根際聯合固氮特性

陳宣文　危志鋒　林銳

摘要：為了探明尾礦先鋒植物的根際聯合固氮特性，對安徽銅陵林沖新棄置銅尾礦主要優勢先鋒植物香蒲（濕生）、白茅（旱生）根際聯合固氮特性進行系統性研究。研究結果表明：香蒲、白茅根際土柱固氮活性分別為32.43、19.27 μmol/（m2·h），二者差異明顯。分析2種植物根系和根際土固氮活性發現，香蒲根系和根際土的固氮活性大于白茅，表明植物根際聯合固氮活性與植物種類有關。尾礦先鋒植物不同部位固氮活性排序為：根系>根際土>根外土>空白，表明植物根系是植物重要的固氮部位。從尾礦不同樣品中共分離12株具有固氮活性的菌株，固氮活性在7.15～3 416.98 nmol/（mL·h）之間。對其中2株高活性的菌株ATWG5、ATWG9進行16S r DNA 序列分析，結果表明ATWG5號菌株與Azorhizobium caulinodans親源關系最近，相似性達到100%，ATWG9號菌株與Klebsiella oxytoca親源關系最近，相似性達到98.75%。

關鍵詞：銅尾礦；先鋒植物；根際聯合固氮；固氮活性；香蒲；白茅

中圖分類號： X171.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0488-04

尾礦是經礦石粉碎、浮選后余下的微粒狀固體，絕大多數尾礦被堆置在尾礦庫內，丟棄后的尾礦庫形成了尾礦廢棄地，這不僅占有和破壞大量土地，還給周邊地區帶來諸如空氣、水污染，生態系統退化，農作物產量、品質降低等一系列問題[1]。

植被恢復是治理尾礦污染的一種較為理想的方法[2-3]，但尾礦所具有的如物理結構性差、異常貧瘠（如有機質、氮素含量幾乎為零）、極端pH值、重金屬濃度過高等特性，對植被恢復極為不利。盡管如此，隨著棄置年限的增加，尾礦原生環境中先鋒植物開始定居。實地考察發現，林沖尾礦未復墾廢棄地先鋒植物以非豆科植物為主，表明尾礦極端生境中非豆科植物先鋒植物生長過程中具有穩定而可靠的氮源，認為這些氮源主要來自先鋒植物根際聯合固氮[4]。

聯合固氮是自由生活的固氮菌定植于植物根表細胞和根際土壤中形成的特殊固氮作用。當固氮微生物定植在植物根際，并與之形成一種松散的聯合固氮狀態時，植物根系就為其提供良好的固氮環境，與自生固氮相比表現出更高的固氮效率[5]。研究表明，聯合固氮菌通過固氮作用除了為宿主植物提供氮素營養之外，還可以通過分泌植物生長激素類物質等多種途徑促植物生長[6]。目前，有關根際聯合固氮的認識，主要關于普通環境及生長在普通環境的植物上，而關于尾礦極端生境的先鋒植物根際聯合固氮的信息明顯缺乏。

本研究通過對安徽銅陵林沖新棄置的銅尾礦2種具有代表性的優勢先鋒植物香蒲（濕生）、白茅（旱生）根際聯合固氮活性的分析，可為明確銅尾礦生態系統氮素的積累和植被的生態恢復提供基礎數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

2014年7月，于安徽省鳳凰山林沖新棄置未復墾尾礦，采集尾礦裸露地（空白）、結皮、香蒲、白茅根際土柱，同時采集香蒲、白茅根、根外土（距離根部較遠，根系沒有影響的地方）及空白（未生長植被的裸露地），裝入自封采樣袋中帶回實驗室于4 ℃冰箱中保存，待測。

1.1.1 土柱取樣 用直徑為4.8 cm、長度為12 cm的PVC管子套住植物，從上到下打入土中，上部留有1 cm左右的間隙，用鏟子將土柱完整鏟出，放入自封袋中帶回實驗室待測。

1.1.2 土柱處理 將取回的土柱放入體積約為450 mL、帶有換氣孔的玻璃瓶中，用50 mL注射器通過橡皮塞抽出 35 mL 的氣體（約為放入樣品之后剩余體積的10%），同時充入同體積的純C2H2氣體。培養36 h后用氣相色譜儀測量C2H4的生成量。每個樣品重復3次。

1.1.3 根系、根際土、根外土和空白處理 將植物的根系（完全去除根表面土壤）、根際土（根表面5 mm內土壤）、根外土（距根系較遠，根系影響不到的地方）與空白對照放入體積約為35 mL試管中，用膠塞封閉試管口，用5 mL注射器通過橡皮塞抽出2 mL氣體（約為放入樣品之后剩余體積的10%），同時充入同體積的純C2H2氣體，每個樣品做3個重復。培養24 h后用氣相色譜儀測量C2H4濃度，并換算成1 g樣品1 h內乙烯生成量。

1.2 培養基

Dobereiner改良無氮培養基配方：蔗糖5.0 g、甘露醇5.0 g、蘋果酸5.0 g、乳酸鈉0.5 mL、K2HPO4·H2O 0.1 g、KH2PO4·H2O 0.4 g、NaCl 0.1 g、FeCl3 0.01 g、NaMoO4 0.002 g、MgSO4·7H2O 0.2 g（單獨滅菌）、CaCl2·2H2O 0.02 g（單獨滅菌），用蒸餾水補足至1 000 mL，調節pH值至7.0±0.2。

1.3 固氮菌的分離與測定

分別準確稱取10 g香蒲、白茅的根系（表面帶有土壤）于無菌研缽中，加無菌水研磨成糊狀，轉移定容至100 mL；繼續稀釋制成系列稀釋樣品，空白土壤直接梯度稀釋，分別從10-4、10-5稀釋液中取0.1 mL均勻涂布在Dobereiner改良無氮培養基平板上，28 ℃倒置培養，2 d后計數。挑取單菌落劃線純化后，保存。

分離得到的菌株用乙炔還原法確定其是否具有固氮活性，具體操作將分離得到的菌株接種到裝有5 mL Dobereiner改良無氮培養基的試管斜面中培養1 d后，將試管剩余空間的10%置換為C2H2（約為2 mL）后換上膠塞封閉試管口，于 28 ℃ 培養1 d后，用氣相色譜儀測定其固氮活性。

1.4 測定方法

1.4.1 固氮活性測定方法 采用乙炔還原法測定聯合固氮活性[7]。采用Agilent GC7890A氣相色譜儀，檢測器為FID檢測器，毛細管柱子型號：PLOT SILICAPLOT 30×32；測定樣品[用1 mL試管抽取0.5 mL氣體和標氣（乙烯標氣濃度為49 mg/L]中C2H4的峰面積。

計算樣品固氮活性公式：

NA=A1A2×C×V×122.4×1t×1S×273273+T×P760。

式中：NA為C2H4氣體的生成速率，mmol/（m2·h）；A1為樣品中C2H4的峰面積；A2為標氣中C2H4的峰面積；C為C2H4標氣的濃度；V為培養起的體積，L；t為培養時間；S為樣品的垂直投影面積，m2；T為向培養器中注入C2H2氣體時的環境溫度，℃；P為向培養器中注入C2H2氣體時的大氣壓，mmHg。

1.4.2 理化性狀測定 pH值、尾礦土壤全氮含量、有效磷含量、有效鉀含量按《土壤理化分析》中描述的方法[8]測定。全銅含量采用國家標準分析方法[9]測定。

腐殖質碳含量的測定：由于銅礦尾礦中含有大量金屬硫化物（即S2-），不能用重鉻酸鉀法直接測定，而改用焦磷酸鈉-氫氧化鈉浸提重鉻酸鉀法測定[7]腐殖質含碳量。

1.4.3 總DNA提取 使用天根生化科技（北京）有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒（目錄號DP302-02）對固氮菌基因組DNA進行提取，最后用TE緩沖液溶解DNA至濃度為50～100 ng/μL，于-20 ℃保存。

1.4.4 16S rDNA序列測定及分析 使用細菌16S rDNA的通用引物27F、1492R進行PCR擴增。引物序列：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系為50 μL，組成：32.75 μL滅菌超純水，5 μL 10×buffer，5 μL BSA，4 μL dNTP，27F、1492R引物各1 μL，0.25 μL rTaq酶，1 μL DNA模板。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，64 ℃ 1 min，-0.5 ℃/循環，72 ℃ 1 min，32個循環；72 ℃ 20 min。

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，確定目的條帶單一，即送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。使用EzTaxon server 2.1基因庫對測序序列進行比對，并下載相近的序列；然后使用CLUSTAL X軟件進行對比分析[10]；最后用MEGA version 4.1[11]將測序得到的序列和基因庫已知的相近序列，以Kimura 2-Parameter為模型，采用鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 理化性狀

尾礦土壤理化性質：pH值7.9，銅含量1 675.53 mg/kg，鉻含量79.93 mg/kg，鉛含量476.71 mg/kg，全氮含量 0.28 mg/kg，速效磷含量0.48 mg/kg，速效鉀含量 49.98 mg/kg，腐殖質碳含量0.73 mg/kg。尾礦土壤中銅含量為1 675.53 mg/kg，嚴重超出400 mg/kg 的GB 15618—1995《土壤環境質量標準》三級標準，這與鳳凰山的林沖尾礦庫的礦砂主要來自銅礦有關。尾礦裸露地土壤的全氮含量為 0.28 mg/kg，而當土壤全氮含量在0.03%～0.08%范圍內，就很難滿足植物正常生長的需求。植被的枯枝落葉是土壤有機質的主要來源，尾礦土壤腐殖質碳含量主要與尾礦表層上的植被狀況有關，導致裸露地的腐殖質炭含量較低，僅為 073 mg/kg。表明尾礦土壤環境惡劣，不利于植物的定居生長。

2.2 固氮活性

2.2.1 土柱固氮活性 用乙炔還原法測定香蒲、白茅根際土柱，空白、結皮土柱（尾礦不同部位土柱）的固氮活性，測定結果見圖1。

由圖1可見，尾礦廢棄地不同部位土柱都具有一定的固氮活性，固氮活性范圍在0.09～32.43 μmol/（m2·h），不同樣品有明顯差異。香蒲、白茅根際土柱固氮活性遠遠大于結皮 1.30 μmol/（m2·h） 和空白0.09 μmol/（m2·h）。2種植物白茅、香蒲的根際土柱固氮活性相差很大，濕生植物香蒲的固氮活性可以達到32.43 μmol/（m2·h），而陸生植物白茅僅有19.27 μmol/（m2·h），表明濕生地更有利于植物根際聯合固氮作用。在結皮和空白土柱樣品中也測到固氮活性，但明顯低于植物根際固氮活性。認為在尾礦環境中存在可以自由固氮的微生物。尾礦結皮固氮活性低于沙漠生物結皮的固氮活性[12]，與尾礦理化性質比沙漠更加惡劣有關。有研究表明，固氮活性受水分的影響[12]，在一定水分范圍內，固氮活性隨著水分的增加而增高，本研究結果也表現出相同趨勢（圖2）。

2.2.2 根際不同部位固氮活性 為了進一步確定植物聯合固氮活性的差異，用乙炔還原法測定植物根際不同部位（根系、根際土、根外土）的固氮活性的大小，測定結果見圖3。

由圖3可見，香蒲、白茅根際不同部位固氮活性都有相同變化趨勢，即根系>根際土>根外土，這可能與不同部位有機

物含量有關，即有機物含量極度貧乏的尾礦原生環境中，有機物含量越高，固氮活性就越高，反之亦然。尾礦中有機物主要來源植物根系分泌物、根系老化組織的脫落物[13]，含量分布以根系為中心向外依次降低，這種變化趨勢與植物根際不同部位固氮活性變化趨勢相一致。香蒲根系和根際土的固氮活性均大于白茅，表明尾礦植被固氮活性與植物種類有關。植物生長發育過程中不斷地向根際土壤釋放有機物（如根系分泌物、表皮脫落物、根系死亡殘體等），不同種類植物及不同生育進程，植物向根際釋放的有機物化學組分及總量會不盡相同，這決定了根際微生物的選擇性分布，也就是說不同植物種類及其生育進程可以影響根際聯合固氮。香蒲和白茅的土柱固氮活性也反映這一點。

2.3 固氮菌數量

針對香蒲、白茅根際及未生長植物的裸露土壤（空白）進行固氮菌的分離，分離結果見圖4。尾礦裸露土壤、白茅根際和香蒲根際都能分離到固氮菌，數量在8.42×105～2.27×106個/g干質量之間。香蒲、白茅的固氮菌的數量（×106數量級）略高于空白樣品中的固氮菌的數量（×105數量級）。這與植物根際有機物濃度高于空白有關。尾礦固氮微生物數量遠遠低于正常土壤微生物數量（×108數量級）[14]，表明尾礦極端生境不利于微生物的生長。香蒲、白茅的固氮活性卻相差很大，香蒲、白茅根際固氮菌的數量相差不大（×106數量級），至少表明可分離的固氮菌數量不是影響根際聯合固氮活性的主要因素。

2.4 固氮菌菌株種類及固氮活性

對分離得到的21株菌株用乙炔還原法測定其固氮活性。結果共得到12株具有固氮活性的菌株，分析結果見表1。ATWG1、ATWG2、ATWG3號3株菌株在所有樣品中都存在，具有普遍性。而ATWG8、ATWG9號2株菌株只在香蒲樣品中存在，ATWG5號菌株只在白茅樣品中存在，具有專一性。12株

菌株固氮活性在7.15～3 416.98 nmol/（mL·h），不同菌株的固氮活性差異很大。固氮活性最高和最低之間相差了近478倍。從白茅樣品中分離的ATWG5號菌株、香蒲中分離的 ATWG9 號菌株固氮活性遠高于何福恒等從水稻、玉米、甘蔗根際分離獲得的固氮菌活性[分別為2～819、880～894、299～934 nmol/（mL·h）][15]，也高于田宏等從草坪草根際分離的固氮菌活性[37.78～180.20 nmol/（mL·h）][16]、田穎等從小麥根際分離的固氮菌活性[30.14～100.77 nmol/（mL·h）][17]，表明白茅根際分離得到的ATWG5號固氮菌株、香蒲根際分離得到的ATWG9號固氮菌株具有較高固氮活性。尾礦先鋒植物根際聯合固氮，歸根到底是根際固氮菌與其周圍環境共同作用的結果，固氮菌是內因。固氮菌活性的大小可以影響植物根際聯合固氮能力的大小。從香蒲樣品中分離得到1株高固氮活性的菌株也說明了這點。

對菌株的固氮活性用SPSS 19.0進行統計分析，可以得出ATWG1、ATWG5、ATWG8、ATWG9、ATWG10 5種菌株固氮活性差異顯著。

2.5 系統發育樹構建

對具有高固氮活性的2株菌株ATWG5、ATWG9進行總DNA提取、PCR擴增，將擴增得到的產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，用EzTaxon server 2.1基因庫對測序序列進行比對，并下載相近的序列，構建系統發育樹。

在EzTaxon server 2.1基因庫選取與ATWG5號菌株同源性最近的3株菌株序列構建系統發育樹（圖5），從圖5可以看出，ATWG5號菌株與Azorhizobium caulinodans親源關系最近，16S rDNA序列同源性為100%。研究發現，Azorhizobium caulinodans與長喙田菁（Sesbania rostrata）共生，既可以形成根瘤，又可以形成莖瘤，具有較高的固氮活性[18]。

在EzTaxon server 2.1基因庫選取與ATWG9號菌株同源性最近的4株菌株序列構建系統發育樹（圖6）。從圖6可以看出，ATWG9號菌株雖然單獨為1支，但是與Klebsiella oxytoca親源關系最近，16S rDNA序列同源性為98.75%。李樹品等從小麥根系分離得到產酸克雷伯菌，并通過乙炔還原法證明其具有高固氮活性[19]。

3 結論與討論

林沖尾礦不同部位都具有生物固氮活性，固氮活性大小為香蒲>白茅>結皮>空白，尾礦不同部位的固氮作用，有效提高了銅尾礦表層基質的總氮含量，有利于后期植物生長。尾礦先鋒植物不同部位固氮活性大小為根系>根際土>根外土，表明植物根系是植物重要的固氮部位，根際的生物固氮，對尾礦的先鋒植物固氮有效性最直接。

從植物根際分離得到的固氮菌數量明顯高于裸露土壤，但小于正常土壤的微生物含量。從尾礦不同部位樣品中共分離12株具有固氮活性的菌株，固氮活性范圍在7.15～3 416.98 nmol/（mL·h）；植物種類影響了固氮菌的選擇性分布，這些固氮菌固氮直接參與植物的聯合固氮作用，進而影響植物聯合固氮活性。

針對2株高活性菌株進行16S rDNA測序比對表明，ATWG5 號菌株與Azorhizobium caulinodans親緣關系最近，相似性達到100%，ATWG9號菌株與Klebsiella oxytoca親源關系最近，相似性達到98.75%。

在氮素極其匱乏的尾礦極端環境中，優勢先鋒植物主要是非豆科植物，這些先鋒植物并不能進行類似豆科植物共生固氮作用，只能進行聯合固氮作用，為植物提供生長所必需的氮素。而植物聯合固氮作用歸根到底是聯合固氮微生物的作用，固氮微生物與宿主植物有密切關系。有研究表明，不同聯合固氮菌的固氮活性有明顯差異，相差幾十倍甚至更多[20]，本研究結果也證明了這點。在本研究中，可以得出尾礦先鋒植物的固氮活性不同，根際固氮微生物的數量不盡相同；同時也得出不同植物根際固氮微生物的種類也不盡相同，不同固氮微生物的固氮活性差異很大。固氮微生物這種數量活性的差異共同影響了植物的聯合固氮作用。然而，關于固氮微生物對宿主植物聯合固氮活性的影響機理還須進一步研究。

在尾礦自然條件下，先鋒植物存在聯合固氮菌株，但是相對于龐大的根際微生物來說其種群數量較少，與其他微生物競爭力有限，固氮量甚微[21]。對于尾礦生態修復，可以將來源于尾礦先鋒植物根際的高效固氮菌進行擴大培養，以接種劑的形式施入先鋒植物根際，提高根際固氮菌種群數量，增強群競爭力，增加根際微生物固氮總量。本研究獲得的固氮菌菌株大多數生長速度較快，在土壤中存活定居可能性大，將這些固氮菌株應用于尾礦的生態修復具有良好應用前景。

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